Экспрессия интронной микроРНК MIR-153 при раке предстательной железы

Рак предстательной железы (РПЖ) является одним из самых часто диагностируемых онкологических забо леваний и занимает 1-2 место в структуре заболеваемо сти мужского населения злокачественными новообра зованиями в разных странах [1].

Текущая скрининговая диагностика РПЖ вклю чает пальцевое ректальное исследование (ПРИ) и опре деление уровня простатспецифического антигена (ПСА) [2]. Данные методики широко распространены и являются простыми в применении,однако при этом обладают относительно низкими показателями чув ствительности и специфичности. Так, для ПСА эти по казатели не превышают по разным оценкам 70% и 50% соответственно [3]. А при значении ПСА равном 2-10 нг/мл (серая зона ПСА) специфичность составляет всего 25-45% [4]. Отсутствие более точных малоинва зивных прогностических методик приводит к большому количеству ненужных биопсий предстательной железы.

В практику внедряются новые диагностические методики, такие как оценка индекса PCA3 на основе исследования мочи. Чувствительность и специфичность индекса PCA3 далека от 100% и составляют по разным оценкам 52-82% и 79-89% соответственно [5].

Перспективным направлением развития малоинвазивной диагностики ранних стадий РПЖ является анализ уровня микроРНК. МикроРНК – малые некодирующие молекулы РНК длиной 18-25 нуклеотидов (в среднем 22), принимающие участие в транскрипционной и посттранскипционной регуляции экспрессии генов [6]. Не менее половины микроРНК человека закодировано в интронах так называемых генов-хозяев, многие из них транскрибируются одновременно с геном-хозяином [7]. Известно, что микроРНК, как внутри клетки, так и во внеклеточной среде, полностью экранированы от РНКаз белками-партнерами, принадлежащими к семейству Аргонавтов (AGO1-4), и поэтому обладают высокой стабильностью, в том числе во внеклеточном пространстве [7].

Ряд исследований демонстрируют диагностическую значимость определения микроРНК в моче при РПЖ.При этом микроРНК могут быть диагностическим фактором, увеличивающим чувствительность и специфичность при совместном анализе с другими мар- керами, такими как ПСА и PCA3 [8-10], а комбинации из нескольких микроРНК могут быть самостоятельным маркером и демонстрируют большую чувствительность и специфичность, чем ПСА [11-13]. В то же время ин формация о высокочувствительных микроРНК – мар керах ранних стадий РПЖ в моче практически отсутствует.

Целью настоящего исследования являлся поиск пар ген-хозяин –микроРНК специфичных для ранних ста дий рака предстательной железы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены результаты секве нирования мРНК и микроРНК 184 образцов РПЖ и 50 образцов условно здоровой ткани предстательной железы (табл. 1), полученных консорциумом TCGA Research Network:

Для формирования перечня интронных микроРНК геномные координаты микроРНК из базы miRBase 22.1 ; файл hsa.gff3) были пересечены со списками генов и экзонов аннотированной сборки человеческого генома GRCh38.p12 с помощью программы bedtools intersect версии 2.26.0. Интронными считали микроРНК, соответствующие пре-микроРНК, целиком лежащим в интронах, и направление транскрипции которых совпадало с направлением транскрипции гена-хозяина.

Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов Table 1. Clinical characteristics of patients

Показатель Indicator	Контроль Control	Т2
N	50	184
Возраст, лет Age, years	059,0 ± 7,89	59,5 ± 7,13
Т
pT2a	0	0
pT2b	0	7,7
pT2c	0	0
N
н.д. / no data	–	42 (22,8%)
pN0	–	139 (75,5%)
pN1	–	3 (1,6%)
M
н.д. / no data	–	14 (7,6%)
cM0	–	170 (92,4%)
Индекс Глиссона / Gleason score
3 + 3	–	31 (16,8%)
3 + 4	–	93 (50,5%)
3 + 5	–	5 (2,7%)
4 + 3	–	32 (17,4%)
4 + 4	–	13 (7,1%)
4 + 5	–	9 (4,9%)
5 + 3	–	1 (0,5%)

Биоинформационный анализ данных осуществ ляли в среде статистических вычислений R. Значимость различий в экспрессии генов и микроРНК оценивали c помощью алгоритма DEseq2 [14]. Анализ представлен ности групп генов (GSEA) осуществляли с помощью пакета программного обеспечения fgsea и базы данных Molecular Signatures Database [15-17]. Анализ промото ров осуществляли с помощью базы данных TransmiR v2.0 [18].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ результатов секвенирования мРНК в об разцах РПЖ Т2х и условно здоровой ткани предста тельной железы выявил 182 дифференциально представленных генов. Анализ представленности групп генов (GSEA) показал, что дифференциально представ ленные в РПЖ гены MYOM3, NEB, KLHL41, MYH3, TCAP, TNNC1, принадлежат к биологическому про цессу «Сократительные волокна» (GO:CONTRAC TILE_FIBER) (табл. 2). При РПЖ экспрессия данных генов подавлена, что может быть связано с ремодели рованием ткани предстательной железы, замещением гладкомышечных клеток опухолевыми [19].

Среди 182 дифференциально представленных при Т2х РПЖ выявлено четыре гена-хозяина пре-мик роРНК: AMH (hsa-mir-4321), MYH6 (hsa-mir-208), MYH7 (hsa-mir-208b), PTPRN (hsa-mir-153-1). После дующий анализ результатов секвенирования мик роРНК в образцах РПЖ показал, что экспрессия только hsa-miR-153-3p значимо различалась между группами сравнения (контроль: 1,1±0,8 log 2 CPM; T2x 2,6±0,9 log2CPM, p = 2.2x10^-16).

Несмотря на то, что микроРНК hsa-miR-153-3p закодирована в 19 интроне гена PTPRN, их экспрессия в парных результатах секвенирования мРНК и мик роРНК не коррелирует, что позволяет предположить наличие у hsa-miR-153-3p собственного промоторного участка и фактора транскрипции. Анализ базы данных TransmiR v2.0 позволил выявить девять факторов транскрипции, способных регулировать экспрессию данной микроРНК: AR, CREB1, CTCF, ERG, ETV1, GABPA, MYC, SUMO2, TRIM24. Последующий анализ коэкспрессии показал значимую положительную кор реляцию экспрессии hsa-miR-153-3p с андрогеновым ре цептором (ген AR, R2 = 0,27, p = 2,7x10-4), являющимся транскрипционным фактором, и U3 убиквитин-про теин лигазой TRIM24 (ген TRIM24, R2 = 0,4, p = 3,5x10-8), транскрипционным кофактором, способным взаимо действовать с AF2 доменом ряда ядерных рецепторов, в том числе и андрогенового рецептора [20].

ОБСУЖДЕНИЕ

В результате анализа результатов секвенирования 184 образцов РПЖ и 50 образцов условно здоровой ткани предстательной железы выявлена пара ген-хо зяин PTPRN и его интронная микроРНК hsa-miR-153-3p, экспрессия которых значимо повышена при РПЖ.

Ген PTPRN кодирует трансмембранную фосфоти розин фосфотазу. Предыдущие исследования показали, что PTPRN выявляется в секреторных гранулах остров ков поджелудочной железы и других нейроэндокрин ных клеток, что, вполне возможно, объясняет его значительную корреляцию с диабетом [21].

В ряде исследований демонстрирована связь между PTPRN и некоторыми онкологическими заболе ваниями. Так, в исследовании G. Zangyuan и соавт. была выявлена отрицательная связь PTPRN с выживае мостью пациентов с гепатоцелюлярным раком [22]. По данным, полученным D. Bauerschlag и соавт., гиперме тилирование PTPRN также связано с более короткой выживаемостью у пациентов с раком яичников [23]. А в исследовании A. Shergalis и соавт. продемонстриро вано, что высокая экспрессия PTPRN при мелкоклеточ ном раке легкого связана с ростом и пролиферацией опухоли. Также ими было обнаружено, что высокая экспрессия PTPRN тесно связана с плохим прогнозом у пациентов с глиобластомами [24].

В исследовании Z. Wu и соавт. при исследовании 105 образцов опухолевой ткани предстательное железы и сравнении их с 28 образцами без атипичных клеток, было установлено, что hsa-miR-153-3p сверхэкспресси руется в ткани с наличием рака предстательной железы. Так же была исследована возможная биологическая функция hsa-miR-153-3p [25].

Таблица 2. Экспрессия генов, принадлежащих к биологическому процессу «Сократительные волокна», в группах сравнения Table 1. Expression of genes belonging to the biological process «Contractile fibers» in the comparison groups

Название гена Gene name	Контроль, log2FPKM Control, log2FPKM	Т2х, log2FPKM	р
MYOM3	0,3±0,7	0,2±0,7	8,9x10-6
NEB	0,7±1,1	0,4±0,8	–
KLHL41	1,2±1,6	0,8±1,2	8,2x10-4
MYH3	1,6±1,4	1,1±1,3	5,3x10-4
TCAP	1,6±1,9	1,1±1,7	0,046
TNNC1	2,3±2,1	1,6±1,8	4,4x10-5

Исследование показало, что избыточная экспрессия hsa-miR-153-3p способствует переходу клеточного цикла и пролиферации клеток, тогда как ингибирование hsa-miR-153-3p снижает этот эффект. Более того, сверхэкспрессия hsa-miR-153-3p в клетках рака предстательной железы увеличивает переходный промотор G1/S, экспрессию циклина D1 и снижает экспрессию ингибитора циклин-зависимой киназы (CDK), p21Cip1. Так же было продемонстрировано, что hsa-miR-153-3p непосредственно нацелена на ген-супрессор опухоли PTEN, активирует AKT киназу и снижает активность транскрипции FOXO1. Эти результаты показывают, что hsa-miR-153-3p играет важную роль в стимулировании пролиферации клеток рака предстательной железы и представляет новый механизм прямого подавления экспрессии PTEN в клетках.

C.W. Bi и соавт. исследовали уровень экспрессии hsa-miR-153-3p в раковой ткани предстательной железы и связь между экспрессией hsa-miR-153-3p, клинико-патологическими факторами и прогнозом пациентов. Экспрессию hsa-miR-153-3p в 143 образцах раковой ткани и прилегающих незлокачественных тканях предстательной железы измеряли с помощью анализа qRT-PCR. Результаты показали, что экспрессия hsa-miR-153-3p была значительно увеличена в раковых тканях предстательной железы по сравнению с прилегающими доброкачественными тканями. Экспрессия hsa-miR-153-3p считалась высокой или низкой в соответствии с пороговым значением,которое определялось как медиана когорты. Чтобы исследовать клиническое значение hsa-miR-153-3p, была оценена связь между экспрессией hsa-miR-153-3p и клиниче- скими патологическими особенностями. Было вы явлено, что высокая экспрессия hsa-miR-153-3p в рако вых тканях предстательной железы тесно коррелировала с агрессивными клиническими патоло гическими параметрами, такими как боле высокая оценка по шкале Глисона, метастазирование в лимфа тические узлы, кости. Пациенты с РПЖ с высокой экс прессией hsa-miR-153-3p имели более низкую 5-летнюю общую выживаемость по сравнению с пациентами с низкой экспрессией hsa-miR-153-3p. Примечательно, что многомерный регрессионный анализ Кокса пока зал, что экспрессия hsa-miR-153-3p была независимым фактором для прогнозирования 5-летней общей выжи ваемости пациентов с РПЖ. Эти данные показали, что hsa-miR-153-3p может быть прогностическим марке ром [26].

В рамках проведенного исследования нами на значительной выборке пациентов продемонстрирована повышенная экспрессия hsa-miR-153-3p в образцах раннего РПЖ, установлена взаимосвязь уровня экс прессии hsa-miR-153-3p, экспрессии андрогенового ре цептора и U3 убиквитин-протеин лигазы TRIM24.

ВЫВОДЫ

МикроРНК hsa-miR-153-3p может рассматри ваться в качестве перспективного маркера ранних ста дий РПЖ. Необходимо изучение уровня hsa-miR-153-3p не только в образцах РПЖ, но и в плазме крови, моче для рассмотрения вопроса ее использовании в качестве малоинвазивного маркера РПЖ.

ЛИТЕ РАТУPA/REFEREN CE S