Электрохимический биосенсор глюкозы на основе глюкозооксидазы, иммобилизованной на наноматериале

В последние годы все более пристальное внимание исследователей привлекается к разработке экспрессных методов анализа, характеризующихся высокой доступностью и обладающих достаточными уровнями чувствительности и избирательности. Особенный интерес вызывает возможность миниатюризации подобных аналитических устройств. Наиболее яркими представителями аналитических систем, сочетающих в себе перечисленные качества, являются биосенсоры [1].

Биосенсоры находят все более широкое применение в целом ряде отраслей науки, промышленности, сельского хозяйства, медицины и здравоохранения, так как позволяют быстро и качественно анализировать сложные, многокомпонентные смеси веществ [2].

Биосенсоры состоят из двух компонентов: системы биохимического распознавания и преобразователя первичного сигнала (трансдъюсера). Как правило, в качестве биораспознающего реагента используют ферменты и другие специфические биологические объекты – антитела или антигены, отдельные клетки, микроорганизмы, срезы тканей - в иммобилизованном состоянии. Элемент биологического распознавания должен находиться в прямом контакте с преобразователем [3].

Для преобразования первичного сигнала в биосенсорах наиболее часто используются электрохимические методы [4]. Электрохимические биосенсоры представляют собой хорошую альтернативу традиционным аналитическим системам благодаря высокой селективности и простоте регистрирующих устройств. Электрохимические методы детекции отклика имеют ряд преимуществ перед другими методами, в частности, по сравнению со спектрофотометрией, а именно: быстрое получение выходного сигнала, возможность анализа окрашенных и суспендированных образцов, возможность многократного ис- пользования биокатализаторов. Все эти качества в сочетании с относительно простым аппаратурным оформлением электрохимических биосенсоров вызывают повышенный интерес к ним [4].

Амперометрические ферментные биосенсоры на глюкозу на основе глюкозооксидазы (GOx), образующие пероксид водорода в присутствии кислорода и глюкозы, являются наиболее широко используемыми устройствами для контроля уровня глюкозы в различных объектах, в том числе в пищевых продуктах [5]. Эффективный глюкозный биосенсор должен содержать активный и стабильный иммобилизованный слой фермента. Использование подобных биосенсоров связано с рядом проблем, одной из которых является денатурация фермента и потеря его четвертичной структуры при повышении температуры. Одним из способов минимизации инактивации фермента является его иммобилизация на наночастицах с использованием конденсирующих агентов, в качестве которых могут выступать бифункциональные молекулы – глутаровый альдегид, карбодиимиды, эпоксиды [6].

Настоящее исследование направлено на разработку электрохимического ферментного глюкозного биосенсора с биорецептором, представляющим собой глюкозооксидазу, иммобилизованную на частицах ферромагнетита Fe 3 O 4 , для экспресс-анализа глюкозы в пищевых объектах.

Объектом исследования являлся фермент глюкозооксидаза (GOx, EC 1.1.3.4, активность 157,50 ед./мг, Sigma Chemical Co, США), относящийся к классу оксидоредуктаз и катализирующий окисление глюкозы до пероксида водорода и D-глюконо-δ-лактона. В клетках фермент способствует расщеплению сахаров до их метаболитов. Фермент, как правило, выделяют из штамма Aspergillus niger . Глюкозоокси-даза – это димерный белок, для которого установлена 3D структура (рис. 1). Активным центром фермента является глубокий карман. Этот фермент, как и другие белки, действующие снаружи клетки, покрыт углеродными цепочками.

Рис. 1. Пространственная структура молекулы глюкозооксидазы

При выполнении работы также использовали глутаровый альдегид (70%),   3- аминопропилтриэтоксисилан - продукты фирмы Sigma-Aldrich-Louis (США); натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный, калий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный – отечественного производства.

Иммобилизацию глюкозооксидазы осуществляли путем инкубирования раствора фермента с суспензией предварительно модифицированных реакционноспособными аминогруппами наночастиц Fe 3 O 4 в фосфатном буферном растворе (рН 7,8). Для предварительной модификации частиц аминогруппами использовали 3-аминопропилтриэтоксисилан.

Поскольку иммобилизацию глюкозооксидазы проводили в фосфатном буферном растворе, целесообразно на первом этапе исследования установить содержание воды в составе гетерогенного катализатора. После достижения равновесия гидратации наночастицы с иммобилизованной глюкозооксидазой высушивали при температуре 25ºС и 4ºС, после чего каждый день измеряли массу частиц. Содержание воды определяли в соответствии со следующей формулой:

Н = (Ww-WJ/Ww х 100

^, где Н – содержание воды в гетерогенном катализаторе, %,

W w – масса полностью гидратированных частиц Fe 3 O 4 , г,

W d – масса дегидратированных частиц Fe 3 O 4 , г.

Результаты определения содержания воды в образце наночастиц Fe 3 O 4 с имобилизованной глюко-зооксидазой при разной продолжительности процесса дегидратации представлены в таблице 1.

Содержание воды в составе гетерогенного катализатора

Таблица 1

Температура, ºС	Период выдерживания, сутки	Содержание воды Н, %	% расхождения
25	1	68,29	-
4	4	72,15	3,86
4	4	75,05	6,76
4	6	77,31	9,02
4	8	76,24	7,95
4	10	77,15	8,86
4	12	68,77	0,48
4	14	67,34	0,95

Как и следовало ожидать, содержание воды в составе биорецептора при температуре иммобилизации 4ºС изменяется пропорционально продолжительности дегидратации наноразмерного носителя. Носитель, выдержанный в течение 14 дней, содержит меньшее количество воды, чем носитель, выдержанный от 1 до 12 дней. Из таблицы 1 также следует, что содержание воды для носителя с температурой иммобилизации 25ºС и периодом выдерживания 1 сутки и носителя с температурой иммобилизации 4ºС и периодом выдерживания 12 суток имеет близкие значения. Следовательно, носитель с температурой иммобилизации 4ºС необходимо подвергать дегидратации 12 суток, чтобы достичь плотности конденсации, аналогичной для носителя с температурой иммобилизации 25ºС, дегидратированного в течение суток.

На следующем этапе исследования изучали влияние температуры иммобилизации на активность иммобилизованной глюкозооксидазы. Для этого через определенные промежутки времени отбирали порции промывочного буфера и измеряли в них ферментативную активность (рис. 2).

Рис. 2. Сравнение эффективности иммобилизации фермента при разных температурах иммобилизации: 1 – температура 25ºС, 2 - температура 4ºС

Как видно из рисунка 2, ферментативная активность в промывочных растворах для глюкозоокси-дазы, иммобилизованной при 4 и 25ºС, со временем снижается. Наночастицы Fe 3 O 4 , модифицированные аминогруппами, связывают весь фермент в течение 17,5 часа. Это свидетельствует о том, что температура иммобилизации не влияет на эффективность иммобилизации при использовании модифицированных частиц Fe 3 O 4 . Из представленных результатов видно, что при обеих исследуемых температурах с модифицированными частицами Fe 3 O 4 связываются сопоставимые количества фермента.

Для изучения активностей глюкозооксидазы, иммобилизованной при температурах 4 и 25ºС, проводили колориметрический ферментативный анализ, основанный на окислении о-дианизидина пероксидазной системой [7]. Ферментативную активность образцов измеряли на протяжении 30 дней (рис. 3).

Рис. 3. Ферментативная активность образцов, иммобилизованных при разных температурах: - температура 4°С, ^Н - температура 25°С

Данные, представленные на рисунке 3, свидетельствуют о том, что в случае гетерогенного катализатора с температурой иммобилизации 25°С ферментативная активность вначале снижается, стабилизируясь к 30 суткам. Отсюда можно предположить, что глюкозооксидаза, химически связанная с наночастицами Fe3O4, на начальной стадии нестабильна. Ранее показано, что пероксид водорода, образующийся в результате ферментативной реакции, остается на поверхности носителя, что может привести к его загрязнению [8]. Остаточная концентрация пероксида водорода на поверхности носителя может быть связана с затрудненным массопереносом субстратов и продуктов реакции , который является результатом кросс-сшивки. Диффузионный барьер для молекул продукта может приводить к его накоплению в центральной части электрода в значительных концентрациях, что является следствием ингибирования фермента продуктом. Стабилизация, наблюдающаяся к 30 суткам, может быть связана с диффузией пероксида водорода через определенный промежуток времени.

Что касается носителя, полученного с использованием температуры иммобилизации 4°С, в данном случае также наблюдается стабилизация ферментативной активности по истечение 30 суток. Однако здесь не отмечено снижения ферментативной активности на начальном участке, как в другом рассматриваемом случае. Следовательно, можно предположить, что микроокружение этих двух типов носителей несколько различается.

Для периода 30 суток характерно, что ферментативная активность глюкозооксидазы, иммобилизованной на частицах Fe 3 O 4 при обеих температурах, значительно снижается по сравнению с начальным значением. Такое явление может быть результатом непредвиденных конформационных и внутренних изменений, а также неравномерного распределения молекул конденсирующего агента. Недостаток средств контроля условий микросреды является одной из главных причин пониженной ферментативной активности и стабильности.

Таким образом, показано, что предпочтительной температурой иммобилизации глюкозооксидазы на аминомодифицированных частицах Fe 3 O 4 является температура 4°С, поскольку в данном случае получены более стабильные иммобилизованные препараты. Именно такой вариант биорецептора выбран при конструировании биосенсора для определения глюкозы в пищевых продуктах.

Дальнейшие исследования посвящены оценке влияния компонентов электрода на субстратную специфичность сенсора, при этом для измерения ферментативной активности использовали кислородный платиновый электрод Кларка, на котором иммобилизован фермент глюкозооксидаза. В данном случае присутствующая в среде глюкоза окисляется ферментом , процесс сопровождается потреблением кислорода. Снижение концентрации кислорода в системе пропорционально концентрации глюкозы, следовательно, ток восстановления кислорода на платиновом катоде прямо пропорционален концентрации кислорода.

Преимущество данного типа биосенсора, основанного на кислородном электроде Кларка, состоит, прежде всего, в его высокой селективности. Избирательность подобных биосенсоров определяется высокой специфичностью глюкозооксидазы и природой электрохимической реакции, в которой участвуют компоненты ферментативного процесса.

В настоящей работе в качестве основы биосенсора использовали платиновый электрод на основе полипиррола. При этом рассматривали следующие варианты формирования биологического рецепторного элемента:

• -    сорбция иммобилизованной на наночастицах Fe₃O₄ глюкозооксидазы на поверхности кислородного электрода;

• -    сорбция медиатора из ацетонового раствора на рабочую поверхность кислородного электрода с последующей иммобилизацией глюкозооксидазы.

Роль анионного медиатора, в данном случае пирролохинолин хинона, заключается в обеспечении электронного переноса между ферментом и электродом. Как и большинство хинонов, пирролохинолин хинон на поверхности электрода подвергается двухэлектронному окислению-восстановлению (рис. 4).

Рис. 4. Электрохимическая редокс-реакция пирролохинолин хинона

На рисунке 5 представлены относительные сигналы сенсоров для двух исследуемых случаев. Как видим, присутствие медиатора оказывает заметное влияние на отклик и, следовательно, чувствительность биосенсора. Таким образом, для дальнейших исследований целесообразно использование медиаторных ферментных биосенсоров на глюкозу.

Рис. 5. Отклик биосенсоров, модифицированных различными способами, на глюкозу: ^Н - электрод Кларка + сорбция на поверхности иммобилизованной глюкозооксидазы; ^Н - электрод Кларка + медиатор + сорбция на поверхности иммобилизованной глюкозооксидазы

В ходе работы были изучены параметры медиаторного биосенсора на основе глюкозооксидазы. На рисунке 6 представлена калибровочная зависимость такого сенсора. Диапазон определяемых концентраций глюкозы составляет 0,05-5,00 мМ, чувствительность в области линейного диапазона 35 мА/М^см2.

Концентрация глюкозы. М

Рис. 6. Калибровочная кривая для сенсора на основе глюкозооксидазы

Для исследования операционной стабильности проводили непрерывные измерения в течение нескольких суток. В перерывах между измерениями электрод с биорецептором хранили в буферном растворе при комнатной температуре. Операционная стабильность сенсора составила 12 суток без потери активности, стабильность сенсоров при хранении - 6 месяцев без изменения активности.

Биосенсор на основе наночастиц Fe 3 O 4 и глюкозооксидазы применяли для анализа реальных образцов соков овощей и фруктов, содержащих глюкозу. В качестве метода сравнения использовали спектрофотометрический метод определения глюкозы при длине волны 365 нм (ГОСТ Р 51240-98 «Соки фруктовые и овощные. Метод определения D-глюкозы и D-фруктозы»). Для определения глюкозы в реальных образцах анализируемые соки отжимали и осаждали полученную мякоть на центрифуге в течение 5 минут при 5000 об./мин.

Результаты определения содержания глюкозы в различных соках овощей и фруктов с использованием биосенсора на основе глюкозооксидазы и альтернативного спектрофотометрического метода представлены в таблице 2. Коэффициент корреляции данных биосенсорного и спектрофотометрического анализа составил 0,95, что позволяет сделать вывод о достаточно высокой точности биосенсорных измерений.

Таблица 2

Содержание глюкозы в образцах соков и овощей

Объект исследования	Содержание глюкозы (г/дм3) в различных методах анализа
	Биосенсор на основе глюкозооксидазы	Спектрофотометрический
Тыква	27,5	25,9
Арбуз	26,0	24,8
Вишня	53,8	54,2
Апельсин	22,9	24,0
Клюква	24,6	25,3
Капуста белокочанная	23,4	25,0

Полученные результаты свидетельствуют о том, что биосенсоры для определения глюкозы на основе наночастиц Fe 3 O 4 и глюкозооксидазы характеризуются удовлетворительными параметрами и могут быть использованы для контроля качества пищевых продуктов и производственных процессов. Такие высокочувствительные биосенсоры с низким пределом обнаружения могут найти применение также для анализа глюкозы в клинической диагностике.

Таким образом, представлены лабораторные модели медиаторного ферментного биосенсора на основе наночастиц Fe 3 O 4 для детекции глюкозы. Биосенсоры обладают удовлетворительными параметрами (чувствительностью, стабильностью), которые свидетельствуют о потенциальной возможности их практического применения в различных биотехнологических областях. В первую очередь их использование может быть эффективным при контроле содержания глюкозы на различных стадиях технологического процесса при производстве пищевой продукции.

Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.