Экспрессия поддерживающего белка NEDD9 как негативный прогностический маркер при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ)

В настоящее время смертность от немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) занимает лидирующее место среди всех онкологических заболеваний [1]. Несмотря на то, что в последнее время увеличивается количество пациентов, для которых заболевание выявляется на ранних стадиях, большинство больных обращаются за лечением с распространенным НМРЛ, когда прогноз становится неблагоприятным, особенно при наличии рефрактерного к лечению метастатического поражения [2]. Поэтому важную роль для совершенствования методов лечения НМРЛ играют не только разработка новых препаратов и терапевтических подходов, более эффективных на поздних стадиях, но также улучшение адъювантной терапии, а также поиск новых прогностических биомаркеров НМРЛ.

Одним из новых и потенциально значимых биомаркеров является NEDD9. Этот белок является поддерживающим медиатором в множестве внутриклеточных сигнальных каскадов, таких как PI3K-AKT-mTOR, Ras-ERK, и интегринов, играющих ключевые роли в росте и прогрессировании множества опухолей, в т. ч. и НМРЛ [3–6], а также активатором тирозинкиназ семейства SRC, повышенная экспрессия которых ассоциируется с процессами эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) – одного из ключевых биологических механизмов, лежащих в основе метастазирования НМРЛ [7–10]. В литературе показано, что повышенная экспрессия NEDD9 в опухолевых клетках ассоциируется с увеличением метастатического потенциала за счет приобретения клетками более мезенхимального фенотипа и увеличения миграционной способности клеток [11–14]. Важно отметить данные о том, что изменение уровней экспрессии NEDD9 в солидных опухолях ассоциируется с метастазированием и сниженной выживаемостью пациентов [15, 16], однако этот вопрос в контексте НМРЛ изучен недостаточно досконально: детального анализа корреляции экспрессии NEDD9 с клиническими показателями выживаемости и прогрессированием заболевания проведено не было.

Целью исследования явилась оценка прогностической значимости белка NEDD9 у пациентов с НМРЛ.

Материал и методы

В данном ретроспективном исследовании нами были изучены образцы первичных опухолей от 16 пациентов с НМРЛ, фиксированные в парафине, полученные из базы данных образцов пациентов, проходивших лечение в Республиканском клиническом онкологическом диспансере (РКОД) г. Казань, Республики Татарстан. Исследование одобрено этическим комитетом РКОД и Казанского федерального университета, протокол № 8 от 13.02.18. У каждого пациента на момент проведения забора материала с целью гистологической верификации, а также перед хирургическим лечением было взято письменное согласие на последующую анонимизированную обработку. Все образцы были анонимизированы, аннотированы.

Ткани первичной опухоли легкого были зафиксированы формальдегидом и погружены в парафин. Парафиновый блок, содержащий образцы тканей, нарезали, толщиной 3–5 мкм и фиксировали их на предметном стекле. ИГХ-окрашивание выполняли по следующей методике: срезы с целью депарафинизации трижды погружали в 100 % ксилен на 5 мин. Затем срезы дегидратировались в серии растворов этанола (100, 70, 50 %) при погружении на 3 мин в каждый. Затем проводилась термическая демаскировка эпитопов в 0,01М цитратном буфере (pH 6.0). ИХГ окрашивание производилось с использованием первичных антител к NEDD9 в концентрации 5 мкг/мл (2G9, Abcam, Бостон, США) и набора вторичных антител против мыши HRP/DAB IHC Detection kit–Micro-polymer (Abcam ab236466, Бостон, США). В качестве негативного контроля окрашивания вместо первичного антитела к NEDD9 использовалось мышиное IgG антитело. После ИГХ-окрашивания производилось дополнительное окрашивание гематоксилином. В конце срезы были повторно дегидратированы с помощью погружения в серию растворов этанола (70, 96, 100 %) и ксилена на 3 мин в каждый. Покровные стекла фиксировались с помощью раствора Histomount (HS-103, National Diagnostics, Атланта, США).

Окрашенные препараты сканировались на рабочей станции Leica Aperio CS2 (Leica Biosystems, Сан-Диего, США). Оценку ИГХ-экспрессии NEDD9 проводили с использованием полуколи-чественного метода h-score в программном обеспечении QPath (QuPath: ) [17], при котором уровень экспрессии определяется по формуле

[1× ( % клеток 1+) + 2 × ( % клеток 2+) +

+ 3 × ( % клеток 3+)]

и варьируется от 0 до 300 баллов [18].

Для корреляционного анализа РНК экспрессии NEDD9 и клинико-прогностических показателей пациентов с НМРЛ использовались материалы общедоступных баз данных Атласа геномных данных опухолей (TCGA) пациентов с аденокарциномой легкого, находящиеся на портале (ноябрь 2021). Использовался доступный онлайн набор инструментов визуализации и обработки данных [19].

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 8.0 (Сан Диего, США), а также инструментов статистического анализа, доступных на сайте Для сравнения количественного показателя h-score на разных стадиях НМРЛ использовался непараметрический тест Манна–Уитни. Корреляция клинико-патологических показателей и экспрессии NEDD9 была оценена методом log-rank test. Кривые выживаемости были построены с использованием метода Каплана–Мейера для оценки БПВ и ОВ.

Результаты

В исследовании анализировалась когорта из 16 пациентов, из них 69 % мужчин, 31 % женщин (табл. 1). Медиана возраста – 57 лет, средний возраст – 57,3 года, стандартное отклонение – 7,4 года; диапазон от 38 до 68 лет. Четырем (25 %) пациентам был поставлен диагноз НМРЛ II стадии, 6 и 6 пациентам – НМРЛ III и IV стадии (по 37,5 % соответственно). Больным проведено лечение в соответствии с текущими клиническими рекомендациями; ни один из пациентов не участвовал в клинических исследованиях. Химио- и таргетная терапия проводилась в адъювантном режиме. Образцы опухолевой ткани были получены перед началом лечения. Пациентам с IV стадией НМРЛ была выполнена расширенная лобэктомия или пневмонэктомия с паллиативной целью. Данных за ассоциацию между клинико-патологическими характеристиками, такими как возраст, пол, стадия заболевания, и общей (ОВ) или бесспрогрессивной (БПВ) выживаемостью не обнаружено (p>0,05) (табл. 2).

На первом этапе исследования нами была проведена оценка уровней экспрессии белка NEDD9 с использованием метода ИГХ окрашивания и анализа h-score. Обнаружено, что при НМРЛ III стадии отмечается значимое снижение уровня белка NEDD9 по сравнению с НМРЛ II стадии (усредненный h-score 31,5 против 52,1; р=0,04), с дальнейшим повышением при НМРЛ IV стадии (усредненный h-score 31,5 против 76,05; р=0,006) (рис. 1А, Б). Для подтверждения полученных данных в более широкой выборке была произведена оценка экспрессии РНК NEDD9 в базе данных

Таблица 1/Table 1

Клиническая характеристика исследуемой когорты больных НМРЛ

Clinical characteristics of the cohort of NSClC patients

Показатель/Parameter Пол/Gender Мужской/Males 69 % Женский/Females 31 % Возраст на момент постановки диагноза, лет / Age at diagnosis, years Средний/Medium 57,3 Мин/Min 38 Макс/Max 68 Ст. отклоения/Standard deviation 7,4 Гистологический тип опухоли/Histological type of tumor Аденокарцинома/Adenocarcinoma 43,8 % Плоскоклеточный рак/ Squamous cell carcinoma 31,1 % Папиллярная аденокарцинома/ Papillary adenocarcinoma/ 6,3 % Аденосквамозная карцинома/ Adenosquamous carcinoma 12,5% Бронхиоло-альвеолярный рак/ Bronchioalveolar carcinoma 6,3 % Стадия/Stage IIA 12,5 % IIB 12,5 % IIIA 31,3 % IIIB 6,3 % IVA 12,5 % IVB 24,9 % T стадия/Stage T x 6 % 2 81 % 4 13 % N стадия/Stage N 0 13 % 1 44 % 2 25 % 3 6 % x 13 % M стадия/Stage M 0 81 % 1 19 % Курение/Smoking Курильщик/Smoker 63 % Не курил(а)/Non-smoker 37 % Лечение на стадиях I–III/Treatment for stages I–III Химиотерапия/Chemotherapy 10 % Хирургическое лечение/Surgery 90 % Лечение на IV стадии/Treatment for stage IV Таргетная и химиотерапия/ Targeted therapy and chemotherapy 16,6 % Химиотерапия/Chemotherapy 50 % Хирургическое лечение/Surgery 33,4 % пациентов TCGA_PanCancer (n=566). Вариабельности экспрессии NEDD9, сходной с таковой, обнаруженной ранее, подтверждено не было (рис. 1 В), однако отмечался тренд к повышению экспрессии NEDD9 при НМРЛ IV стадии.

Для оценки прогностической значимости экспрессии NEDD9 нами проведен корреляционный анализ между уровнями экспрессии NEDD9 (как белка, так и РНК) и общей выживаемостью (ОВ), а также беспрогрессивной выживаемостью (БПВ) пациентов с НМРЛ. На первом этапе анализ проводился в когорте образцов РКОД. Значимой корреляции между экспрессией NEDD9 (дихотомическое распределение по усредненному значению h-score=56,14) и ОВ и БПВ у пациентов на стадиях заболевания не обнаружено (ОВ – р=0,31; БПВ – р=0,33; рис. 2А, Б), однако отмечался тренд между низким уровнем экспрессии NEDD9 и снижением показателей ОВ и БПВ.

Поскольку одним из ограничений данного исследования является небольшой размер выборки, для верификации полученных данных на следующем этапе был проведен аналогичный анализ с использованием более обширной когорты TCGA_PanCancer. Обнаружено, что снижение экспрессии РНК NEDD9 (нижний квартиль диапазона экспрессии) в первичных опухолях НМРЛ значимо коррелирует со снижением ОВ (р=0,05; рис. 2 В), но не с БПВ (р=0,45; рис. 2Г), по сравнению с повышенной (верхний квартиль) экспрессией NEDD9.

Обсуждение

Совершенствование методов хирургического лечения и системной терапии не всегда приводит к существенному улучшению отдаленных результатов, но внедрение таргетной терапии в адъювантном режиме позволяет значительно снизить частоту рецидивов и отдаленных метастазов (исследование ADAURA) [20]. Поэтому поиск новых предиктивных биомаркеров, позволяющих оценить риски прогрессирования НМРЛ, является чрезвычайно актуальным [21, 22].

В данном исследовании обнаружено, что при НМРЛ III стадии отмечается значимое снижение экспрессии белка NEDD9. Однако по данным анализа выживаемости, проведенного с использованием расширенной выборки пациентов (566 образцов), именно сниженная экспрессия РНК NEDD9 являлась негативным прогностическим фактором в отношении общей выживаемости пациентов. Поскольку экспрессия белков, участвующих во внутриклеточных сигнальных каскадах, связанных с пролиферативной и миграционной активностью опухолевых клеток, в которых NEDD9 играет важную роль, в значительной степени регулируется посттрансляционно [23], на основании полученных данных сделан вывод о том, что стабильная экспрессия РНК NEDD9 не всегда коррелирует с уровнями белка в клетках. Это позволяет, с одной

Таблица 2/Table 2

log-rank анализ между клинико-патологическими параметрами пациентов НМРЛ с общей и беспрогрессивной выживаемостью

log-rank analysis of clinicopathological parameters of the NSClC patient with overall or progression-free survival

Показатель/Parameter		Общая выживаемость, мес, ДИ 95 %)/ Overall survival, months, 95 % CI	Log-rank	p-value	Беспрогрессивная выживаемость, мес, ДИ 95 %)/ Progression-free survival, months, 95 % CI	Log-rank	p-value
Возраст, лет/Age (years)
< медиана/ median > медиана / median	7 (43,7 %) 9 (56,3 %)	16,0 (13,8–18,2) 22,0 (13,2–30,8)	0,64	0,43	7,0 (6,0–8,0) 9,0 (8,1–9,9)	2,13	0,14
Ст. откл./ Standard	7,4
deviation
Пол/Sex
Муж/ Male Жен/Female	11 (69 %) 5 (31 %)	15,0 (6,4–23,6) 18,0 (15,8–20,2)	0,05	0,82	7,0 (3,9–10,1) 8,0 (6,3–9,7)	0,53	0,47
Стадия/ Stage
II	4 (25 %)	19,0 (13,9–24,1)			9,0 (7,8–10,2)
III	6 (37.5 %)	19,0 (15,3–22,7)	3,62	0,16	7,0 (5,2–8,8)	1,04	0,6
IV	6 (37,5 %)	12,0 (3,3–20,7)			4,0 (2,5–5,5)
Всего/ Total	16 (100 %)

Рис. 1. Разделение уровней экспрессии NEDD9 у больных НМРЛ разных стадий: А) уровни белка NEDD9 в образцах когорты РКОД, установленные с помощью анализа h-score данных ИГХ, а также репрезентативные микрофотографии (Б); В) уровни мРНК NEDD9 (относительные z-score), установленные по данным анализа РНК-секвенирования доступных в базе данных TCGA-PanCan на

На графиках: * – p<0,05;

** – p<0,01. Шкала: 200 мкм Fig. 1. Segregation of NEDD9 expression levels of patients with NSCLC at different stages of the disease: A) NEDD9 protein levels in samples from the RCOD cohort as determined by h-score analysis of IHC data, and representative photomicrographs (B); C) NEDD9 mRNA levels (relative z-score) determined from TCGA-PanCan RNAseq dataset available at All graphs: * – p<0.05; ** – p<0.01.

Scale: 200 µm

Рис. 2. Корреляция экспрессии NEDD9 в исследуемых когортах НМРЛ с ОВ и БПВ. Кривые общей (ОВ) и бесспрогрессивной (БПВ) выживаемости по методу Каплана–Мейера на основе данных h-score экспрессии белка NEDD9 в образцах когорты РКОД (А, Б) и значений z-score мРНК NEDD9, доступных в базе данных TCGA-PanCan на (В, Г)

Fig. 2. Correlation of NEDD9 expression with OS and PFS in the NSCLC cohorts. Overall survival (OS) and progression-free survival (PFS) curves plotted using the Kaplan–Meier method, based on h-score data of NEDD9 protein expression in RCOD cohort samples (A, B) and NEDD9 mRNA z-score data available in the TCGA-PanCan dataset at (C, D)

стороны, объяснить различия между экспрессией белка (оцененной с помощью ИГХ) и РНК (РНК-секвенирование) NEDD9 на различных стадиях. С другой стороны, эта разница может указывать на то, что на разных этапах прогрессирования НМРЛ в опухолевых клетках активируются биологические механизмы, зависящие поэтапно от уровней РНК и белка NEDD9.

Полученные нами данные, а также анализ литературы позволяют потенциально номинировать NEDD9 в качестве нового прогностического маркера течения заболевания у пациентов с НМРЛ II–III стадий. Одним из достоинств данного исследования является то, что для оценки экспрессии NEDD9 использован метод ИГХ, рутинно применяющийся в клинической практике, в отличие от РНК-секвенирования, которое пока не получило широкого распространения. Достоинствами последнего являются возможность аннотирования профилей экспрессии большой панели генов, обнаружение новых сигнатур экспрессии, специфичных для отдельных групп клеток, однако, учитывая наличие опухолевой гетерогенности, метод ИГХ позволяет провести качественную оценку большей опухолевой поверхности и может служить дополнительным верификационным критерием результатов РНК-секвенирования [24]. Несмотря на ограниченный размер выборки образцов ИГХ, нами был обнаружен тренд к снижению выживаемости пациентов со сниженным уровнем экспрессии белка NEDD9, что, несомненно, указывает на необходимость проведения последующих ИГХ-исследований с использованием расширенных когорт образцов.

Заключение

На основании результатов исследования можно сделать вывод о том, что измерение уровня экспрессии поддерживающего белка NEDD9 у пациентов с НМРЛ может быть использовано в качестве нового прогностического маркера течения заболевания на ранних стадиях. Дальнейшие исследования значимости этого белка с использованием более широкой экспериментальной выборки представляют значительный интерес.