Элементы технологии экспресс-метода оценки чувствительности растений подсолнечника к поражению фомозом на ранних стадиях развития

Введение. Фомоз подсолнечника (черная стеблевая пятнистость) ‒ болезнь, которая широко распространена во всех регионах, возделывающих эту культуру, но вредоносность его возбудителя варьирует в зависимости от региона выращивания [1; 2]. В Аргентине потери урожая подсолнечника от фомоза достигают 30 %, в Европе и в США до 70 % [4; 5]. В Австралии и в Китае возбудитель этой болезни – гриб Phoma macdonaldii Boerema, входит в список карантинных объектов [6; 7; 8]. В настоящее время по распространенности в России фомоз подсолнечника среди всех болезней занимает лидирующее положение [9; 10; 11].

Возбудитель фомоза Phoma macdonaldi (Sacc.) Boerema (текущее название Plenodomus lindquistii (Frezzi) Gruyter, Aveskamp & Verkley) [12] способен вызывать повреждения всех органов растения подсолнечника разных фенологических стадий [13; 14]. По данным последних лет, установлено, что изоляты P. lindquistii, считающегося специализированным патогеном подсолнечника, способны в лабораторных условиях заражать не только подсолнечник, но близкородственные ему культурные и дикорастущие сорные растения: топинамбур, амброзию полыннолистную и дурнишник [14]. Тенденция увеличения посевных площадей под подсолнечником и возделывание его в короткоротационных севооборотах приводит к накоплению инфекционного начала возбудителя фомоза в почве на растительных остатках инфицированных растений и в семенном материале в виде мицелия, пикнид и плодовых тел [15; 16]. Выброс аскоспор происходит в течение всего периода вегетации подсолнечника, и количество пораженных растений изменяется в зависимости от количества и распределения осадков в это время. Наличие капельной влаги в течение суток при температуре 25 ºС способствует инфицированию растений подсолнечника возбудителем фомоза, диапазон температур при заражении может варьировать от 5 до 30 ºС. Температурный фактор имеет определяющее значение в развитии паразита и в продолжительности инкубационного периода болезни [17; 18]. В модельном эксперименте в тепличных условиях было показано, что наибольший вред растению-хозяину может быть причинён возбудителем болезни при поражении корневой системы на самых ранних стадиях его развития при прямом контакте корня с зараженными растительными остатками. В результате поражения корней всходы гибнут или растения не развиваются и не переходят в генеративную фазу [19].

Принимались во внимание методы, применявшиеся для искусственного заражения льна масличного возбудителем фузариоза Fusarium oxysporum var. orthoceras в лабораторных условиях (внесение порошка инокулюма в рядок и перемешивания с грунтом) [20].

Цель исследования ‒ разработать элементы технологии лабораторного экспресс-метода оценки чувствительности растений подсолнечника к поражению возбудителем фомоза на ранних стадиях их развития для использования в селекции на устойчивость к болезни.

Материалы и методы. При создании экспресс-метода оценки чувствительности растений к поражению фомозом в лабораторных условиях для создания инфекционного фона использовали искусственно зараженные семена подсолнечника, которые готовили следующим образом. Семена промывали под проточ- ной водой и замачивали на 10 минут, затем в равных количествах распределяли по колбам объемом 250 мл. Колбы закрывали фольгой, сверху пергаментной бумагой, фиксировали резинкой и автоклавировали в течение 30 мин при давлении 1,2 атм. На стерильные семена разливали одинаковое количество ранее приготовленной питательной среды овсяный агар (ОА) и встряхивали для равномерного ее распределения по поверхности семян. Для заражения семян использовали наиболее агрессивный изо-лят P. lindquistii, выделенный из пораженных стеблей подсолнечника в моноспоровую культуру на питательной среде ОА в чашках Петри. Одинаковые высечки 14-дневных колоний возбудителя фомоза помещали в колбы с семенами. Колбы герметично закрывали, ставили в термостат и выдерживали при температуре 25 °С и 16-часовом фотопериоде. Через 30 дней искусственно зараженные семена равномерно (в один слой) раскладывали на дно пластиковых контейнеров площадью 13 х 13 см. Дно контейнеров предварительно выстилали фильтровальной бумагой. Экспериментальные дозы инфекционной нагрузки составляли 10, 15 и 19 г. Сверху заражённых семянок насыпали стерильный речной песок по 750 г в каждый. В контрольном варианте вместо заражённых использовали стерильные семена подсолнечника. В увлажненный песок высевали семена подсолнечника сорта ВНИИМК 8883 и двух гибридов Меркурий и Альтаир в 4-кратной повторности, по 25 штук в каждой, и поливали водой по 200 мл. Растения инкубировали в камерах искусственного климата Биотрон-5 до фазы 2-й пары настоящих листьев. Песок по мере высыхания поливали отстоянной водопроводной водой. Растения выкапывали на 16-й день от момента посева семян, корневую систему отмывали проточной водой и по внешним симптомам оценивали ее состояние. Для 116

этого применяли разработанную нами 6-балльную шкалу:

0 баллов - растения внешне здоровые в фазе второй пары настоящих листьев главный корень и боковые корни первого и второго порядка хорошо развиты;

• 1    балл - растения внешне здоровые, у главного корня сгнил кончик на 0,5 см, боковые корни первого и второго порядка хорошо развиты;

• 2    балла - растения внешне здоровые, сгнил главный корень на 50 %, боковые корни первого и второго порядка хорошо развиты;

• 3    балла - растения внешне здоровые, сгнил главный корень на 70 %, боковые корни хорошо развиты;

• 4    балла - растения по высоте на 2-4 см меньше здоровых, полностью сгнил главный корень, развиты придаточные корни;

• 5    баллов - растения по высоте в 2 раза меньше здоровых, полностью сгнил главный корень, слабо развиты придаточные корни;

• 6    баллов - растения сильно угнетены, со сгнившей корневой системой, некроз перешел на гипокотиль либо семена полностью сгнили в субстрате.

Результаты и обсуждение. Для успешного инфицирования корневой системы всходов подсолнечника в камере Биотрон-5 поддерживалась температура 24 °С днем, 20 °С ночью при 16-часовом фотопериоде и влажности 70 %. Этот режим являлся благоприятным и для прорастания семян подсолнечника. Всходы появились на 3-й день от момента посева семян подсолнечника: в контрольном варианте и при дозах инфекционной нагрузки 10 и 15 г. Внесение инфекционного начала возбудителя фо-моза в дозе 19 г на дно контейнеров приводило к длительному периоду появления неравномерных всходов (5–7 дней) (рис. 1) в сравнении с контрольными растениями.

а

б

в

Рисунок 1 ‒ Всходы растений подсолнечника гибрида Альтаир на 6-й день в пластиковых контейнерах при внесении на дно разных доз инфекционной нагрузки Plenodomus lindquistii, 2019 г. (ориг.):

а – 10 г; б – 15 г; в – 19 г

На момент учета отмечали растения подсолнечника без внешних признаков поражения корневой системы (0 баллов) и со слабой степенью (1 балл). К слабой степени поражения относили растения, которые находились в фазе второй пары настоящих листьев, были одинаковыми по высоте в сравнении с контрольными вариантами, имели главный корень с повреждением кончика на 0,5 см и здоровые, хорошо развитые боковые корни первого и второго порядка.

Растения со средней степенью поражения (2–3 балла) отличались от контрольных по высоте на 1–2 см, имели сгнивший на 50–70 % главный корень и хорошо развитые здоровые боковые корни первого и второго порядка (рис. 2). Отсутствовали внешние симптомы поражения надземных органов растений.

Рисунок 2 ̶ Поражение главного корня растений гибрида Альтаир на 50 % (слева) и 70 % (справа), 2019 г. (ориг.)

С увеличением дозы инфекционной нагрузки в повторностях преобладали растения подсолнечника с сильной степенью поражения (4 и 5 баллов), у которых главный корень сгнивал до корневой шейки, но были развиты придаточные корни, отходящие от гипокотиля (рис. 3 а). Благодаря им растения устойчиво укоренялись в песке. Такие растения отличались от контрольных по высоте на 2 см и более. У некоторых растений корневая шейка увеличивалась в размерах (рис. 3 б), но внешние симптомы поражения на стебле и листьях отсутствовали. Мы полагаем, что утолщение корневой шейки может быть защитной реакцией против 117

дальнейшего распространения инфекции по растению. Разросшиеся здоровые ткани шейки могут механически препятствовать росту мицелия гриба. Необходимо отметить, что в селекционных посевах центральной базы ВНИИМК такие растения подсолнечника визуально здоровы, но при избытке влаги в почве или в засушливые годы при сильном ветре, чаще во второй половине вегетации, единичные растения полегают, из-за отсутствия главного корня. Аналогичные симптомы поражения растений подсолнечника могут вызывать представители грибов из родов Fusarium Link., Verticillium Nees. , Sclerotium Tode (Macrophomina phaseolina Tassi) и комплекс бактерий.

а

б

Рисунок 3 ‒ Корневая система у растений подсолнечника гибрида Меркурий, пораженная возбудителем фомоза Plenodomus lindquistii, 2019 г. (ориг.): а ‒ стержневой корень сгнил до корневой шейки, придаточные корни развиты;

б ‒ утолщение корневой шейки

К нежизнеспособным (6 баллов) относили проростки со сгнившим полностью главным корнем, отсутствием боковых корней и распространением некроза на гипокотиль и семядольные листья. Инфицированные растения легко поддавались выдергиванию из песка. В отдельных случаях всходы не появлялись и сгнивали в песке.

По результатам экспериментальных данных, при испытании разных доз инфекционной нагрузки было выявлено неодинаковое угнетающее действие гриба на всхожесть, состояние корневой системы в фазе 2-й пары настоящих листьев подсолнечника (таблица). При внесении инфекционной нагрузки 10 г у сорта ВНИИМК 8883 и двух гибридов – Меркурий и Альтаир – из всех учетных растений отмечено 22–32 % со здоровой корневой системой, тогда как при дозах 15 и 19 г такие растения отсутствовали.

Таблица

Количество растений подсолнечника (%) с различной степенью поражения корневой системы возбудителем фомоза при разных дозах инфекционной нагрузки в камере искусственного климата г. Краснодар, ЦЭБ, ВНИИМК, 2020 г.

Степень поражения	Балл	Поражено возбудителем фомоза, %
		1*  2*  3*  1*  2* 3*  1* 2*  3*
		Инфекционная нагрузка
		10 г			15 г			19 г
Не поражено	0	22	22	32	0	0	0	0	0	0
Слабая	1	39	39	37	13	30	20	0	0	0
Средняя	2	13	12	12	28	47	38	0	0	0
	3	13	14	17	37	17	27	16	10	34
Сильная	4	3	6	2	6	2	5	58	60	40
	5	0	0	0	3	0	2	14	18	14
Нежизнеспособные	6	10	7	0	13	4	10	12	12	12
Контроль (корневая система не поражена)		0	0	0	0	0	0	0	0	0

Примечание: 1* – ВНИИМК 8883; 2* – Меркурий; 3* – Альтаир

Количество растений подсолнечника со слабой степенью поражения корневой системы при дозе инокулюма 10 г у сорта и двух гибридов составило 37–39 %,при дозе 15 г – наибольшее количество было у гибрида Меркурий – 30 %, а наименьшее у сорта ВНИИМК 8883 – 13 %, но при дозе 19 г не выделены растения с такими симптомами поражения. При внесении инфекционной нагрузки 19 г выявлены в основном растения со сгнившим главным корнем: у сорта ВНИИМК 8883 и гибрида Меркурий они составили 72 и 78 % соответственно, у гибрида Альтаир – 54 %. В контроле у всех изученных растений сорта и двух гибридов не отмечали внешних симптомов поражения надземной и подземной части.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что инфекционная нагрузка 10–15 г подходит для использования в экспресс-методе оценки чувствительности корневой системы растений подсолнечника к поражению фомозом. Очевидно, что для отбора на устойчивость пригодны растения со слабой и средней степенью поражения (1, 2 и 3 балла). Растения с отсутствием главного корня, но с хорошо развитыми придаточными корнями можно использовать, когда у ценного селекционного материала отсутствуют более устойчивые растения.

Вывод. При испытании разных доз инфекционной нагрузки возбудителя фо-моза P. lindquistii выявлены внешние симптомы неодинакового поражения корневой системы растений подсолнечника в фазе 2-й пары настоящих листьев. Разработана 6-балльная шкала для учёта этих симптомов и степени поражения растений. Из трёх испытанных доз применённой инфекционной нагрузки при создании инфекционного фона в использованных контейнерах наиболее подходят 10–15 г с количеством субстрата (стерильный речной песок) 750 г. Дальнейшее увеличение инфекционной нагрузки не даёт возможности выявить растения со слабой и средней степенью поражения.

Инфекционная нагрузка 10 г позволяет отобрать более 50 % растений подсолнечника без видимых симптомов поражения корневой системы и со слабой степенью. Достоинство экспресс-метода в том, что в камерах искусственного клима- та за короткий период времени (16 дней) возможно без больших затрат труда и средств выявить устойчивые к поражению возбудителем фомоза растения (образцы) подсолнечника на ранних стадиях развития.