Экспрессия раково-тестикулярных антигенов в клетках меланомы человека
Журнал: Сибирский онкологический журнал @siboncoj
Рубрика: Лабораторные и экспериментальные исследования
Статья в выпуске: 1 (37), 2010 года.
Бесплатный доступ
По морфологическим и генетическим (транскриптомным) параметрам нами охарактеризована 21 клеточная линия диссеминированной меланомы кожи человека. Морфологические исследования позволили разделить полученные линии на 3 группы: высоко-, умеренно- и низкодифференцированную. ОТ-ПЦР анализом мРНК выявлено неоднородное распре- деление раково-тестикулярных маркеров. Проведенный корреляционный анализ показал взаимосвязь между увеличением экспрессии раково-тестикулярных маркеров и атипизмом раковой клетки. Полученные данные могут быть использованы для клинического прогноза заболевания и способствовать оптимизации лечения
Похожие статьи в разделе Патология. Клиническая медицина
Короткий адрес: https://sciup.org/14055590
IDS: 14055590 | УДК: 616-006.81-097:575.117
Expression of cancer testis antigens in human melanoma cells
The expression of genes for 15 cancer-testis antigens and 4 melanoma differentiation antigens in 21 metastatic melanoma cell lines using a RT-PCR assay was analysed. The morphological examination allowed us to divide all analyzed cell lines into three groups with a high, intermediate, and low level of differentiation of tumour cells. Correlation analysis of gene expression and cell morphology demonstrated interrelation between increased expression of cancer-testis genes and differentiation grade of cancer cells. Data obtained can be used for the disease prognosis and promote optimization of medical treatment.
Текст научной статьи Экспрессия раково-тестикулярных антигенов в клетках меланомы человека
Опухолевая прогрессия определяется рядом факторов, которые формируют злокачественную клетку, к ним относятся самодостаточность в пролиферативных сигналах, пониженная чувствительность к ростингибирующим сигна- лам, отсутствие репликативного старения или приобретение бессмертия (иммортализация), ослабление индукции апоптоза, стимуляция неоангиогенеза, изменение подвижности и приобретение способности к инвазии и росту в другом микроокружении, изменение морфологии клеток, нарушение клеточной дифференцировки, генетическая нестабильность. Морфологически клетка становится атипичной, подвергаясь всевозможным изменениям в размере, форме и количестве ядер, соотношении между ядром, цитоплазмой и ядрышками. Иммуногеннотипически злокачественная клетка характеризуется экспрессией ряда антигенов: раково-тестикулярных (MAGE, BAGE и т.д.), дифференцировочных (дифференцировочные антигены для меланомы – тирозиназа, Melan-A/MART-1, gp100, TRP-1, TRP-2) [4], а также сниженной экспрессией антигенов гистосовместимости первого, второго класса [5]. Раково-тестикулярные антигены (РТА), которых идентифицировано более 44 семейств, состоят как из множественного количества изоформ белка (MAGEA, GAGE1 и т.д.), так и вариантов сплайсинга генов [6]. РТА кодируются генами, экспрессирующимися в герменногенных клетках, а также в опухолях различных типов. Высокий уровень РТА наблюдается при меланоме, раке мочевого пузыря, раке легкого, печени и ряде других онкологических заболеваний [3]. Некоторые авторы отмечают, что увеличение экспрессии РТА коррелирует с опухолевой прогрессией. Например, уровень экспрессии мРНК MAGE возрастает при метастатической меланоме, а экспрессия NY-ESO-1 при раке мочевого пузыря коррелирует с высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением. Роль данных антигенов не совсем понятна. Хотя уже сейчас их функции связывают с гаметогенезом [7].
Цель работы заключалась в исследовании опухолевых клеточных линий, полученных от больных диссеминированной меланомой, для выявления корреляций между морфологическими и транскриптомными характеристиками культур, опосредованных злокачественностью клеток.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: провести морфологический анализ полученных ранее культур [1]; дополнить его кариологическими признаками (различиями), такими как соотносительная оценка размера ядер, характер их окраски, состояние хроматина и кариотипиче- ский анализ (число хромосом, симметричные транслокации в длинных хромосомах, наличие или отсутствие идентичных перестроенных хромосом в разных метафазах, нестабильные хромосомные аберрации); составить карты экспрессии раково-тестикулярных антигенов методом полимеразной цепной реакции, совмещенной с обратной транскрипцией в клеточных линиях, и выявить группы РТА методом кластерного анализа.
Материал и методы
Культивирование опухолевых клеток. Клеточные линии, полученные ранее [1], культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 15 % ТЭС, 2 мМ L-глутамин, 1 % HEPES, пенициллин (10 ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и комплекс аминокислот и витаминов (Flow, Virginia, USA) в культуральных флаконах (Costar, Coring, USA).
Реакция поверхностной иммунофлуоресценции. 5х105 клеток инкубировали с 20 мкл моноклональных антител (МКА) в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего 10 мин отмывали в 1 мл PBS при 1500 об/мин. К осадку клеток добавляли 20 мкл вторичных антител, конъюгированных с флюоресциин изо-тиоционатом (FITC), и инкубировали в течение 30 мин при 4 ° С. После этого клетки дважды отмывали в 1 мл PBS в тех же условиях, осадок клеток ресуспендировали в 200 мкл 1 % раствора формалина и анализировали на проточном цитометре FACSCalibur (Beckton Dickinson, USA). Первичные и вторичные МКА, использованные в работе, были получены в Институте клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН: ICO-218 (HMW – меланомодиффе-ренцировочный антиген) и F(ab)2 фрагменты иммуноглобулинов, конъюгированных с FITC. Использовали реактивы для буферов и фиксаторов компании ХимМед Москва, Россия).
Иммуноцитохимическое исследование. Фиксация материала. Из полученных клеточных линий готовили цитопрепараты – осаждением суспензии клеток на цитоцентрифуге Universal 16A (Hettich, Germany), просушивали на воздухе, хранили при –20ºС. Для проведения реакции стекла прогревали до комнатной температуры, фиксировали 1–2 мин в охлажденном (–20ºС)
ацетоне (ХимМед, Москва, Россия). Процедура окрашивания. Фиксированные цитопрепараты промывали в PBS 5 мин. Блокировали эндогенную пероксидазу 3 % раствором перекиси водорода (ХимМед, Москва, Россия) в течение 20 мин, образцы промывали в двух сменах PBS 10 мин. Затем инкубировали с 1 % раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Sigma, St. Louis, USA) 20 мин при комнатной температуре, после этого избыток раствора удаляли и, не промывая образцы, наносили первичные антитела, инкубировали в течение ночи на холоде (+4ºС). Образцы промывали в трех сменах PBS. Для визуализации реакции применяли систему LSAB+Detection System (Dako, USA) согласно инструкции. Выявление ферментативной активности проводили с помощью AEC (3-amino-9-ethylcarbazole containing hydrogen peroxide, stabilizers, enhancers, and anti-microbial agent) (Dako, USA), докрашивали гематоксилином (Serva, Germany). Подсчет проводили в областях с максимальным окрашиванием на 200–300 опухолевых клеток, используя микроскоп «Axiolab» (ZEISS, Germany). Для иммуноцитохимического исследования использовали следующие МКА (Novocastra Laboratories, UK): MelanA/МART-1 (маркер дифференцировки меланоцитов клон А103, в рабочем разведении 1:25), HMB45 (маркер дифференцировки меланоцитов, используется для идентификации меланоцитных опухолей, клон HMB45, в рабочем разведении 1:60), Tyrosinase (маркер дифференцировки меланоцитов, определяет биосинтез меланина, клон Т311, в рабочем разведении 1:50). Для цитологического анализа клетки меланомных линий выращивали в ростовой среде на предметных стеклах, помещенных в чашках Петри. Мазки окрашивали по методу Лейшмана.
Методика приготовления цитогенетических препаратов. Для приготовления препаратов для кариотипического анализа клетки обрабатывали колхицином в конечной концентрации 0,5 мкг/мл, вводя его в культуральные флаконы за 1,5 ч до начала фиксации. Использовались реактивы фирмы Sigma-Aldrich (St. Louis, USA). Затем клетки снимали со стенки флакона с помощью раствора Версена и 0,25 % раствора трипсина. Для отмывания от трипсина добавляли среду DMEM (5 мл), полученную су- спензию клеток центрифугировали (10 мин при 1000 об/мин), надосадочную жидкость сливали. Гипотонию проводили 0,55 % раствором KCl (12 мин при 37ºС), перед центрифугированием добавляли 3–5 капель фиксатора. Фиксация проводилась смесью метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (в соотношении 3:1) стандартным способом, с использованием 3 смен фиксатора. Клеточные суспензии раскапывали на охлажденные влажные стекла. Высушенные препараты окрашивали по методу G-окраски.
Полимеразная цепная реакция, совмещенная с обратной транскрипцией. Суммарную РНК из культур опухолевых клеток меланомы выделяли методом с применением кислого фенола, гуанидина тиоционата (NH2C(=NH) NH2 × HSCN) и аммония тиоционата (NH4SCN) в соответствии с рекомендациями фирмы (Protocol № PT3231-1, CLONTECH, Mountain View, USA). Использованы реактивы фирмы Sigma-Aldrich (St. Louis, USA). Для выделения суммарной РНК использовали 1×106 опухолевых адгезивных клеток или такое же количество суспензионных клеток (Mel min – 15). Опухолевые клетки разрушали добавлением денатурирующего буфера непосредственно в культуральном флаконе с клетками, но без культуральной среды, или добавлением к осадку, полученному после центрифугирования, суспензионных клеток. РНК из гомогената экстрагировали последовательным добавлением кислого фенола (pH 4,0) и хлороформа и изопропанолом. Описанную процедуру выполняли дважды. Последовательности нуклеотидов ген-специфических праймеров (табл. 1) были выбраны при помощи программы Oli99 фирмы «Техноген» (Москва, Россия) и синтезированы на фирме «Синтол» (Москва, Россия). Последовательность мРНК была получена из баз данных UniGene entrez/ и AceView Национального центра для биотехнологической информации (Bethesda,USA, ncbi. . Определение степени гомологии нуклеотидных последовательностей полученных ампликонов против геномной и мРНК последовательностей проводили при помощи программы BLAST на сервере
Таблица 1
|
Семейство генов |
Название ампликона |
Символ гена (HGNC)*** |
мРНК**** |
F R* |
Последовательность нуклеотидов (5' – >3') |
Размер ампликона |
Кластер генов** |
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
|
РТА |
Антигены (раково-тестикулярные), кодируемые этими генами, узнаются аутологичными цитотоксическими лейкоцитами. Экспрессируются в разнообразных опухолях, но не в нормальных тканях, за исключением тестикул, плаценты и незрелых (бластных) клеток различной природы. |
||||||
|
MAGE-B1 |
MAGEB1 |
NM_002363.3 |
F |
TAAGTTCATCACCCAAGATCTGGTGC |
346 |
G1a |
|
|
R |
AACAAAGTGAACAATCTGCCTGAGTTC |
||||||
|
MAGE-B2 |
MAGEB2 |
NM_002364.3 |
F |
CAGTGTTGTCTTTGGCCTTGAGCTG |
217 |
G1a |
|
|
R |
GACTCCCAACATATTCAGGAATTCCC |
||||||
|
MAGE-A4 |
MAGEA4 |
NM_002362.3 |
F |
TTCCTGTGATCTTCGGCAAAGCCTC |
204 |
G1b |
|
|
R |
TGTCGCCCTCCATTGCAATTGTGC |
||||||
|
GAGE-1-8 |
GAGE1, GAGE2, GAGE4, GAGE5, GAGE6, GAGE7, GAGE8 |
NM_001468.1 |
F |
GGCCTAGACCAAGACGCTACGTAG |
212 |
G1b |
|
|
R |
GTGACCCTGTTCCTGGCTATCAGC |
||||||
|
GAGE3 |
GAGE3 |
U19144 |
F |
AGATGAGTTGGCGAGGAAGA |
223 |
G1b |
|
|
R |
TTCCCCTTCTTCAGGTGTTG |
||||||
|
GAGE-4-7 |
GAGE4, GAGE5, GAGE6, GAGE7 |
NM_002045 |
F |
GGCCTAGACCAAGGCGCTATGTAC |
212 |
G1b |
|
|
R |
GTGACCCTGTTCCTGGCTATCAGC |
||||||
|
MAGE-A1 |
MAGEA1 |
NM_004988.3 |
F |
GGGCCAAGCACCTCTTGTATCCTG |
212 |
G1c |
|
|
R |
ATGCCAAAGACCAGCTGCAAGGAC |
||||||
|
MAGE-A10 |
MAGEA10 |
NM_021048.3 |
F |
GTTTAGTGAAGCCTCCGAGTGCATG |
192 |
G1c |
|
|
R |
TAGCCCTCTATGAAGATTATGCTTAGG |
||||||
|
MAGE-C1 |
MAGEC1 |
NM_005462.2 |
F |
AGTGGACCCTGATGACTCCTATGTC |
271 |
G1c |
|
|
R |
CCGGTACTCTAGGTAATGTTCCTGC |
||||||
|
BAGE |
BAGE |
NM_001187 |
F |
GCCAATTTAGGGTCTCCGGTATCTC |
211 |
G1c |
|
|
R |
TCTGGCCGCCATCTTACTGCTCC |
||||||
|
MG-A3 |
MAGEA2, MAGEA3, MAGEA6, MAGEA12 |
NM_005362.3 |
F |
CCCACTACCATGAACTACCCTCTC |
223 |
G2a |
|
|
R |
AATACTGCCAATTTCCGACGACACTC |
||||||
|
MG-A2 |
MAGEA2, MAGEA3, MAGEA6, MAGEA12 |
NM_175743.1 |
F |
TCCAAGGGCCCTCATTGAAACCAG |
233 |
G2a |
|
|
R |
GGAATGGGCCTCATATCACACGAG |
||||||
|
MG-A6 |
MAGEA2, MAGEA3, MAGEA6, MAGEA12 |
NM_005363.2 |
F |
TCCAAGGGCCCTCATTGAAACCAG |
233 |
G2a |
|
|
R |
GAATGGGCCTCACGTCACAGGAG |
||||||
|
MG_ A12-236 |
MAGEA2, MAGEA3, MAGEA6, MAGEA12 |
NM_005367.3 |
F |
GAAATGCTGGGGAGTGTCAT |
197 |
G2a |
|
|
R |
GTCTTGGGCACGATCTGATT |
||||||
|
CTAG1 |
Меланоцитный дифференцирующий антиген. Белки этих генов являются специфичными для опухолей и узнаются аутологичными цитотоксичными Т-лимфоцитами. (CTAG1) |
||||||
|
NY-ESO-1 |
CTAG1A, CTAG1B, CTAG2 |
NM_001327 |
F |
CTCCATCAGCTCCTGTCTCC |
209 |
G1c |
|
|
R |
CTCCTCCAGCGACAAACAAT |
||||||
Окончание табл. 1
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
|
ДАМ |
Дифференцировочные антигены меланомы. Компоненты меланосомы участвуют в меланогенезе. Незрелые меланосомы характерны для меланомы и фетальных клеток и распознаются моноклональными антителами HMB45. В зрелых меланосо-мах, преобладающих в меланоцитах, антиген gp100 (PMEL17) продукт гена SILV экранирован от HMB45 |
||||||
|
SILV |
SILV |
NM_006928 |
F |
GGGCCAATACTGGCAAGTTCTAGG |
375 |
G2c |
|
|
R |
AGGTAAGTATGAGTGACCACAAGTGC |
||||||
|
MLANA |
MLANA |
NM_005511.1 |
F |
GCTCATCGGCTGTTGGTATT |
190 |
G2c |
|
|
R |
ATAAGCAGGTGGAGCATTGG |
||||||
|
TYR |
TYR |
NM_000372.3 |
F |
AGCTTTCAGGCAGAGGTTCCTGTC |
290 |
G2c |
|
|
R |
GGTATGCTTTGCTAAAGTGAGGTAGG |
||||||
|
S100 |
Ca-связывающий белок из семейства S100. Белок вовлечен в регулирование развития клеточного цикла и дифференцировки. Маркер меланомы |
||||||
|
S100B |
S100B |
NM_006272.1 |
F |
AGCCCGCCATGGCCGTGTAGAC |
257 |
||
|
R |
CCAGCGCTGAGCGTTCACCTGG |
||||||
|
HLA |
Гены, кодирующие белки главного комплекса гистосовместимости |
||||||
|
HLA-E |
HLA-E, HLA-A, HLA-C, HLA-G |
NM_002127.3 |
F |
GTGACTCACCACCCCATCTC |
215 |
||
|
R |
TGGCACGTGTATCTCTGCTC |
||||||
|
HLA-G |
HLA-G |
NM_002127.3 |
F |
TATGAACAGTATGCCTACGATGGCAAG |
306 |
||
|
R |
TATGATCTCCGCAGGGTAGAAGCC |
||||||
|
ГДХ |
Ген «домашнего хозяйства». Ген глицеральдегидфосфодегидрогеназы |
||||||
|
G3PDH |
GAPDH |
NM_002046.3 |
F |
ACCACAGTCCATGCCATCAC |
452 |
||
|
R |
TCCACCACCCTGTTGCTGTA |
||||||
Примечание: * – F – прямой праймер, R – обратный праймер; ** – см. рис. 3; ***– приведены названия всех генов, хотя бы одна из альтернативных версий мРНК которых амплифицируется использованной парой праймеров; **** – описание каталожного номера мРНК: ,
Последовательность нуклеотидов ген-специфических праймеров
nlm.nih.gov/BLAST/ . Для гена глицеральдегид-3 фосфат дегидрогеназы использовались праймеры G3PDH 0.45 kb Control Amplimer Set фирмы CLONTECH (Mountain View, USA). Для реакции обратной транскрипции (ОТ) использовали обратную транскриптазу М-МLV и реактивы фирмы (Promega, Madison, USA). Объём пробы составлял 25 мкл. Сначала смешивали 1 мкг РНК с 25 пмолями смеси, случайных наномеров (Синтол, Москва, Россия) в 5 мкл воды. Смесь прогревали при 70oC 5 мин и охлаждали во льду. Затем добавляли 20 мкл смеси, содержащей 5x M-MLV буфер, 3 мкМ MgCl2 , смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов в концентрации 0,2 мМ каждого, 200 ед. обратной транскриптазы. Реакционную смесь инкубировали при 37°C 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием (95°C, 5 мин). Полученную одноцепочечную кДНК хранили при –20°C. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в программируемом термостате фирмы Hybaid, (Waltham, USA) . кДНК (1/100 часть) амплифицировали с 0,5 мкМ ген-специфических олигонуклеотидов и 2,0 ед. ДНК-полимеразы Thermus Aquaticus
(БиоМастер, Москва, Россия). Амплификацию проводили в 20 мкл смеси, содержащей 0,01М Трис-HCl (pH 8,5 при 25°C), 0,05 M KCl, 0,002 M MgCl2, 10 мкг/мл желатина, 200 мкМ каждого dNTP, 200 мкг/мл антител «TaqStart» (CLONTECH, Mountain View, USA). Для всех опытов ПЦР проводили по схеме: 94оС – 30 cек, 60оС – 60 cек, 72оС – 1 мин – 35 циклов. 72оС – 7 мин. Результаты анализировали электрофорезом 5 мкл реакционной смеси в 1,0 % или 1,5 % агарозном геле в TAE буфере с 0,002 % бромистого этидия. В качестве положительного контроля ОТ-ПЦР использовали ген GAPDH (относящийся к группе «генов домашнего хозяйства»). В качестве маркёра длин использовали GeneRuler™ 1kb DNA Ladder (Fermentas, Glen Burnie, USA, markers/. Специфичность выявляемого сигнала подтверждали отсутствием продукта амплификации ожидаемого размера в параллельных пробах, где на стадии обратной транскрипции фермент не добавлялся.
Фотографии гель-электрофореза продуктов ПЦР были оцифрованы при помощи программы
ImageQuant (Molecular Dynamics, Sunnyvale, USA) и результаты представлены в произвольных единицах. Иерархическое двухмерное кластерирование данных ОТ-ПЦР проводили при помощи программы Майкла Эйзена «Gene Cluster v3». Результаты визуализировали с помощью программы «Tree View» [2] .
Результаты и обсуждение
Проведено исследование клеточных линий, полученных от больных с диссеминированной меланомой [1]. Исследована экспрессия опухолевыми клетками четырех дифференци-ровочных антигенов меланомы (ДАМ) и 15 раково-тестикулярных генов (РТА), а также контрольные гены – HLA-G, HLA-E, GAPDH. На рис. 1 приведены электрофореграммы продуктов ОТ-ПЦР анализа ряда генов, по два представителя от каждой группы генов, выявленных с помощью кластерного анализа.
Изучение цитоморфологических особенностей меланомных клеток и определение степени дифференцировки были осуществлены для 16 из этих клеточных культур. Для этого определяли тип и размер клеток, форму и контур ядра, характер ядерной мембраны, строение хроматина и его окрашиваемость, наличие ядрышек, количество гигантских многоядерных клеток и долю клеток, находящихся в митозе. При цитологической верификации выделено 9 культур, состоящих из эпителиоподобных клеток (E), различного уровня дифференцировки, три культуры из невусоподобных клеток (N), одна культура из веретенообразных клеток (V) и три культуры смешанного клеточного состава.
При цитоморфологическом исследовании выделено три группы, классифицированные как высокодифференцированные (H), умереннодифференцированные (I) и низкодифференцированные (L) (табл. 2). Высокодифференцированные (H, 1) клеточные линии Mel min-12, Mel min-11 (рис. 2а) представлены относительно мономорфными клетками небольшого размера, с небольшим количеством гигантских многоядерных клеток; митозы практически отсутствуют. Модальное число хромосом в обеих клеточных линиях соответствовало околодиплоидному набору (46-49 хромосом в клетках культуры Mel min-11 и 47-50 хромосом в Mel min-12). Общее число хромосомных повреждений на 1 клетку составило в одной культуре 4, а во второй – 5. Умереннодифференцированные (I, 2 ) клеточные линии Mel min-9, Mel IL, Mel P, Mel min-10 (рис. 2б.) представлены полиморфными клетками: мелкими, средними и крупными; с интенсивно
Рис. 1. Электрофореграммы продуктов ОТ-ПЦР анализа генов.
ОТ-ПЦР анализ уровня транскрипции 22 генов в 6 клеточных линиях меланомы: Mel min-12, Mel min-10, Mel IL, Mel min-14, Mel min-1, Mel Ibr. Уровень экспрессии анализировался для генов: 1 – BAGE; 2 – GAGE2; 3 – GAGE3; 4 – GAGE4; 5 – HLA-E;
6 – MAGEA2; 7 – MAGEA4; 8 – MAGEA6; 9 – MAGEA10; 10 – MAGEA12; 11 – MAGEB1; 12 – MAGEB2; 13 – MAGEC1;
14 – MLANA; 15 – CTAG1B; 16 – TYR; 17 – SILV; 18 – S100B; 19 – MAGEA1; 20 – MAGEA3; 21 – HLA-G; 22 – GAPDH.
23 – контрольный ОТ-ПЦР без добавления праймеров – T – обратная транскрипция с ферментом, N – обратная транскрипция без фермента. M – маркёр длины ДНК, длины фрагментов даны в парах нуклеотидов
базофильной цитоплазмой, без четких контуров или с фестончатыми краями с эксцентрично или центрально расположенными ядрами с грубоглыбчатым гиперхромным хроматином и одним, редко двумя-тремя ядрышками. Гигантские многоядерные клетки немногочисленны; умеренное количество клеток в митозе. Число хромосомных аномалий в культурах было от 5 до 8 на 1 клетку.
Низкодифференцированные (L, 3) клеточные линии (Mel Kor, Mel min-2, Mel min-1, Mel min-3, Mel min-4, Mel Ibr, Mel min-5, Mel min-6, Mel min-7, Mel min-8) представлены резкополиморфными клетками, с множеством гигантских уродливых клеток и ядер. Выявлено большое количество округлых, овальных, удлиненных, неправильных ядер с неровными контурами. Хроматин грубоглыбчатый, ядерная оболочка утолщена и неровная; ядрышки в количестве от одного до шести в ядре; выраженная гипер-хромия. Отмечены атипичные многочисленные митозы. В пяти культурах модальное число хромосом соответствовало триплоидному набору, в двух – тетраплоидному и две были околодиплоидными. Число хромосомных аномалий во всех низкодифференцированных культурах было больше 5 на 1 клетку, в частности, в диплоидной культуре Mel min-2 оно достигло 11. Обнаружен также высокий уровень нестабильных хромосомных аберраций: хроматидные обмены, ди- и трицентрические хромосомы, кольцевые хромосомы, клетки с множественными аберрациями. Среди крайне разнообразных числовых и структурных хромосомных нарушений (транслокации, делеции, дупликации, инверсии, кольцевые хромосомы, изохромосомы, маркерные хромосомы) некоторые встречались с высоким постоянством, в том числе трисомия по хромосоме 7 или по ее короткому плечу, трисомия по короткому плечу хромосомы 6, моносомия по короткому плечу хромосомы 9, различные транслокации с участием хромосомы 1. Пример культуры клеток Mel min-5, состоящей приблизительно поровну из веретенообразных и эпителиальных клеток, показан на рис. 2в.
Исследования экспрессии генов РТА и ДАМ и последующий двумерный иерархический кластерный анализ данных ОТ-ПЦР позволили
Рис. 2. Морфологические типы культур меланомы:
а) высокодифференцированная клеточная линия Mel min-11, х400;
б) умереннодифференцированная клеточная линия Mel IL, х400;
в) низкодифференцированная клеточная линия Mel min-5, х400
Таблица 2
Морфогенетическая характеристика клеточных линий метастатической меланомы человека
|
Степень дифференцировки опухолевых клеток |
Число линий |
Имя линии |
Тип* линии |
F* |
№ кластера |
Экспрессия генов кластера. Среднее по кластеру ** |
|||||
|
G1a |
G1b |
G1c |
G2a |
G2c |
|||||||
|
Высокодифференцированные |
2 |
Mel min-11 |
H |
1 |
E |
1 |
70 |
37 |
59 |
185 |
1590 |
|
Mel min-12 |
H |
1 |
V,E |
1 |
55 |
24 |
35 |
19 |
1374 |
||
|
Умереннодиффференциро-ванные |
4 |
Mel min-10 |
I |
2 |
E |
2 |
115 |
606 |
163 |
468 |
64 |
|
Mel IL |
I |
2 |
V |
3 |
76 |
447 |
53 |
881 |
1259 |
||
|
Mel P |
I |
2 |
E |
3 |
27 |
207 |
118 |
1429 |
1360 |
||
|
Mel min- 9 |
I |
2 |
N |
||||||||
|
Низкодифференцированные |
10 |
Mel min- 5 |
L |
3 |
V,E |
4 |
937 |
37 |
826 |
1459 |
689 |
|
Mel min- 8 |
L |
3 |
E |
4 |
99 |
1204 |
1328 |
1585 |
1427 |
||
|
Mel Kor |
L |
3 |
E |
5 |
48 |
306 |
1100 |
1078 |
947 |
||
|
Mel min- 1 |
L |
3 |
V |
5 |
16 |
1211 |
995 |
1569 |
1570 |
||
|
Mel min- 2 |
L |
3 |
E |
5 |
668 |
995 |
342 |
1201 |
1413 |
||
|
Mel min- 3 |
L |
3 |
E |
5 |
20 |
782 |
573 |
1300 |
1496 |
||
|
Mel Ibr |
L |
3 |
N |
6 |
511 |
940 |
1115 |
1397 |
123 |
||
|
Mel min- 4 |
L |
3 |
E |
6 |
56 |
686 |
1046 |
1196 |
55 |
||
|
Mel min- 6 |
L |
3 |
E |
6 |
22 |
605 |
583 |
1206 |
36 |
||
|
Mel min- 7 |
L |
3 |
E |
6 |
220 |
744 |
848 |
1595 |
50 |
||
|
Коэффициент корреляции по Спирману по отношению к морфологическому типу клеток |
Х |
№ кластера |
G1a |
G1b |
G1c |
G2a |
G2c |
||||
|
0.92 |
0.31 |
0.65 |
0.79 |
0.87 |
-0.34 |
||||||
|
Коэффициент корреляции по Пирсону по отношению к экспрессии ДАМ генов (G2c). |
|||||||||||
|
-0.19 |
-0.09 |
-0.25 |
-0.14 |
Х |
|||||||
Примечание: тип * – морфологический тип клеточных линий ранжирован в порядке убывания степени дифференцированности клеток, используя буквенный и цифровой коды: H=1 – мономорфные клетки; небольшое количество клеток в митозе; небольшое количество гигантских, многоядерных клеток; I=2 – клетки мелких, средних и крупных размеров; с интенсивно-базофильной цитоплазмой, без четких контуров или с фистончатыми краями с эксцентрично или центрально расположенными ядрами с грубоглыбчатым гиперхромным хроматином и одним, редко двумя-тремя ядрышками. Гигантские многоядерные клетки немногочисленны; умеренное количество клеток в митозе; L=3 – округлые, овальные, удлиненные, неправильные ядра с неровными контурами. Хроматин грубоглыбчатый, ядерная оболочка утолщена и неровная; ядрышки в количестве от одного до 6 в ядре; выраженная гиперхромия и много гигантских уродливых клеток и ядер. Отмечаются атипичные относительно многочисленные митозы. F* – форма основной части клеток линии: e – эпителиоподобная, v – веретенообразная, n – невусоподобная.
** – произвольные единицы (см. раздел «Материал и методы»)
выделить шесть групп клеточных линий (рис. 3). Культуры клеток, отнесенные к кластеру 1, являются высокодифференцированными, к кластерам 2 и 3 – умереннодифференцированными, тогда как к кластерам 4, 5 и 6 – низкодифференцированными. Сопоставление «морфологических» и «генетических» групп, представленных в табл. 2, указывает на отчетливую корреляцию между делением клеточных культур в соответствии с экспрессий РТА и ДАМ генов и классификацией культур по степени их дифференцировки. Коэффициент корреляции между морфологическими ранжироваными данными и кластерным ранжировнием экспрессионных данных составляет 0,92. Степень дифференцировки клеток, как графически отображено на
Рис. 3. Двумерный кластерный анализ экспрессии генов РТА и ДМА методом ОТ-ПЦР в культурах клеток меланомы.
Представлены результаты полносвязного кластерирования (по обоим направлениям) данных по экспрессии 22 генов в 21 культуре клеток, полученных от пациентов с диссеминированной меланомой. Кластерированию подвергался весь набор логарифмированных по основанию 2 данных ОТ-ПЦР, нормированных для каждой культуры на среднюю величину интенсивности полос ОТ-ПЦР генов HLA-G1, HLA-E и GAPDH для каждой клеточной линии. Никакой последующей центровки или нормировки данных не производилось. Для расчета меры несходства узлов дендрограмм использовалась корреляция по Спирману или эвклидово расстояние и коэффициент корреляции Пирсона, с одинаковым результатом.
Цветовая шкала, приведенная на двумерной кластерной картине и на врезке, соответствует исходной интенсивности полос на электрофореграммах, а не их логарифмированному преобразованию, использованному для расчета связности при кластерировании. Гены обозначены символами в соответствии с табл. 1, культуры клеток – с табл. 2. Шкалы коэффициентов корреляции генов (слева) и культур клеток (сверху) отвечают корреляции для узлов дерева. Для дендрограмм использованы коэффициенты корреляции по Пирсону.
При кластерировании для зондов генов с вырожденной специфичностью использованы весовые коэффициенты, обратно пропорциональные числу зондов, соответствующих их вырожденности: для GAGE-1-8 и GAGE-4-7 – 0,5; для MG-A3, MG-A2, MG-A6, MG-A12-236 – 0,25; HLA-G и HLA-A – 0,5. Дендрограмма культур клеток однозначно разбивает все клеточные линии на 6 групп, отсеченных по коэффициенту корреляции 0,75
рис. 3, падает слева направо, сопровождается ростом числа и степени экспрессии генов РТА. При этом форма клеток, эпителиальная, веретенообразная или невусоподобная, не коррелирует ни со степенью дифференцированности клеток, ни с экспрессией РТА (табл. 2.). Интересно отметить, что экспрессия ДАМ генов, в значительной степени изменяющаяся от кластера к кластеру (например, 1 и 2 или 5 и 6), не коррелирует ни со степенью дифференцировки клеток, ни с их формой, ни с активностью генов РТА.
Дендрограмма коэффициента корреляции групп генов (рис. 3, левая сторона) показывает распределение всех исследованных генов на 6 основных групп: G1a, G1b, G1c и G2a принадлежат раково-тестикулярным генам, G2b – генам главного комплекса гистосовместимости и генам домашнего хозяйства, а G2c – дифференцировоч-ным генам. Отдельного внимания заслуживают гены S100B, показывающие менее чем 75 % корреляцию с другими ДАМ генами, и ген CTAG1B (NY-ESO1), также отличающийся по экспрессии от ближайшего к нему семейства РТА генов (MAGEA1, MAGE-A10, MAGE-C1 & BAGE). Как видно из рис. 3, высокодифференцированные клетки практически не экспрессируют никаких РТА, крайне низка экспрессия РТА и в клеточных культурах 16 и 10, принадлежащих кластеру 2, полностью утративших активность генов ДАМ и отнесенных к группе умереннодифференцированных клеток. У этой группы клеточных культур, утратившей способность к синтезу мРНК генов ДАМ, наблюдается некоторая невысокая активность кластера генов G2a (ампликоны MG-A2, MG-A3, MG-A6 и MG-A12-236, отражающие экспрессию группы высокогомологичных генов MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A12), но она все же заметна и проявляется систематически. В кластерах 3, 4, 5 и 6 активность этой группы генов очень велика (рис.3). Активность группы генов G1b и G1c систематически проявляется только в низкодифференцированных культурах. Тогда как активность генов MAGE-B1 и MAGE-B2, принадлежащих группе G1а, проявляется только спорадически во всех клеточных линиях. Корреляции между морфологическими данными и уровнем экспрессии генов всех обсуждаемых групп генов суммированы в табл. 2. Видно, что активность генов в группах G1а и
Таблица 3
Корреляция между экспрессией генов, определенной ОТ-ПЦР и иммунологически
|
Экспрессия антигенов |
Экспрессия ДАМ генов** |
Усредненная по кластерам экспрессия генов** |
||||||||||||||
|
Имя линии |
s о s у s s о 4 о G в f |
У g * P< S P G s |
1 |
(L> O ё |
■5? к |
Рн tzi U | К |
< z 2 |
ей > н |
5 GO |
О GO |
PU сЗ и |
о |
рц о |
рц сЗ О1 о |
S 1 О |
|
|
Mel min-18 |
1 |
1534 |
1093 |
1800 |
86 |
60 |
27 |
23 |
40 |
1476 |
||||||
|
Mel min-12 |
H |
1 |
1 |
1 |
0 |
1 |
10.5 |
1305 |
1333 |
1483 |
971 |
55 |
24 |
35 |
19 |
1374 |
|
Mel min-11 |
H |
1 |
1 |
0 |
1 |
1 |
62.0 |
1548 |
1705 |
1516 |
921 |
70 |
37 |
59 |
185 |
1590 |
|
Mel min-16 |
2 |
55 |
27 |
39 |
36 |
227 |
45 |
74 |
285 |
40 |
||||||
|
Mel min-10 |
I |
2 |
2 |
0 |
0 |
0 |
11.7 |
20 |
16 |
156 |
101 |
115 |
606 |
163 |
468 |
64 |
|
Mel Il |
I |
2 |
3 |
1 |
1 |
1 |
46.9 |
1150 |
1374 |
1255 |
556 |
76 |
447 |
53 |
881 |
1259 |
|
Mel P |
I |
2 |
3 |
0 |
0 |
1 |
89.5 |
1121 |
1537 |
1421 |
925 |
27 |
207 |
118 |
1429 |
1360 |
|
Mel min- 9 |
I |
2 |
1 |
0 |
1 |
4.8 |
||||||||||
|
Mel min-17 |
3 |
110 |
1632 |
1829 |
589 |
31 |
454 |
224 |
1257 |
1190 |
||||||
|
Mel min- 8 |
L |
3 |
4 |
0 |
0 |
0 |
67.6 |
522 |
1246 |
1074 |
1354 |
48 |
306 |
1100 |
1078 |
947 |
|
Mel min-15 |
4 |
18.0 |
1576 |
1687 |
1314 |
636 |
94 |
66 |
586 |
1228 |
1526 |
|||||
|
Mel min- 5 |
L |
3 |
4 |
0 |
1 |
1 |
3.8 |
255 |
531 |
1280 |
172 |
937 |
37 |
826 |
1459 |
689 |
|
Mel min-14 |
4 |
0 |
85 |
401 |
114 |
45 |
250 |
189 |
359 |
1527 |
200 |
|||||
|
Mel min- 2 |
L |
3 |
5 |
1429 |
1353 |
1457 |
785 |
668 |
995 |
342 |
1201 |
1413 |
||||
|
Mel min- 3 |
L |
3 |
5 |
1551 |
1519 |
1419 |
1011 |
20 |
782 |
573 |
1300 |
1496 |
||||
|
Mel min- 1 |
L |
3 |
5 |
0 |
0 |
1 |
35.7 |
1579 |
1565 |
1565 |
702 |
16 |
1211 |
995 |
1569 |
1570 |
|
Mel Kor |
L |
3 |
5 |
1 |
1 |
1 |
64.8 |
1503 |
1438 |
1340 |
997 |
99 |
1204 |
1328 |
1585 |
1427 |
|
Mel Ibr |
L |
3 |
6 |
0 |
0 |
0 |
25.3 |
27 |
90 |
251 |
864 |
511 |
940 |
1115 |
1397 |
123 |
|
Mel min-13 |
6 |
0 |
0 |
0 |
91.8 |
15 |
76 |
106 |
809 |
114 |
885 |
1076 |
1264 |
66 |
||
|
Mel min- 4 |
L |
3 |
6 |
30 |
30 |
104 |
1006 |
56 |
686 |
1046 |
1196 |
55 |
||||
|
Mel min- 7 |
L |
3 |
6 |
0 |
0 |
0 |
74 |
35 |
40 |
12 |
220 |
744 |
848 |
1595 |
50 |
|
|
Mel min- 6 |
L |
3 |
6 |
0 |
0 |
0 |
27 |
31 |
50 |
395 |
22 |
605 |
583 |
1206 |
36 |
|
|
KK * |
х |
0.92 |
-0.35 |
-0.12 |
-0.45 |
0.04 |
-0.33 |
-0.36 |
-0.32 |
-0.08 |
0.31 |
0.65 |
0.79 |
0.87 |
-0.34 |
|
|
х |
0.54 |
0.45 |
0.44 |
0.27 |
-0.23 |
0.03 |
-0.17 |
-0.30 |
0.49 |
|||||||
|
х |
0.43 |
0.41 |
0.50 |
-0.024 |
0.31 |
-0.21 |
-0.1 |
-0.08 |
0.45 |
|||||||
|
х |
0.85 |
0.81 |
0.91 |
0.21 |
0.02 |
-0.28 |
-0.35 |
-0.14 |
0.88 |
|||||||
|
х |
0.08 |
0.19 |
-0.019 |
0.59 |
-0.47 |
0.22 |
0.16 |
0.24 |
0.09 |
|||||||
Примечание: KK* – коэффициент корреляции между отмеченным крестом столбцом и уровнем экспрессии гена или кластера генов.
** – произвольные единицы (см. раздел «Материал и методы»)
G2с не коррелирует с морфологической классификацией линий клеток, тогда как активность РТА генов групп G1b G1c и G2a имеет высокую степень корреляции с морфологической классификацией.
Ранее клеточные линии были охарактеризованы по экспрессии дифференцировочных антигенов меланомы [1]. Для этого использовались следующие маркеры меланомы: моноклональные антитела к HMB45 и HMW, – распознающие соответственно в незрелых меланоцитах белок gp100/PMEL17, продукт гена SILV, и MCSP – высокомолекулярный ме-ланомный хондроитин-сульфатный протеогликан (melanoma chondroitin sulfate proteoglycan). Также были использованы антитела к Tyrosinase и MelanA/МART-1 – продуктам генов TYR и MLANA соответственно, которые, так же как и продукт гена SILV, являются компонентами меланосом. В табл. 3 продемонстрированы результаты сравнения иммунологических данных с результатами измерения концентрации мРНК. Отмечено отсутствие корреляции между результатами морфологического исследования и любыми иммунологическими измерениями; наиболее значимая величина получается для антикорреляции HMW антител и не превышает 0,45. Соответственно, и активность ни одного из ДАМ генов, ни РТА генов группы G1a не коррелирует с морфологическими данными. Напротив, активность генов групп G1c и G2a коррелирует с морфологическими данными с коэффициентом более 0,75. Иммунологические данные для MelanA не имеют высокой корреляции с экспрессией гена MLANA (0,54), тогда как иммунологические данные для НМВ45 имеют высокую степень корреляции с активностью гена SILV (0,91). Необходимо также отметить высокую степень корреляции данных для НМВ45 с экспрессией других компонент меланосом, которые почти синхронно проявляются в различных линиях (рис.3). Неожиданно высоким оказался коэффициент корреляции экспрессии гена S100B и антигена HMW.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что между степенью дифференцировки клеточной культуры и уровнем экспрессии РТА генов существует корреляция, определяемая, вероятно, частотой митозов. Соответствующие коэффициенты корреляции между степенью дифференцированности, уровнем экспрессии генов групп G1а, G1в, G1c, G2a, G2c и морфологическим типом равны соответственно 0,3, 0,65, 0,79, 0,87 и – 0,34 (табл. 3). Следует также отметить отсутствие корреляции между экспрессией генов ДАМ и РТА (коэффициент корреляции варьирует между 0,25 и 0,09) (табл. 2), а также между экспрессией генов ДАМ и степенью дифференцировки клеток в культуре (коэффициент корреляции – 0,34).
Таким образом, наличие корреляции между уровнем экспрессии раково-тестикулярных генов и степенью дифференцировки клеток предоставляет возможность количественно оценить степень злокачественности опухолевых клеток меланомы и дать более точный клинический прогноз течения заболевания и дальнейший выбор лечения.
Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства г. Москвы в рамках научно-технической программы «Разработка и внедрение в медицинскую практику новых методов и средств диагностики и лечения онкологических и других заболеваний».
