Элементы лабораторного регламента производства микробиопрепаратов в препаративной форме "смачивающийся порошок" на основе бактерий-антагонистов из рода Pseudomonas при поверхностном культивировании на жидкой питательной среде

Введение. Для нашей страны немаловажным является возможность импорто-замещения дорогостоящих, опасных химических пестицидов экологически безопасными микробиопрепаратами, которые зачастую не уступают, а даже превосходят по эффективности химические фунгициды. Это особенно актуально в условиях повышенного интереса к получению экологически-безопасного продовольствия, сохранению здоровья людей и снижению загрязнения среды и сельскохозяйственной продукции пестицидами. Одной из проблем получения промышленных форм микробиопрепаратов является вопрос сохранения жизнеспособности и активности штаммов-продуцентов в процессе хранения.

В лаборатории биометода ФГБНУ ВНИИМК многие годы ведутся исследования по разработке микробиологических средств защиты масличных и других сельскохозяйственных культур от болезней. Создана уникальная коллекция штаммов грибов и бактерий-продуцентов микробиопрепаратов – биофунгицидов. Разрабатываются технологии производст- ва разных препаративных форм микробиопрепаратов и технологии их применения [1].

Ранее в лаборатории биометода были разработаны препаративные формы микробиопрепаратов: жидкая культура, паста и порошок на основе твёрдых носителей – питательных сред (семянки, лузга, отходы от очистки семян подсолнечника) и перлита. Но жидкие культуры и пасты, особенно на основе грибных штаммов-продуцентов выдерживали хранение не более 10 суток и 3-х месяцев соответственно, даже в холодильнике, а порошки плохо смачивались в воде и забивали отверстия распылителей [2]. В отличие от грибных, жидкие культуры на основе бактериальных штаммов-продуцентов, особенно из рода Bacillus, могут сохраняться без добавления стабилизаторов в течение 6-и месяцев, что позволяет хранить препараты в течение сезона [3]. Но такой срок хранения жидких культур лишает возможности производить микробиопрепараты в период межсезонья.

Распространённым способом подготовки микробной биомассы к хранению является высушивание [4]. Применяемые способы высушивания микробной массы на распылительной и лиофильной сушилке довольно дорогостоящие, и, несмотря на добавление ПАВ и протекторов, воздействие стрессовых факторов на микроорганизмы (резкие перепады низких и высоких температур) снижает их выживаемость. Так, при высушивании на лиофильной сушке бактерий рода Pseudomonas выживаемость микроорганизмов составляет не более 16 % [5]. При конвекционной сушке биоматериал смешивается с наполнителями и протекторами и сушится током воздуха в более мягких условиях, при максимально возможной для микроорганизма температуре.

Поэтому в последние годы нами решается задача по увеличению срока хранения биопрепаратов без снижения титра в препаративной форме «смачивающийся порошок» (СП), при конвекционной суш- ке током воздуха. Ранее нами проведены исследования по отработке элементов лабораторного регламента производства микробиопрепаратов в препаративной форме СП при поверхностном культивировании на жидких питательных средах перспективных грибных штаммов-продуцентов из рода Penicillium и бактерий из рода Bacillus [6; 7].

В данной работе приведены результаты исследований по разработке элементов лабораторного регламента производства микробиопрепарата в препаративной форме СП при поверхностном культивировании перспективного бактериального штамма-продуцента из коллекции лаборатории биометода Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens на жидкой питательной среде.

Материалы и методы. Штамм-продуцент выращивали поверхностно на жидкой питательной среде Кинга В [8] в трёхлитровых стеклянных баллонах, закрытых марлевыми крышками с крафт бумагой и повернутых набок, с объёмом питательной среды 500 мл при оптимальной температуре 25 °С. Выращенную биомассу бактерии отделяли двумя способами: с предварительным охлаждением при температуре +2 °С, с последующим сливом надосадочной жидкости и центрифугированием на Centrifuge MPW-340, в течение 5 мин с оборотом двигателя 4000 об./мин. Затем к биомассе добавляли прилипатель, растекатель и наполнитель в определённом процентном соотношении. Всё перемешивали, распределяли тонким слоем на гладкой поверхности, высушивали под вытяжкой при температуре 28– 30 °С и размалывали на мельнице с охлаждением. Влажность образцов определяли стандартным методом высушивания до постоянной массы (ГОСТ 5180-2015) [9]. Для установления оптимальных сроков поверхностного культивирования штамм-продуцент выращивали в течение 5, 10, 15

и 20 суток. Для определения оптимального объёма посевной культуры к 500 мл питательной среды добавляли 2 и 4 % глубинной культуры антагониста, которую предварительно выращивали на жидкой среде, на качалке (195 об./мин) в течение 36 час. Сроки хранения опытных образцов в препаративной форме СП определяли в зависимости от упаковки, температуры и стабилизаторов. Опытные образцы хранили при постоянных (+30 и - 18 °С) и переменной (+24…+26 °С) температурах в двух упаковках: пластмассовых банках, с плотно закрытой крышкой объёмом 100 мл и бумажных пакетах, с доступом воздуха, при этом обе упаковки заполняли СП на 30 % от объёма. Определяли сырую массу, порошка и титр. При хранении СП в бумажных пакетах в условиях переменной температуры (+24…+26 °С) испытывали стабилизаторы: резорцин (0,1 %), тиомочевину (0,05 %), аскорбиновую кислоту (0,05 %), бензоат натрия (0,1 %), сульфат меди (0,05 %), гумат натрия (0,5 %), гидрохинон (0,1 %), уголь активированный (0,5 %) и двуокись титана (1,0 %). Через 3, 6, 9 и 12 месяцев хранения микробиопрепарата определяли титр микробиологическим способом [10].

Результаты и обсуждение . Лабораторные образцы микробиопрепарата в препаративной форме СП, полученные при поверхностном культивировании штамма Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens на жидкой питательной среде, образовывали в воде стойкую суспензию, исходный титр 10^8–9 КОЕ/г.

Установлен оптимальный срок поверхностного культивирования на жидкой питательной среде Кинга В и объём посевной суспензии бактериального штамма-продуцента Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens при отделении биомассы бактерии методами слива (табл. 1) и центрифугирования (табл. 2).

Таблица 1

Влияние срока поверхностного культивирования на жидкой питательной среде и объёма посевной суспензии бактериального штамма-продуцента микробиопрепарата Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens на массу смачивающегося порошка и титр опытных образцов микробиопрепарата (при отделении биомассы методом слива)

г. Краснодар, ВНИИМК, 2017 г.

Вари-ант	Объём посев-ной сус-пен-зии, %	Срок культиви				ования, сутки
		5		10		15		20
		мас са СП*, г	титр, КОЕ/г	масса СП*, г	титр, КОЕ/г	масса СП*, г	титр, КОЕ/г	масса СП*, г	титр, КОЕ/г
Sgrc-1	2,0	16,78	1,6 × 109	14,42	1,2 × 109	16,62	1,9 × 109	14,45	1,4 × 109
	4,0	17,47	1,8 × 109	16,17	1,5 × 109	18,80	1,1 × 109	16,51	1,8 × 109

Примечание: * СП – микробиопрепарат в препаративной форме «смачивающийся порошок»

Таблица 2

Влияние срока поверхностного культивирования на жидкой питательной среде бактериального штамма-продуцента микробиопрепарата Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens на массу смачивающегося порошка и титр опытных образцов микробиопрепарата (при отделении биомассы методом центрифугирования)

г. Краснодар, ВНИИМК, 2017 г.

Вариант	Объём посев-ной сус-пен-зии, %	Срок культивирования, сутки
		5		10		15		20
		масса СП*, г	титр, КОЕ/г	масса СП*, г	титр, КОЕ/г	масса СП*, г	титр, КОЕ/г	масса СП*, г	титр, КОЕ/г
Sgrc-1	2,0	3,87	7,4 × 108	2,33	5,2 × 108	2,64	3,9 × 108	2,49	1,0 × 108

Примечание: * СП – микробиопрепарат в препаративной форме «смачивающийся порошок»

Установлено, что при всех сроках поверхностного культивирования Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens на жидкой питательной среде при отделении биомассы бактерии методом слива получен СП с влажностью 6,8 %, с примерно одинаковой массой, с незначительным превышением этого показателя при бóльшем объёме посевной суспензии. Так, при объёме посевной суспензии 2,0 % с 500 мл 90

питательной среды получено 14,42– 16,78 г СП против 16,17–18,80 г при добавлении 4,0 % посевной суспензии. Титр СП не зависел от сроков культивирования и объёма посевной суспензии штамма-продуцента и был одного порядка во всех вариантах (1,1–1,8 × 109 КОЕ/г).

При отделении биомассы бактерии методом центрифугирования получен СП с влажностью 6,0 %, а максимальная масса установлена через пять суток поверхностного культивирования на жидкой питательной среде. При объёме посевной суспензии 2 % вес смачивающегося порошка в этом варианте составил 3,87 г против 2,33; 2,64 и 2,49 г с 500 мл питательной среды при сроке выращивания 10, 15 и 20 суток. Титр СП при всех сроках культивирования штамма-продуцента был одного порядка (1,0–7,4 × 108 КОЕ/г).

Таким образом, при обоих способах отделения биомассы оптимальный срок поверхностного культивирования бактериального штамма Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens на жидкой среде Кинга В составил пять суток, оптимальный объём посевной суспензии – 2,0 % к объёму питательной среды. При этом масса СП значительно больше при отделении биомассы методом слива (14,42–18,80 г против 2,33–3,87 г), при более высоком, в пределах порядка, титре (1,0–7,4 × 10⁸– 1,1–1,8 × 10⁹ КОЕ/г). Более высокая масса СП в этом варианте связана с бóльшим весом сырой бактериальной массы и, соответственно, с бóльшим количеством наполнителя. Более высокий титр СП объясним бережным способом отделения бактерии от культуральной жидкости, что предотвращает гибель бактериальных клеток. Тогда как при жёстком отделении биомассы бактерии на центрифуге происходит гибель части клеток псевдомонады.

Установлены сроки хранения опытных образцов микробиопрепарата на основе бактериального штамма-продуцента микробиопрепарата Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens в препаративной форме СП в зависимости от герметичности упаковки и температуры хранения (табл. 3, 4).

Таблица 3

Влияние температуры и упаковки на титр опытных образцов микробиопрепарата в препаративной форме «смачивающийся порошок» на основе бактериального штамма-продуцента Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens в процессе хранения (отделение биомассы методом слива)

г. Краснодар, ВНИИМК, 2017 г.

Срок хранения, месяцев	Титр, КОЕ/г
	+24…+26 °С		+30 °С		- 18 °С
	пакет	банка	пакет	банка	пакет	банка
3	5,3 × 108	3,9 × 108	3,3 × 105	4,0 × 104	1,2 × 109	1,7 × 109
6	5,8 × 107	3,2 × 107	4,6 × 103	2,1 × 103	1,3 × 109	3,2 × 109
9	2,2 × 105	2,8 × 105	1,8 × 103	1,9 × 103	1,8 × 109	2,9 × 109
12	1,5 × 105	2,7 × 105	1,5 × 103	1,7 × 103	2,4 × 109	2,7 × 109

Таблица 4

Влияние температуры и упаковки на титр опытных образцов микробиопрепарата в препаративной форме «смачивающийся порошок» на основе бактериального штамма-продуцента Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens в процессе хранения (отделение биомассы методом центрифугирования)

г. Краснодар, ВНИИМК, 2017 г.

Срок хранения, месяцев	Титр, КОЕ/г
	+24…+26 °С		+30 °С		- 18 °С
	пакет	банка	пакет	банка	пакет	банка
3	2,0 × 108	3,3 × 108	1,2 × 106	1,4 × 106	6,5 × 108	6,0 × 108
6	5,1 × 107	3,0 × 107	4,4 × 105	3,1 × 105	6,6 × 108	8,5 × 108
9	3,3 × 105	3,5 × 105	3,9 × 104	3,7 × 104	8,9 × 108	9,7 × 108
12	3,0 × 105	2,8 × 105	3,4 × 104	2,7 × 104	8,7 × 108	9,9 × 108

Установлено, что при обоих способах отделения биомассы при хранении опытных образцов СП микробиопрепарата на основе штамма Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens в пакетах и банках при постоянной низкой температуре (-18 °С) в течение двенадцати месяцев титр сохранялся на первоначальном уровне (8,7–9,9 × 10⁸ – 2,4–2,7 10⁹ КОЕ/г). При переменной температуре (+24 – +26 °С) при обоих способах отделения биомассы через шесть месяцев титр снизился на два порядка как в банке, так и в пакете, а через двенадцать месяцев ещё на два порядка и составил 3,2–5,8 × 10⁷ – 1,5–3,0 × 10⁵ КОЕ/г соответственно.

Особенно следует отметить, что при постоянной высокой температуре (+30 °С) исходный титр уже через три месяца снизился на четыре и три порядка при отделении биомассы методами слива и центрифугирования (3,3–4,0 × 105 и 1,2– 1,4 × 106 КОЕ/г). Через двенадцать месяцев титр снизился до 103 КОЕ/г при способе отделения биомассы методом слива и до 104 КОЕ/г – методом центрифугирования.

Таким образом, при хранении микробиопрепарата на основе штамма Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens в препаративной форме СП в пакетах и банках в условиях постоянно низкой температуры (-18 °С), независимо от способа отделения биомассы, титр в течение двенадцати месяцев не снизился. При переменной температуре в помещении лаборатории (+24…+26 °С) за шесть месяцев хранения СП, при обоих способах отделения биомассы, титр снизился на два порядка как в банке, так и в пакете (10⁷ КОЕ/г), а через двенадцать месяцев хранения – на четыре порядка (10⁵ КОЕ/г). При постоянно высокой температуре (+30 °С) за двенадцать месяцев хранения титр СП снизился на пять-шесть порядков (10^3–4 КОЕ/г).

Определяли влияние стабилизаторов на сроки хранения опытных образцов микробиопрепарата на основе бактериального штамма-продуцента Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens в препаративной форме СП в бумажных пакетах при переменной температуре (табл. 5, 6).

В контроле без добавок титр микробиопрепарата на основе штамма Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens при хранении в бумажном пакете в условиях переменной температуры от +24 до +26 °С в течение двенадцати месяцев снизился с 10⁹ до 10⁵ КОЕ/г. При добавлении тиомочевины, гидрохинона, гумата натрия и аскорбиновой кислоты титр снизился в пределах порядка (1,1–2,6 × 10⁸ КОЕ/г). В остальных вариантах титр снизился до 10⁶–10⁷ КОЕ/г, а в варианте с активированным углём – до уровня контроля (10⁵ КОЕ/г).

Таблица 5

Влияние стабилизаторов на титр опытных образцов микробиопрепарата на основе бактериального штамма-продуцента Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens в препаративной форме СП при хранении в бумажных пакетах в условиях переменной температуры (отделение биомассы методом слива)

г. Краснодар, ВНИИМК, 2017 г.

Вариант	Титр, КОЕ/г, через, месяцев
	3	6	9	12
Контроль	5,3 × 108	5,8 × 107	2,2 × 105	1,5 × 105
Резорцин, 0,1 %	4,9 × 107	5,1 × 107	5,1 × 106	2,1 × 106
Тиомочевина, 0,05 %	5,5 × 107	1,9 × 108	8,9 × 107	1,1 × 108
Аскорбиновая кислота, 0,05 %	5,0 × 107	5,5 × 107	5,1 × 107	5,4 × 107
Бензоат натрия, 0,1 %	2,4 × 107	3,1 × 106	2,1 × 106	2,1 × 106
Сульфат меди, 0,005 %	3,0 × 107	3,8 × 107	1,1 × 106	1,1 × 106
Гидрохинон, 0,1 %	6,3 × 108	6,0 × 108	5,7 × 108	2,1 × 108
Гумат натрия, 0,5 %	6,2 × 108	6,1 × 108	1,1 × 108	2,2 × 108
Меласса, 0,3 %	2,0 × 108	2,1 × 108	4,6 × 107	1,4 × 107
Двуокись титана, 1,0 %	1,3 × 107	2,8 × 106	2,1 × 106	1,1 × 106
Уголь активированный, 0,5 %	1,8 × 106	5,1 × 105	4,0 × 105	1,0 × 105

Таблица 6

Влияние стабилизаторов на титр опытных образцов микробиопрепарата на основе бактериального штамма-продуцента Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens в препаративной форме СП, при хранении в бумажных пакетах в условиях переменной температуры (отделение биомассы методом центрифугирования)

г. Краснодар, ВНИИМК, 2017 г.

Вариант	Титр, КОЕ/г, через, месяцев
	3	6	9	12
Контроль	2,0 × 108	5,1 × 107	3,3 × 105	3,0 × 105
Резорцин, 0,1 %	4,0 × 107	1,4 × 107	3,5 × 107	3,8 × 107
Тиомочевина, 0,05 %	6,0 × 107	1,6 × 108	1,3 × 108	1,1 × 108
Аскорбиновая кислота, 0,05 %	2,2 × 108	1,6 × 108	1,1 × 108	1,4 × 108
Бензоат натрия, 0,1 %	5,7 × 107	4,2 × 106	5,4 × 106	5,4 × 106
Сульфат меди, 0,005 %	6,3 × 106	4,4 × 106	2,4 × 106	5,4 × 106
Гидрохинон, 0,1 %	3,6 × 108	3,7 × 108	2,6 × 108	1,4 × 108
Гумат натрия, 0,5 %	4,0 × 108	2,0 × 108	2,3 × 108	2,1 × 108
Меласса, 0,3 %	1,5 × 107	1,9 × 107	0,9 × 107	8,4 × 106
Двуокись титана, 1,0 %	5,5 × 106	1,8 × 106	1,0 × 106	1,4 × 106
Уголь активированный, 0,5 %	3,8 × 107	1,1 × 106	5,3 × 105	2,4 × 105

Таким образом, установлено, что для сохранения опытных образцов СП микробиопрепарата на основе бактерий из рода Pseudomonas с незначительным снижением титра в пределах порядка в течение двенадцати месяцев необходимо добавление одного из стабилизаторов: тиомочевины, гидрохинона, аскорбиновой кислоты или гумата натрия.

Выводы. 1. Опытные образцы микробиопрепарата в препаративной форме СП, полученные при поверхностном культивировании штамма Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens на жидкой питательной среде, образовывали в воде стойкую суспензию, имели исходный титр 10^8–9 КОЕ/г и влажность 6,0–6,8 %.

• 2.    Оптимальный срок поверхностного культивирования бактериального штамма Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens на жидкой среде Кинга В составил пять суток, а объём посевной суспензии – 2,0 % к объёму питательной среды.

• 3.    При хранении опытных образцов микробиопрепарата на основе штамма Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens в препаративной форме СП при постоянной низкой температуре (-18 °С) в течение двенадцати месяцев титр, независимо от способа отделения биомассы и упаковки, сохранялся на первоначальном уровне.

• 4.    При переменной температуре (+24…+26 °С), независимо от упаковки и способа отделения биомассы, титр опытных образцов СП за двенадцать месяцев хранения снизился на четыре порядка (10⁵ КОЕ/г), а при постоянно высокой температуре – на пять-шесть порядков (10^4–3 КОЕ/г).

• 5.    Для сохранения опытных образцов СП микробиопрепарата на основе бактерий из рода Pseudomonas в пакетах с доступом воздуха при температуре +24…+26 °С в течение двенадцати месяцев с незначительным снижением титра в пределах порядка необходимо добавление одного из стабилизаторов – тиомочевины, гидрохинона, аскорбиновой кислоты или гумата натрия.

Исследования выполнены при финансовой поддержке РФФИ и администрации Краснодарского края, грант № 16-48-230293.