Экспрессия рецептора к белку программированной гибели клеток PD-1 и его лиганда PD-L1 при серозном раке яичников High-Grade

Введение. Злокачественные опухоли яичников составляют 25 % от всех злокачественных новообразований женских половых органов, чаще выявляются на III–IV стадии и имеют высокие показатели летальности, несмотря на агрессивные хирургические подходы и разнообразие противоопухолевой лекарственной терапии [1, 2]. Средний возраст пациенток с впервые выявленным диагнозом составляет 55 лет. В структуре злокачественных новообразований яичников на эпителиальные формы рака яичников приходится до

90 % случаев, из них 70 % составляют серозные карциномы high-grade и low-grade [3].

Ингибирующие иммунологические контрольные точки (чекпойнт-ингибиторы) – это система связанных с сигнальными путями ингибиторных механизмов, регулирующих активацию и модуляцию иммунного ответа. Они способны ограничивать неадекватное распознавание иммунными клетками нормальной ткани и препятствовать запуску аутоиммунных реакций. К представителям системы иммунологических чекпойнтов относят рецептор про- граммированной клеточной гибели PD-1 и его лиганд PD-L1, ген активации лимфоцитов LAG-3, гликопротеин цитотоксических Т-кле-ток CTLA-4, а также белок-3, содержащий Т-клеточный Ig и муцин TIM-3. С помощью иммунологических контрольных точек клетки опухолей способны ускользать от иммунного ответа, приобретая тем самым устойчивость к действию иммунной системы [1, 4].

Рецептор PD-1 имеет два лиганда – PD-L1 (B7-H1, CD274) и PD-L2 (B7-DC, CD273), которые относятся к семейству CD28, и экспрессируется на активированных Т- и В-лимфоци-тах, моноцитах, NK-клетках [5]. PD-L1 экспрессируется на макрофагах, поверхности Т- и В-лимфоцитов, дендритных клеток, эндотелиальных клеток сердца, гемопоэтических, эпителиальных, глиальных клеток, клеток плаценты, паренхиматозных клеток (β-клеток поджелудочной железы, эндотелиально-сосудистых клеток) [6]. PD-L1 препятствует развитию аутоиммунных реакций, содействует диф-фе-ренцировке наивных клеток CD4+ в индуцируемые CD4+FOXP3+Treg [7, 8]. PD-L1 является продуктом гена CD274, который располагается на 9-й хромосоме. Контроль активности данного гена осуществляется за счет участия регуляторного фактора интерферона-1 (IRF-1) и транскрипционного фактора STAT1 [9].

PD-L2 в норме экспрессируется на дендритных клетках и активированных макрофагах [10].

Активация PD-1/PD-L1-пути является одним из важнейших механизмов обеспечения иммуносупрессии при злокачественных опухолях. Рецептор PD-1 и его лиганд – перспективные терапевтические мишени и предикторы эффективности анти-PD-1/PD-L-имму-нотерапии [11, 12]. Данные иммунные контрольные точки изучают в качестве молекулярных маркеров общего прогноза течения опухолевых заболеваний и выживаемости. В частности, существуют исследования, демонстрирующие негативное влияние их повышенной экспрессии на клиническое течение некоторых видов опухолей [13–15]. Выявлена взаимосвязь экспрессии рецептора PD-1 и/или его лиганда PD-L1 с метастазированием и степенью злокачественности рака яичников

[16, 17]. Также выявлена взаимосвязь с мутациями генов BRCA1/2, TP53 и микросателлит-ной нестабильностью, которая определяется в качестве маркера чувствительности опухоли к анти-PD-1/PD-L-терапии [18, 19].

Осуществляется все больше серьезных попыток применения данной терапии моноклональными антителами при раке яичников, в т.ч. резистентном к цитостатическим противоопухолевым препаратам [20–22].

Цель исследования. Определить зависимость уровня экспрессии рецептора PD-1 и его лиганда PD-L1 от степени пролиферативной активности клеток рака яичников.

Материалы и методы. Исследование выполнено в ФГБОУ ВО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Минздрава России на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории. Материал взят в ГБУЗ «Приморский краевой онкологический диспансер» в период с 2016 по 2021 г. Проведен анализ патологоанатомического материала 74 пациенток с серозным раком яичников highgrade (код по МКБ: С56) с использованием антител p53, Ki-67, PD-L1, Anti-Hu CD279 (PD-1). Средний возраст женщин составлял 57±11 лет. В сравнительную группу вошли 26 пациенток с доброкачественными опухолями яичников и отсутствием тяжелой сопутствующей патологии. Их средний возраст составлял 54±13 лет.

Для иммуногистохимического анализа срезы, зафиксированные на стекле с адгезивным покрытием, дважды депарафинизировались в ксилоле по 3 мин, дважды дегидрировались в 96 % этаноле по 3 мин, 80 % спирте 3 мин, 70 % спирте 3 мин и затем помещались в дистиллированную воду на 3 мин.

Для температурной активации и протеолитической обработки проводилась демаскировка антигена (эпитопов), восстанавливающая иммунореактивность иммуногена. Для этого срезы помещались в цитратно-натрие-вый буфер (Antigen Retrieval Buffer pH 6.0) и ставились в микроволновую печь мощностью 700 Вт на 4 мин.

Затем стекла со срезами промывались 2 раза в Tris-HCl-буфере (0,5 % TWEEN®20, pH 7.6) по 5 мин. Буфер обновлялся после каждой промывки.

Для снижения вероятности появления ложноположительных реакций наносился раствор, блокирующий активность типичных для тканей неспецифических эндогенных пероксидаз и предотвращающий связывание с ними молекул DAB-Chromogen и возникновение за счет этого неспецифической окраски – Hydrogen Peroxide Block (Spring bioscience). Проводилась инкубация во влажной камере в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем срезы снова дважды промывались в Tris-HCl-буфере по 5 мин.

В целях предотвращения смешивания антител срезы протирались для удаления излишек буфера, но оставлялись влажными и отделялись друг от друга гидрофобным карандашом.

Для предотвращения возникновения неспецифического фонового окрашивания в результате связывания специфических первичных антител с компонентами опухолевой ткани за счет гидрофобных и электролитических взаимодействий наносилась неиммунная сыворотка, блокирующая активность неспецифических белков (Protein Block, pH 7.6, Spring bioscience), но при этом не влияющая на взаимодействие первичных антител с антигенами. Затем происходила инкубация в течение 10 мин во влажной камере с последующими двумя промывками по 5 мин.

Далее наносились первичные (специфические) антитела. Для исследования рецептора PD-1 выжидалось время до полного высыхания антител. Затем срез заключался под стекло с использованием геля Fluoromount Aqueous Mounting Medium (Sigma). Для исследования белков Ki-67, p53 и лиганда PD-L1 наносились соответствующие специфические антитела и срезы инкубировались 24 ч при +4 °С в холодильной камере.

По истечении времени инкубации срезы промывались по 4 раза в Tris-HCl-буфере, после чего наносились вторичные биотилизиро-ванные поливалентные антитела козы (Biotinylated Goat Anti-Polyvalent, Spring bioscience) и проводилась инкубация во влажной камере в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем срезы промывались 4 раза в Tris-HCl буфере. Далее наносились меченные пероксида- зой антитела против стрептавидина (Streptavidin Peroxidase, Spring bioscience) и проводилась 10-минутная инкубация и промывка. Потом наносилась смесь хромогена и DAB-субстрата в соотношении 1:5 и проводилась инкубация в течение 1–2 мин с последующей промывкой. Для визуализации ядер на 20–120 с наносился гематоксилин Майера (BioVitrum), после чего срезы дважды промывались в дистиллированной воде и обезвоживались в 96 % спирте.

Морфометрический анализ экспрессии белков p53, Ki-67, рецептора PD-1 и его лиганда PD-L1 проводился с помощью микроскопического метода. Использовались микроскопы Axio Zeiss Scope. A1 с камерой Olympus DP74 и Olympus CX41 с камерой U-TV0.35XC-2.

Для оценки экспрессии PD-1 и PD-L1 подсчитывалось отношение клеток с позитивным окрашиванием мембраны к общему количеству клеток (TPS – tumor proportion score), результат выражался в пикселях.

Подсчет количества клеток с позитивным окрашиванием и общего количества клеток осуществлялся с помощью программы NIS-Elements BR. Для этого в программу добавлялся снимок препарата через окно «Файл» и «Открыть». После выбора нужного изображения через окно «Бинарное» выбиралось «Определить порог». После этого на экране красным цветом выделялись необходимые для подсчета области. Затем бинарное изображение копировалось в «ROI». И в окне «Измерить» выбиралось «Измерить поле и ROI». Программа, проанализировав количество клеток, открывала таблицу с цифровыми значениями, которая экспортировалась в программу Microsoft Excel. В данной программе вычислялись средние значения по 10 изображениям препаратов для каждого из пациентов и среднее отклонение.

Полученные значения были подвергнуты математической и статистической обработке в программах Microsoft Exсel 2016 и STATISTICA 12.0 (StatSoft Inc., США).

Проверка на нормальность распределения полученных сравниваемых групп осуществлялась с помощью критерия нормальности Шапиро – Уилка и критерия согласия Колмого- рова (Колмогорова – Смирнова). В дополнение к этому проверка гипотезы о нормальном распределении выборки проводилась с помощью построения гистограммы эмпирических частот, теоретической кривой и нормального вероятностного графика при их визуальном оценивании.

Поскольку все выборки демонстрировали ненормальное распределение, то определялась медиана и квартальные размахи. Для оценки статистической значимости распределений применялись U-критерий Манна – Уитни, критерий серий Вальда – Вольфовица и двухвыборочный критерий Колмогорова – Смирнова. Для выявления взаимосвязи между экспрессией рецептора PD-1, его лиганда PD-L1, маркера Ki-67, белка p53 и стадией рака яичников, степенью его дифференцировки применялся непараметрический критерий Краскела – Уоллиса. Различия считались статистически значимыми при уровне значимости p<0,05.

Результаты. По клинической стадии больные раком яичников были разделены на пациентов с I стадией – 8 (11 %) чел., со II стадией – 9 (12 %) чел., с III стадией – 31 (42 %) и с IV стадией – 26 (35 %). Значения шкалы ECOG у 70,8 % пациентов составляли 0–1, у 29,2 % больных – 2–3.

При иммуногистохимических исследованиях экспрессия белка PD-1 и его лиганда PD-L1 обнаружена на поверхности мембраны клеток у всех пациентов, в т.ч. и в группе сравнения. Наблюдались статистически значимые снижение экспрессии белка PD-1 и рост экспрессии лиганда PD-L1 при увеличении стадии рака яичников (p<0,001), что подтверждено с помощью критерия Краскела – Уоллиса (H-критерия) (табл. 1, рис. 1). Предположительно, данная зависимость связана с возможным развитием анергии или истощения иммунных клеток вследствие влияния на них опухолевых клеток.

Таблица 1

Table 1

Экспрессия PD-1 и PD-L1

в зависимости от стадии серозного рака яичников high-grade

При иммуногистохимическом анализе рецептора PD-1 положительная реакция была представлена флюоресцентным зеленым свечением мембраны иммунных клеток (рис. 2).

Положительная реакция на лиганд PD-L1 проявлялась в виде красно-коричневого окрашивания мембраны опухолевых клеток (рис. 3).

PD-1/PD-L1 expression by the stage of high-grade serous ovarian cancer

Стадия рака яичников Ovarian cancer stage	n	Показатель экспрессии маркеров Indicator of marker expression
		PD-1	р	PD-L1	р
I стадия Stage 1	8	852 (785,2; 1047,0)	<0,001 (1; 2–5)	149,5 (66,5; 254,0)	<0,001 (1; 2–5)
II стадия Stage2	9	841 (647,0; 894,0)	<0,001 (2; 1, 3–5)	277 (219,0; 475,0)	<0,001 (2; 1, 3–5)
III стадия Stage 3	31	486 (291,5; 608,5)	<0,001 (3; 1, 2, 4, 5)	605 (552,5; 703,5)	<0,001 (3; 1, 2, 4, 5)
IV стадия Stage 4	26	287,5 (185,2; 351,2)	<0,001 (4; 1–3, 5)	837,5 (753,0; 1011,5)	<0,001 (4; 1–3, 5)
Группа сравнения Comparison Group	26	1269,5 (1211,7; 1305,2)	<0,001 (5; 1–4)	70,5 (43,5; 118,5)	<0,001 (5; 1–4)

Стадия рака яичников – Ovarian cancer stage

Рис. 1. Экспрессия рецептора PD-1 в зависимости от стадии эпителиального рака яичников high-grade

Fig. 1. PD-1 expression by the stage of epithelial ovarian cancer

А / A                                     Б / B

Рис. 2. Высокопозитивная реакция на наличие антигена PD-1 в тканях опухоли при серозном раке яичников high-grade:

А – фокальный пятнистый паттерн экспрессии PD-1 на инвазивном крае опухоли;

Б – цитоплазматическая локализация и иммунореактивность мембран клеток микроокружения. Иммуногистохимическое окрашивание антителами, меченными флуорохромом Alexa Fluor® 488

Fig. 2. Highly positive reaction to PD-1 in tumor tissues in high-grade serous ovarian cancer:

A – focal spotty pattern of PD-1 expression on the invasive tumor edge;

B – cytoplasmic localization and immunoreactivity of microenvironment cell membranes. Immunohistochemical staining with fluorochrome, Alexa Fluor ® 488

А / A

Б / B

Рис. 3. Реакция на наличие антигена PD-L1 в тканях опухоли при серозном раке яичников high-grade: А – позитивная реакция низкой степени PD-L1; Б – фокальный пятнистый паттерн высокой экспрессии PD-L1. Иммуногистохимическое окрашивание, окраска ядер гематоксилином Майера

Fig. 3. Response to PD-L1 in tumor tissues in high-grade serous ovarian cancer:

A – low-grade positive PD-L1; B – focal patchy pattern of high PD-L1 expression. Immunohistochemical staining, Mayer’s hematoxylin nuclei staining

Окрашивание мембраны опухолевых клеток в красно-коричневый цвет связано прежде всего с тем, что лиганд PD-L1 продуцируется клетками опухоли и участвует в механизмах ускользания от иммунного ответа.

При иммуногистохимическом исследовании положительная реакция на белок p53 проявлялась окрашиванием ядер опухолевых клеток в красно-коричневый цвет (рис. 4).

Рис. 4. Положительная реакция на белок p53 в тканях опухоли при серозном раке яичников high-grade. Иммуногистохимическое окрашивание, окраска ядер гематоксилином Майера

Fig. 4. Positive reaction to p53 protein in tumor tissues in high-grade serous ovarian cancer. Immunohistochemical staining, Mayer’s hematoxylin nuclei staining

Анализ показал, что при доброкачественной опухоли маркеры p53 и Ki-67 не обнаруживаются. При увеличении стадии серозного рака яичников high-grade их экспрессия стати-

стически значимо увеличивается (табл. 2). Наблюдалось заметное повышение количества данного биологического маркера при увеличении стадии рака яичников (рис. 5).

Таблица 2

Table 2

Экспрессия маркеров Ki-67 и p53 в зависимости от стадии серозного рака яичников high-grade

Ki-67 and p53 expression by the stage of high-grade serous ovarian cancer

Стадия рака яичников Ovarian cancer stage	n	Показатель экспрессии маркеров Indicator of marker expression
		Ki-67	p	p53	p
I	8	676 (132,7; 771,7)	<0,001 (1; 2–5)	201,5 (160,7; 238,0)	<0,001 (1; 2–4)
II	9	392 (295,0; 714,0)	<0,001 (2; 1, 3–5)	283 (227,0; 309,0)	<0,001 (2; 1, 3–4)
III	31	781 (681,5; 1054,0)	<0,001 (3; 1, 2, 4, 5)	590 (534,5; 696,5)	<0,001 (3; 1, 2, 4)
IV	26	989 (867,0; 1168,0)	<0,001 (4; 1–3, 5)	889 (771,7; 924,0)	<0,001 (4; 1–3)
Группа сравнения Comparison Group	26	70,5 (31,5; 94,2)	<0,001 (5; 1–4)	-	-

Boxplot by Group

I стадия –      II стадия –    III стадия – IV стадия –

Stage 1         Stage2         Stage 3        Stage 4

□ Median

□ 25%-75%

I Min-Max

Стадия рака яичников – Ovarian cancer stage

Рис. 5. Экспрессия маркера p53 в зависимости от стадии эпителиального рака яичников

Fig. 5. p53 expression by the stage of epithelial ovarian cancer

Критерий Краскела – Уоллиса продемонстрировал статистически значимую зависимость роста экспрессии p53 от увеличения стадии рака яичников и дифференцировки опухоли (р<0,001).

Эти закономерности объясняются активным участием p53 в клеточном цикле и развитии апоптоза. В результате мутации данного гена клетки входят в клеточный цикл с дефектной ДНК и их дальнейшее деление становится неуправляемым.

Экспрессия биомолекулярного маркера Ki-67 при исследовании образцов группы сравнения была незначительной – 70,5 (31,5; 94,2), что является очевидным при доброкачественной опухоли. При I стадии серозного рака яичников high-grade уровень экспрессии Ki-67 в ядрах составил 676,0 (132,7; 771,7), при IV стадии – 989,0 (867,0; 1168,0) (табл. 2). Наблюдался рост экспрессии маркера Ki-67 при увеличении стадии опухолевого процесса (рис. 6).

Стадия рака яичников – Ovarian cancer stage

Рис. 6. Экспрессия маркера Ki-67 в зависимости от стадии эпителиального рака яичников

Fig. 6. Ki-67 expression by the stage of epithelial ovarian cancer

Высокий уровень белка Ki-67 взаимосвязан с худшим прогнозом течения заболевания. Коэффициент ранговой корреляции Спирмена продемонстрировал статистически значимую обратную связь между Ki-67 и PD-1 с высокой корреляционной силой, что доказывает зависимость экспрессии рецептора PD-1 от степени пролиферативной активности опухоли яичников (табл. 3).

Наблюдалась статистически значимая прямая связь между Ki-67 и PD-L1 с высокой корреляционной силой, что доказывает прямую зависимость экспрессии лиганда PD-L1 от степени пролиферативной активности опухоли яичников. Также отмечена статистически значимая обратная связь между p53 и PD-1 с высокой корреляционной силой, что показывает зависимость экспрессии PD-1 от апоптотических изменений в опухоли яичников.

Таблица 3

Table 3

Признак Marker Корреляции рангового порядка Спирмена (р<0,05) Spearman's rank-order correlation (p<0.05) Ki-67 p53 PD-1 PD-L1 Ki-67 1,000000 0,789964 -0,916908 0,853147 p53 0,789964 1,000000 -0,932831 0,957253 PD-1 -0,916908 -0,932831 1,000000 -0,940198 PD-L1 0,853147 0,957253 -0,940198 1,000000 служить аргументом в пользу оценки противоопухолевых лекарственных препаратов, ингибирующих иммунные контрольные точки. Основываясь на перечисленных данных, можно утверждать, что продукция лиганда PD-L1 в клетках иммунной системы, которые инфильтрируют опухоль, рассматривается как благоприятный прогностический фактор.

Статистически значимая прямая связь между Ki-67 и PD-L1 доказывает прямую зависимость экспрессии лиганда PD-L1 от степени пролиферативной активности опухоли яичников. Статистически значимая обратная связь между p53 и PD-1 показывает зависимость экспрессии PD-1 от апоптотических изменений в опухоли яичников.