Экспрессия молекулярных маркеров острого повреждения почек в динамике экспериментальной ишемии

Федеральное государственное бюджетное учреждение

«Ростовский научно-исследовательский онкологический институт»

Минздрава России, Ростов-на-Дону

овершенствование методов диагностики и прогноза развития острого почечного повреждения (ОПП) связывают с определением биологических маркеров, не зависящих от фильтрационной функции почек и связанных с ранней стадией развития патологических изменений [1]. К ним относятся липокалин-2 (neutrophil gelatinase-associated lipocalin - NGAL), интерлейкин-18, молекула почечного повреждения-1 (Na+/H+ обменник типа 3 - NHE-3), ряд ферментов, обычно локализующихся в щеточной кайме проксимальных канальцев, и другие показатели [2].

В настоящее время возрастает значение органосохраняющих операций в онкологической практике, которые предотвращают развитие или замедляют прогрессирование хронических заболеваний почек и, в том числе, почечной недостаточности. Резекция почки в условиях тотальной тепловой ишемии с пережатием почечных сосудов, выполняемая по поводу локализованной формы рака, обеспечивает сопоставимую с нефрэктомией онкологическую выживаемость больных [3]. Время ишемии имеет немаловажное значение в развитии ОПП, с возможным его переходом в хроническую форму [4]. По данным исследований, время тепловой ишемии в ходе резекции почки составляет 14–21 мин [5]. Считается, что независимыми предикторами тепловой ишемии более 20 мин являются опыт хирурга, размер опухоли, ее анатомические характеристики, определенные по шкале PADUA, необходимость восстановления полостной системы органа [6]. Однако время тепловой ишемии более 25 мин приво- дит к развитию тяжелого ОПП оперированной почки с возможным развитием хронической почечной недостаточности [7]. Таким образом, не определен безопасный порог времени тепловой ишемии, так как каждая ее минута вносит свой вклад в развитие ОПП и снижение ее функции [8]. В связи с этим необходимо изучение основных функциональных показателей почки при ее повреждении на этапах ишемии. Неоценимую помощь в этом вопросе может дать экспериментальное исследование.

Целью настоящей работы явилось изучение уровня маркеров ОПП в корковом веществе почек крыс разного возраста и пола в динамике острой ишемии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы 130 белых беспородных крыс обоего пола массой 180-200 г (молодые животные) и 300350 г (старые животные). Моделирование ишемического повреждения проводили на правой почке. После введения животных в наркоз они размещались на операционном столе в положении «на спине». Шерсть на животе удаляли, операционное поле обрабатывали антисептиками (хлоргексидин 0,05% и 70% этанол). Разрез проводили вдоль белой линии живота от мечевидного отростка грудины до лобка, рассекали кожу и подлежащие ткани. Выделяли почечную ножку правой почки, подводили под нее шелковую лигатуру, затягивали простым узлом. Рану на протяжении периода ишемии прикрывали салфеткой, смоченной 0,05% раствором хлоргексидина. Через определенные промежутки времени животных забивали декапитацией, не выводя из наркоза. Для иссле- дования забирали правую (ишемизированную) почку, выделяли корковый слой; 100 мг ткани промывали фосфатносолевым буфером, гомогенизировали в 1 мл буфера и оставляли на ночь при температуре минус 20°C. Для полного разрушения клеточных мембран проводили два цикла замораживания-оттаивания. Полученную суспензию центрифугировали 5 мин при 5000 g (2 – 8°C). Супернатант отбирали, делили на аликвоты и хранили при минус 20°C или минус 80°C. Перед измерением размороженные образцы центрифугировали. Исследование проводили методом имму-ноферментного анализа (ИФА) с применением стандартных тест-систем для определения уровня цистатина С (BioVendor, Чехия), интерлейкина-18 (BenderMed-Systems, США), липокалина-2 (Cus-abio, Китай), L-FABP (HycultBiotechnolo-gy, Нидерланды), KIM-1 (Cusabio, Китай).

Статистический анализ результатов проводили с помощью пакета Statis-tica 6.0 (Stat-Soft, 2001). Оценка достоверности произведена с использованием t-критерия Стьюдента. Уровень р <0,05 принимали как значимый.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Цистатин С представляет собой ингибитор эндогенной цистеиновой протеиназы. Полностью фильтруется в нефроне и в норме практически полностью разрушается в его проксимальном отделе. Его концентрация может увеличиваться у больных с ОПП [9]. Результаты изучения цистатина С в ткани почки, подвергнутой острой ишемии в ходе эксперимента, представлены в таблице 1.

Прежде всего, привлекало внимание различное содержание цистатина С в корковом веществе почек в зависимости от половых и возрастных особенностей. Так, в корковом веществе интактных почек старых самок уровень маркера был в среднем в 1,9 раза ниже, чем у молодых самок. Напротив, в корковом веществе интактных почек старых самцов содержание цистатина С было выше, чем у молодых, в среднем в 1,7 раза.

Через 15 мин ишемии в корковом веществе правой почки обнаружено повышение уровня цистатина С в 1,7 раза относительно исходных показателей только у молодых самцов. Через 20 мин ишемии уровень маркера был повышен относительно контрольных показателей у старых самок в 1,5 раза и молодых самцов в 1,7 раза (так же как и в предыдущем сроке). В корковом веществе ишемизированной почки молодых самок и старых самцов исследуемый маркер оставался на уровне интактной ткани. Через 25 мин ишемии высокий уровень цистатина С зарегистрирован в корковом веществе почек всех групп животных. По всей видимости такая динамика цистатина С могла свидетельствовать о нарушении его метаболизма вследствие ишемии почек: у молодых самцов уже через 15 мин ишемии, у старых самок – через 20 мин, а у молодых самок и старых самцов только через 25 мин (табл.1).

Белки, связывающиеся с печеночно-подобными жирными кислотами (L-FABP) выделяются в почках преимущественно в проксимальных канальцах и могут фильтроваться через клубочки. В силу малых размеров L-FABP быстро выходит из тканей поврежденных ишемией, что приводит к увеличению его уровня в сыворотке крови. Результаты изучения L-FABP в ткани почки, подвергнутой острой ишемии, представлены в таблице 2.

Привлекает внимание различный уровень данного маркера повреждения в корковом веществе почек интактных крыс в зависимости от пола и возраста. Так, содержание L-FABP в коре почек старых самок было в среднем в 9,7 раза ниже, чем у молодых самок. А в тех же образцах старых самцов – в 3,2 раза выше, чем у молодых самцов.

Таблица 1. Содержание цистатина С (нг/г ткани) в корковом веществе ишемизированной почки крыс разного пола и возраста

Группы крыс Старые самки Молодые самки Старые самцы Молодые самцы

интактные	6436,2 ± 204,9	10802,7 ± 1006,1	9552,2 ± 885,2	6383,7 ± 648,2
15 мин	6451,7 ± 235,7	11235,8 ± 692,7	9341,6 ± 678,5	11127 ± 894,1*
ишемия 20 мин	9905,5 ± 1157,5*	11982,5 ± 432,5	11248,5 ± 871,5	11100 ± 912,5*
25 мин	10058,4 ± 932,6*	13348,9 ±7 51,9*	13852,7 ± 754,1*	11019,6 ± 732,6*

Примечание: здесь и таблицах 2 – 5 * - различия по отношению к интактной ткани достоверны при р <0,05

Таблица 2. Содержание L-FABP (нг/г ткани) в корковом веществе ишемизированной почки крыс разного пола и возраста

Группы крыс	Старые самки	Молодые самки	Старые самцы	Молодые самцы
интактные	4,5 ± 0,2	45,9 ± 5,8	38,2 ± 4,5	12,4 ± 3,2
15 мин	26,2 ± 3,4*	5,1 ± 0,3*	47,8 ± 5,6	32,4 ± 3,0*
ишемия 20 мин	30,1 ± 2,9*	4,3 ± 0,5*	48, 9 ± 6,8	86,1 ± 6,2*
25 мин	30,4 ± 3,2*	42,2 ± 3,8	62,9 ± 5,4*	36,6 ± 3,4*

В процессе ишемизации обнаружена различная динамика этого маркера, также зависящая от пола и возраста животных. Через 15 мин ишемии в корковом веществе правой почки старых самок в 5,8 раза возрастало содержание L-FABP с последующим, хотя и незначительным, нарастанием в сроки 20 мин и 25 мин (табл. 2). У молодых самцов на всех сроках ишемии в корковом веществе так же регистрировались бо ’ льшие значения L-FABP, чем в интактных почках. Максимальная величина этого показателя, отличалась на 20 мин от старых самок и была в 6,9 раз больше, чем в интактных. Иная динамика содержания L-FABP обнаружена в почках старых самцов и молодых самок. Так в корковом веществе ишемизированной почки старых самцов повышение уровня маркера в 1,6 раза зарегистрировано лишь через 25 мин. Не найдено увеличение содержания L-FABP в корковом веществе ишемизированной почки молодых самок (табл. 2). Поскольку считается, что увеличение содержания L-FABP в моче при ОПП происходит преимущественно за счет повреждения проксимальных канальцев, логично предположить более раннее развитие патологических изменений в почках старых самок и молодых самцов, наступающее уже через 15 мин ишемии.

Экспериментально была установлена роль провоспалительного цитокина ИЛ-18 в развитии повреждения канальцевого эпителия [1]. Считается, что определение ИЛ-18 может иметь прогностическое значение в отношении продолжительности острой почечной н недостаточности и сроков восстановления почечной функции, и позволяет выявить на самой ранней стадии почечное повреждение, вызванное ишемией органа [10]. Увеличение концентрации ИЛ-18 с большей степенью достоверности свидетельствует об ОПП [11]. Результаты изучения уровня ИЛ-18 в ткани почки, подвергнутой острой ишемии, представлены в таблице 3. Обнаружен различный уровень данного маркера в корковом веществе почек интактных крыс в зависимости от пола и возраста. Так, в корковом веществе почек интактных старых самок содержание ИЛ-18 было в среднем в 7,8 раза ниже, чем в аналогичных образцах молодых самок. В корковом веществе интактных старых самцов, напротив, уровень ИЛ-18 был в среднем в 3,4 раза выше, чем в аналогичных образцах молодых самцов.

В процессе ишемизации почки обнаружена различная динамика ИЛ-18 в ее тканях, зависящая от пола и возраста животных. Через 15 мин ишемии в корковом веществе правой почки старых самок содержание ИЛ-18 возрастало в 15 раз с последующим сохранением уровня маркера в сроки 20 и 25 мин. Однотипные изменения уровня ИЛ-18 найдены в корковом веществе ишемизированной почки старых и молодых самцов: через 15 мин повышение его уровня составило 3,2 раза и 2,6 раза соответственно (табл. 3). Ни в одном из изученных сроков не обнаружены достоверные изменения уровня ИЛ-18 в корковом веществе ишемизированной почки молодых самок.

Таблица 3. Содержание ИЛ-18 (пг/г ткани) в корковом веществе ишемизированной почки крыс разного пола и возраста

Группы крыс	Старые самки	Молодые самки Старые самцы	Молодые самцы
интактные	2571,7 ± 312,6	20833,3 ± 1226,1 13119,9 ± 1146,8	3788,7 ± 352,4
15 мин	38677,7 ± 421,8*	22780,2 ± 1192,4 41494,7 ± 2385*	9666,8 ± 873,6*
ишемия 20 мин	33258,1 ± 279,3*	19951,6 ± 986,5 35966,3 ± 3146*	21624,3 ± 1683*
25 мин	35835,7 ± 315,6*	18570,6 ± 1126,6 53158,5 ± 2913*	22561,1 ± 1914*

Таблица 4. Содержание NGAL (нг/г ткани) в корковом веществе ишемизированной почки крыс разного пола и возраста

Группы крыс     Старые самки Молодые самки Старые самцы Молодые самцы

интактные	0,56 ± 0,05	1,1 ± 0,13	0,9 ± 0,07	3,1 ± 0,5
15 мин	0,63 ± 0,07	1,2 ± 0,1	0,9 ± 0,1	2,8 ± 0,31
ишемия 20 мин	1,3 ± 0,15*	1,1 ± 0,08	1,1 ± 0,15	2,3 ± 0,31
25 мин	1,4 ± 0,16*	1,1 ± 0,1	1 ± 0,09	1,4 ± 0,16*

Липокалин-2 (NGAL) – один из наиболее информативных биологических маркеров ОПП, является белком-компонентом острой фазы воспалительного ответа, чьи основные функции заключаются в стимулировании пролиферации поврежденных клеток, в первую очередь, эпителиальных. Ишемия почечной паренхимы вызывает повышение синтеза NGAL в клетках проксимальных канальцев [12]. При этом происходит быстрое увеличение синтеза мРНК, кодирующей u-NGAL, в восходящем колене петли Генле и в собирательных трубочках [13]. Результаты изучения в ткани почки, подвергнутой острой ишемии, уровня NGAL представлены в таблице 4. При сравнении уровня маркера в корковом веществе интактных почек в зависимости от возраста крыс-самок обнаружено, что у молодых животных уровень маркера был в 2,2 раза выше, чем у старых. Вместе с тем, содержание NGAL в корковом веществе почек молодых самцов было в 2,9 раза выше, чем у старых животных этого пола.

Изучение вызываемых ишемиза-цией почки изменений в динамике выявило неожиданные результаты. Так, в корковом веществе ишемизированной почки молодых самок и старых самцов не обнаружено изменения содержания NGAL ни в один из сроков ишемии. В корковом веществе правой почки старых самок нарастание маркера зафиксировано через 20 мин – в 2,З раза выше фоновых величин и через 25 мин – в 2,5 раза. А в корковом веществе правой почки молодых самцов уровень липока-лина-2 через 25 мин ишемии резко сни- зился в 2 раза (табл. 4). Скорее всего, уровень этого маркера в ткани почек может отражать активность процессов синтеза мРНК, кодирующей NGAL, которые различаются у животных в зависимости от пола и возраста. С другой стороны, NGAL является белком-компонентом острой фазы воспалительного ответа. Его основные функции заключаются в стимулировании пролиферации поврежденных клеток, в первую очередь, эпителиальных [14] . С этих позиций, полученные результаты можно трактовать как различную способность клеток органов животных разного пола и возраста к регенерации поврежденных клеток. В любом варианте этот вопрос нуждается в дальнейшем изучении и осмысливании.

Молекула повреждения почек KIM-1 является гликопротеином, принимающим участие в клеточно-клеточном взаимодействии, не содержится в почках здоровых людей, но его уровень значительно повышается в пораженных различными патологическими процессами почках. KIM-1 локализуется преимущественно в апикальной мембране проксимальных эпителиальных клеток и активируется при повреждении клеток паренхимы почек. Концентрации данного маркера увеличивается в проксимальных отделах нефрона при ОПП разного генеза [15] и является предиктором исхода лечения больных с ОПП [16]. В экспериментальной модели повреждения канальцев почек подтверждена интернализация апоптотических телец в эпителиальных клетках, экспрессирующих KIM-1[17]. Результаты изучения уровня KIM-1 в ткани почки, подвергнутой острой ишемии, представлены в таблице 5. Не было обнаружено достоверных отличий показателей уровня KIM-1 в корковом веществе почек интактных крыс в зависимости от пола и возраста животных. Увеличение содержания этого маркера было обнаружено через 20 мин ишемии в корковом веществе ишемизированной почки старых самок – в 2,3 раза относительно исходных показателей и молодых самцов – в 1,3 раза. Через 25 мин в корковом веществе правой почки старых самок уровень маркера превосходил значения у интактных животных соответствующего пола и возраста в 2,7 раза, а в аналогичных образцах молодых самцов – в 1,3 раза (табл. 5). В корковом веществе правой ишемизированной почки старых самцов увеличение содержания KIM-1 в 1,5 раза относительно показателей у интактных животных обнаружено только через 25 мин от начала ишемии. Ни в

Таблица 5. Содержание KIM-1 (нг/г ткани) в корковом веществе ишемизированной почки крыс разного пола и возраста

Группы крыс	Старые самки	Молодые самки	Старые самцы	Молодые самцы
интактные	0,35 ± 0,04	0,34 ± 0,03	0,28 ± 0,03	0,36 ± 0,05
15 мин	0,41 ± 0,03	0,29 ± 0,03	0,3 ± 0,03	0,38 ± 0,04
ишемия 20 мин	0,81 ± 0,07*	0,32 ± 0,04	0,31 ± 0,03	0,48 ± 0,05*
25 мин	0,95 ± 0,09*	0,36 ± 0,04	0,42 ± 0,43*	0,45 ± 0,03*

один из сроков наблюдения не найдено изменение показателя уровня KIM-1 в корковом веществе почек молодых самок.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализируя в целом результаты изучения уровня признанных маркеров ОПП в проведенном эксперименте, следует отметить существование как возрастной, так и половой специфики влияния острого прекращения кровотока в органе на их уровень в различных структурах почек. Прежде всего, необходимо отметить, что наименее устойчивыми к повреждающему действию острой ишемии оказались старые самки и молодые самцы, далее в этом ряду стоят старые самцы. Самыми устойчивыми следует признать молодых самок. В корковом веществе почек, подвергнутых ишемии, у молодых самцов и старых самок в более ранние сроки (уже через 15 мин), у старых самцов – в более поздние сроки (через 20 мин) происходит накопление циста-тина С, L-FABP и ИЛ-18. Изменение уровней КИМ-1 и NGAL несколько отсрочено по времени. □

Резюме: