Экстракционно-хроматографическое определение глюкозы и фруктозы в присутствии ароматических аминокислот

актуальность приобретает разработка способов определения компонентов фармацевтических аминокислотных препаратов и установление их подлинности. Количественное определение моносахаридов в протеиновых комплексах затруднено вследствие высокого содержания аминокислот в составе анализируемых препаратов.

Известны многочисленные сведения о хроматографических и электрохимических методах разделения и определения органических веществ, однако жидкостная экстракция продолжает занимать лидирующее положение среди методов разделения и концентрирования.

Цель исследования состоит в разработке экстракционно-хроматографического способа определения фруктозы и глюкозы в присутствии аминокислот в водных растворах.

К 20 см³ водно-солевого раствора аминокислот ( L- триптофан, L- фенилаланин , L- тирозин ) и моносахаридов (фруктоза, глюкоза) добавляли 1 см³ гидрофильного растворителя (объемное соотношение водной и органической фаз 20 : 1), экстрагировали на вибросмесителе 7-10 мин, после расслаивания системы (2-3 мин) отделяли экстракт.

Для определения содержания аминокислоты органическую фазу количественно помещали в ячейку для потенциометрического титрования. В качестве титранта применяли 0,01 моль/дм3 раствор КОН в безводном этиловом спирте. При неводном титровании индикаторным электродом служил стеклянный электрод; электрод сравнения - хлоридсеребряный электрод, заполненный насы- щенным раствором хлорида калия в этиловом спирте [1]. Электродвижущую силу раствора измеряли на высокоомном потенциометре. На дифференциальной кривой потенциометриче ского титрования имеется максимум, соответствующий содержанию аминокислоты в экс- тракте.

Для определения моносахарида в кон- центрате после экстракции микрошприцем отбирали 0,001 см3 экстракта, наносили на линию старта пластины и подсушивали на воздухе. На дно хроматографической камеры помещали этилацетат, н.пропиловый спирт, концентрированную уксусную кислоту, формамид и дистиллированную воду. После достижения подвижной фазой линии финиша пластину «Sorbfil» извлекали из камеры и подсушивали. По градуировочному графику зависимости площади пятна от концентрации моносахарида находили концентрацию фруктозы или глюко зы в водном растворе.

Коэффициенты распределения моносахарида и аминокислоты ( D M и D A ), степень извлечения ( R M и R A ) и факторы разделения (в )

моносахарида и аминокислоты вычисляли по уравнениям [2]:

^ I ,A(o)

’

VVI ,A(a)

R_t а -  ^ ''— 100,

I,A D1Л + f ’ в -

где N} ^(0) и N} ^(а) - концентрации моносаха- рида и аминокислоты в органической и водной фазах, мг/см3; f - соотношение объемов равновесных водной и органической фаз.

Глюкоза и фруктоза - гидрофильные соединения, содержащие альдегидную и спиртовые группы, поэтому для экстракции применяли частично или полностью смешивающиеся с водой растворители (алифатические спирты, алкилацетаты, кетоны) в присутствии высали-вателя, необходимого для образования двухфазной системы. Предварительно установлено, что оптимальные параметры процесса достигаются в системах, практически насыщенных сульфатом аммония.

Коэффициенты распределения и степ ень извлечения глюкозы и фруктозы при экстракции из водно-солевых растворов максимальны для систем на основе ацетона, этилацетата и н.пропилового спирта (табл. 1).

Таблица 1 Коэффициенты распределения ( D ) и степень извлечения ( R , %) фруктозы и глюкозы при экстракции из насыщенных растворов сульфата аммония ( n = 3, Р = 0,95)

Экстрагент	Фруктоза		Глюкоза
	D	R , %	D	R , %
H. пропиловый спирт	16,7±0,8	45,5	24,7±1,2	55,3
H.бутиловый спирт	11,3±0,6	36,2	20,5±1,0	51,5
H.пентиловый спирт	9,0±0,5	31,1	15,7±0,8	44,0
Изопропиловый спирт	9,2±0,5	31,5	13,8±0,7	39,3
Изобутиловый спирт	7,0±0,4	25,9	12,0±0,6	35,9
Изопентиловый спирт	6,2±0,3	23,7	9,9±0,5	30,7
1,4-Диоксан	12,1±0,6	37,7	17,5±0,9	46,7
Этилацетат	20,4±1,0	50,4	24,6±1,2	55,2
Бутилацетат	14,1±0,7	41,3	16,3±0,8	44,9
Ацетон	17,5±0,9	46,6	25,4±1,3	55,9

При этом для глюкозы наиболее эффективным экстрагентом является ацетон, для фруктозы - этилацетат.

Известно, что в отношении ароматических аминокислот наиболее эффективны в качестве экстрагентов этилацетат и пропиловый спирт, менее эффективен ацетон [3, 4, 5]. Наличие в структуре аминокислот ОН-, NH 2 -,

СООН‐групп обусловливает различный механизм экстракции.

Изучена экстракция смеси моносахарида и ароматической аминокислоты из водносолевого раствора пропиловым спиртом, этилацетатом и ацетоном. Рассчитаны экстракционные характеристики фруктозы, глюкозы и ароматических аминокислот (табл. 2).

Таблица2

Максимальные коэффициенты распределения, степень извлечения и фактор разделения моносахаридов и ароматических аминокислот

Состав смеси	& 8 8 2 m	D 1	D 2	R 1	R 2	β
фруктоза – триптофан	я 8 в	33,3	0,14	62,3	0,07	210
фруктоза – фенилаланин		22,0	0,15	52,4	0,73	150
фруктоза – тирозин	1 О1 § В у О )S & 3	21,6	0,10	51,9	0,50	200
глюкоза – триптофан	я 8 в	45,0	0,22	69,3	1,09	200
глюкоза – фенилаланин	м 8 в	42,5	0,26	68,0	1,23	180
глюкоза – тирозин		39,4	0,27	66,3	1,34	150

Установлено, что наиболее полно разделяется смесь фруктозы и триптофана при экстракции ацетоном, фактор разделения 210. При этом степень извлечения фруктозы достигает 63,3 %, триптофан в этих условиях извлекается не более, чем на 0,4 %.

Следует отметить, что высокие факторы разделения получены и для других систем, содержащих глюкозу, например, 200 и 180 для систем с триптофаном и фенилаланином при экстракции ацетоном.

Экстракция глюкозы и фруктозы из водно‐солевого раствора моносахарида и аминокислоты гидрофильным растворителем представляет собой вариант распределения в двухфазной четырехкомпонентной системе. Механизм распределения моносахаридов и аминокислот между водной и органической фазами во многом определяется природой экстрагента.

Эффективность экстракции глюкозы и фруктозы из водно‐солевого раствора, содержащего аминокислоту, возрастает по сравнению с экстракцией отдельных компонентов смеси в 1,5 – 2 раза. Происходит частичное вытеснение моносахарида из водно‐солевого раствора за счет накопления гидрофобного компонента (аминокислота).

Об этом свидетельствуют коэффициенты распределения фруктозы и глюкозы в пяти- и шестикомпонентных системах моносахарид – смесь аминокислот - сульфат аммония – вода (табл. 3).

Таблица 3

Коэффициенты распределения и степень извлечения моносахаридов при экстракции этилацетатом в присутствии смеси аминокислот ( n = 3, P = 0,95)

Смесь аминокислот	Фруктоза		Глюкоза
	D	R , %	D	R , %
Фенилаланин - триптофан	64,0±1	76,2	67,7±1,2	77,2
Фенилаланин - тироз ин	63,9±2,1	76,2	52,9±3,2	72,3
Триптофан - тироз ин	61,9±1,2	75,6	75,9±4,2	80,0
Триптофан - тирозин -фенилаланин	82,3±4,2	80,6	91,8±4,6	82,1

Например, степень извлечения фруктозы и глюкозы из раствора, содержащего три ароматические аминокислоты, достигает 80,6 и 82,1 %, что превышает степень извлечения этих моносахаридов из индивидуальных растворов и растворов с одной аминокислотой в 1,2-1,5 раза (рисунок).

Рисунок. Зависимость коэффициентов распределения глюкозы (1) и фруктозы (2) от количества аминокислот в растворе

Для анализа концентратов нами применен метод хроматографии в тонком слое, который позволяет достаточно быстро обнаружить моносахариды при концентрациях на уровне 0,1 – 10,0 мкг/дм3.

Выбор хроматографической системы обусловлен природой определяемых веществ. Для элюирования моносахаридов рекомендуется система пиридин – смесь алифатических спиртов – вода. Ограничение известного способа связано с использованием резкопахнущих токсичных растворителей.

Нами применена подвижная фаза на основе этилацетата, н.пропилового спирта, концентрированной уксусной кислоты, формамида и дистиллированной воды в объемном соотношении 5 : 5 : 1 : 1 : 3. Установлено, что такая смесь обеспечивает полное разделение моносахаридов. С увеличением содержания уксусной кислоты в подвижной фазе эффективность разделения моносахаридов повышается, однако при этом происходит размытие пятна.

Минимально определяемые концентрации моносахаридов в анализируемых водных растворах составляют 0,1 – 1,0 мкг/дм3. Относительная погрешность определения микроколичеств моносахаридов по предложенной экстракционно-хроматографической методике с применением офисного сканера и ПК не превышает 10 %.