Эндофитные микроорганизмы как промоутеры роста растений в культуре in vitro

Размножение растений in vitro — развитое направление биотехнологии, однако для многих культур, в первую очередь для сортов древесных, до сих пор не разработаны эффективные протоколы микроразмножения (1, 2). Основные причины этого заключаются в низком выходе стерильных эксплантов на этапе введения в культуру и низких коэффициентах размножения и укоренения микропобегов в пассажах. Поверхностная стерилизация эксплантов и обработки антибиотиками не освобождают ткани растений от эндофитной микрофлоры, но часто провоцируют вирулентность обитающих в них латентных микроорганизмов (3). В процессе культивирования бактерии и грибы могут проявиться в первом или, что происходит чаще, после нескольких пассажей (так называемая вторичная инфекция) (4

6). К тому же даже при отсутствии видимых следов микроорганизмов в культуре эксплантов эффективность размножения и укоренения микропобегов многолетних растений зачастую низка (7, 8), причиной чего также может быть нарушение баланса эндофитных бактериальных сообществ (3).

Эндофитные микроорганизмы способствуют росту и развитию растения-хозяина благодаря выработке фитогормонов, улучшению транспорта воды и питательных веществ, действию механизмов биологической защиты и индуцированной системной устойчивости к фитопатогенам (9).

Метаболическая активность и характер клеточной стенки растения играют ключевую роль в колонизации растения-хозяина микроорганизмами (10). На разных стадиях колонизации врожденный иммунитет растения подавляется посредством фитогормонального сигналинга, что приводит к улучшению совместимости между эндофитом и растением (11). Согласно последним данным, растения и микроорганизмы эволюционируют совместно, и даже в условиях «стерильной» культуры тканей in vitro, возможно, нет ни одного растения, свободного от микроорганизмов (12, 13). Эти данные подтверждаются в многочисленных работах, в том числе в наших исследованиях, где визуально отмечалось появление микроорганизмов в асептических культурах Pelargonium , Citrus spp . , Camellia sinensis , Hydrangea macrophylla и многих других многолетних видов при многократном субкультивировании (14, 15). Локализация микроорганизмов в растении-хозяине различна: они встречаются в апопласте, в межклеточных пространствах и просвете дифференцированных мертвых клеток (клетки склеренхимы и ксилемы) органов (корней, ветвей, листьев, цветков, плодов и семян), очень редко — внутри клетки (16).

Первые обзоры, посвященные применению микроорганизмов в культурах растительных тканей in vitro, опубликовали J. Novak (17) и M.K. Rai (18). J. Novak ввел термин «биотизация» и обобщил положительные примеры ее применения при микроразмножении растений. Во второй статье приводятся примеры микоризации культивируемых in vitro растений, рассматриваются проблемы поиска штаммов и получения чистой культуры, возможности применения смешанных грибных культур. В недавно опубликованном обзоре российских коллег сделан акцент на идентификацию и классификацию бактериальных микроорганизмов, их возможную роль в культуре эксплантов in vitro (5). После этого обзоры о положительных результатах применения бактериальных и грибных эндофитов при размножении растений in vitro не публиковались. Заполняя пробел, мы суммировали успехи, достигнутые в последние годы в биотизации растительных культур in vitro грибными и бактериальными микроорганизмами, и выделили перспективные направления исследований в этой области. Кроме того, в нашем обзоре кратко затронуты механизмы усиления роста и защитных реакций растений эндофитными микроорганизмами.

Биостимуляция и биопротекторный потенциал микроорганизмов in vitro. Для микроразмножения растений исследователи использовали широкий спектр микроорганизмов, грибов и бактерий. Оценивался эффект арбускулярных микоризных (19), эктомикоризных (18), эри-коидных микоризных (20) грибов. Положительные результаты отмечали при применении Beauveria bassiana (21), Piriformospora indica и другие представители семейства Sebacinales (22), Fusarium oxysporum (23), Ophistoma- подобных видов грибов (24), Phialocephala fortinii (25), Trichoderma harzianum и др. видов рода Trichoderma (26). Метаанализ влияния грибных эндофитов корней показал, что древесные растения, как правило, реагируют на их присутствие негативно, в то время как травянистые однодольные часто от-918

кликаются на инокуляцию положительно (27). Из бактерий изучались Aceto-bacter diazotrophicus (28), Achromobacter xylosoxidans (29), Azospirillum brasilense (30), Azotobacter chroococcum (31), Bacillus subtilis (32), B. megaterium (33), Burk-holderia phytofirmans (34), B. vietnamiensis (35), Enterobacter sp. (36), Klebsiella variicola (37), Microbacterium sp. (38), Pseudomonas fluorescens (39) и P. putida (40). Бактериальная инокуляция приводила к увеличению свежей и сухой массы побегов и корней, высоты растений, площади листовой поверхности и массы ризомы (19, 20), улучшенному укоренению in vitro (число и длина корней) (30), лучшей адаптации (процент акклиматизации, внешний вид растения) (41), раннему цветению и росту числа цветков, повышению устойчивости к стрессу и иммунитета (42), кроме того, наблюдались различия в профилях метаболитов (43, 44).

Полезное влияние микроорганизмов на рост и накопление биомассы связано с улучшением абсорбции питательных веществ тканями растения и продукцией различных вторичных метаболитов, регуляторов роста (45), хитинолитических ферментов, участвующих в защите от патогенов (46), и осмопротекторов, благодаря которым растения преодолевают абиотические стрессы (47). Ниже некоторые механизмы и примеры биостимуляции будут рассмотрены подробнее.

Рост растений может улучшаться напрямую благодаря вторичным метаболитам и фитогормонам, продуцируемым микробной клеткой эндофита. К примеру, Streptomices atrovirens ASU14 использует триптофан и синтезирует индолилуксусную кислоту ИУК (22 мкг/мл) (47). Ауксиноподобную активность отмечали также у птеридовой кислоты, которую синтезирует S. hygroscopicus TP-A0451 — эндофит растения Pteridium aquilinum (L.) Kuhn ex Decken (папоротник орляк обыкновенный) (48). Это вещество стимулирует удлинение корней и формирование адвентивных корней у гипокотилей фасоли Phaseolus vulgaris . Еще один класс соединений, вырабатываемый некоторыми эндофитами, — гиббереллины (49). Сильное ростстимулирующее влияние многих эндофитов объясняется также тем, что они могут превращать растительные экссудаты и макромолекулы в формы, усваиваемые другими ростстимулирующими микроорганизмами, что служит одним из механизмов биостимуляции роста растений (50).

Микрочеренки сосны Pinus pinaster Sol. и P. sylvestris L. укоренялись более эффективно при обработке штаммами Hebeloma cylindrosporum Ro-magnesi (51), а спонтанный ризогенез микропобегов лиственницы Larix eurolepsis, полученных из соматических зародышей, существенно возрастал в присутствии четырех эктомикоризных грибов, при этом увеличивалась длина и степень ветвления корней (52). В другом исследовании показано влияние Achromobacter xylosoxidans AUM54 и индолил-3-масляной кислоты (ИМК) на рост лекарственного растения Naravelia zeylanica (L.) DC in vitro. A. xylosoxidans — диазотрофная эндофитная бактерия, у которой выявлена выраженная способность усиливать поглощение NO3- корнями и снижать содержание этилена (предположительно благодаря выработке деаминаз) (53). Обработка растений этими эндофитными бактериями в сочетании с ИМК улучшала рост побегов, размноженных in vitro, приводила к увеличению длины и числа корней, содержания хлорофилла, азота, антиоксидантных ферментов (пероксидазы и супероксиддисмутазы) и повышала устойчивость к стрессу (уровень этилена) в сравнении с показателями в необработанном контроле. При раздельном применении бактерий и ИМК положительный эффект был существенно слабее (29). При инокуляции in vitro растений масличной пальмы Elaeis guineensis Jacq диазотрофными ри-зобактериями Acetobacter diazotrophicus и Azospirillum brasiliense происходило усиление роста корней и побегов за счет фиксации атмосферного азота (28). При этом A. brasiliense оказался более эффективным, чем A. diazotrophicus. Инокуляция микроразмноженных растений Handroanthus impetiginosus (Mart. ex DC.) Mattos штаммами A. brasilense Cd и Az39 стимулировала укоренение in vitro, снижая потребность в ауксине на 49 % на половинной среде MSG (30). На этой среде штамм Cd в сочетании с ИМК (30 мкM) индуцировал корнеобразование у 98 % побегов на 21 сут раньше, чем в контроле без инокуляции. У инокулированных побегов индекс биомассы возрастал со 127 до 286 %.

Инокуляция растений эндофитными микроорганизмами положительно влияла не только на корнеобразование, но и на увеличение биомассы растений in vitro, коэффициент размножения и синтез биологически активных веществ. Так, было описано выделение азотфиксирующих бактерий из сахарной свеклы и их положительное воздействие на рост микроразмноженных растений (36). Два азотфиксирующих бактериальных изолята (SC11, SC20; 10⁶ КОЕ/г сухой массы) получили из побегов и два (SR12, SR13; 10⁷ КОЕ/г сухой массы) — из корней растений в открытом грунте. Изоляты, идентифицированные как Enterobacter sp., продуцировали ИУК в чистых культурах, и ее синтез усиливался на питательной среде с триптофаном. Эти изоляты использовали для инокуляции микроразмно-женных растений. Максимальное повышение массы корней и побегов и наибольшую активность азотфиксации наблюдали в случае штамма SC20. У мяты перечной ( Mentha piperita ) при изучении роста in vitro и синтеза терпена в ответ на инокуляцию листьев грибными эндофитами отмечалось усиление роста растений, увеличение площади листовой поверхности, содержания сухого вещества, биомассы корней, а также повышение содержания ментола (24).

Непатогенные штаммы бактерий Paenibacillus glucanolyticus , Curto-bacterium pusillum и Methylobacterium extorquens были изолированы из культуры тканей растений хосты и малины (54). Этими бактериями инокулировали микропобеги хризантемы ( Chrisantemum ½ hortorum) , герберы ( Ger-bera jamesonii ), хосты ( Hosta japonica ) и розы ( Rosa sp.). Бактерии C. pusil-lum стимулировали формирование боковых побегов у всех изученных генотипов. При инокуляции M. extorquens число и длина побегов и корней у герберы и хосты и число побегов у хризантемы были выше, а длина побегов у хризантемы и розы и длина корней у розы — ниже, чем в неинокули-рованном контроле. P. glucanolyticus влиял на число и длину побегов у хризантемы и герберы, но при этом число корней у герберы и хосты оказалось ниже, чем в контроле без инокуляции, а длина корней у розы составила всего 0,2 см. Все три штамма бактерий ассимилировали атмосферный азот, а M. extorquens и P. glucanolyticus также синтезировали ИУК

Биофертилизация микроорганизмами увеличивает жизнеспособность размноженных in vitro растений на этапе акклиматизации ex vitro. Так, в исследованиях чешских ученых (20) из корней нескольких растений-хозяев, принадлежащих к порядку Ericales ( Vaccinium sp., Calluna sp., Rhododendron sp., Empetrum sp. и др.), было выделено более 200 штаммов эндофитных грибов. В этих экспериментах 10 % выделенных штаммов оказались эффективными и положительно влияли на рост микроразмно-женных растений видов рододендрона ( Rhododendron sp.) при акклиматизации ex vitro в торфяном субстрате. Негативного действия на рост растений-хозяев ни у одного из изолятов не наблюдали. В другой работе (55) при оптимизации схемы производственного размножения лекарственного растения баптизии Baptisia tinctoria in vitro было показано, что применение 920

арбускулярных микоризных грибов повышало процент акклиматизации микропобегов и укорененных микрорастений.

Таким образом, как свидетельствуют результаты исследований, со-культивирование микропобегов растений и эндофитных микроорганизмов может быть эффективным приемом преодоления сложностей, возникающих при микроразмножении in vitro у некоторых видов.

Биопротекторная активность эндофитов. Изучение потенциала штамма ризобактерий Pseudomonas sp. PsJN как стимуляторов роста и повышения устойчивости винограда ( Vitis vinifera L.) к серой гнили, вызываемой Botrytis cinerea , показало, что инокуляция приводит к значительному усилению роста растений, делая их более стойкими и жизнеспособными (56). Наблюдаемый эффект усиливался при пересадке. Сокультивирование с B. cinerea приводило к существенным различиям в агрессивности патогена у инокулированных и интактных растений. В присутствии изучаемого штамма растения становились более устойчивыми к патогену.

Еще один наглядный пример биопротекторного потенциала эндофитов — культура тканей банана (42). Одно из наиболее серьезных вирусных заболеваний банана вызывает Banana bunchy top virus (BBTV). Обработка микрорастений банана in vitro микробными инокулятами ( Pseudomonas fluorescens и Bacillus sp., выделенные из корней банана) повышала устойчивость растений к биотическим и абиотическим стрессам. Для этого микроразмноженные растения банана инокулировали штаммами Pseudomonas fluorescens Pf1 и CHA0 в сочетании с эндофитными бактериальными штаммама EPB5 и EPB22 (Pf1 + CHA0EP + B5 + EPB22), что существенно ограничивало развитие инфекции BBTV в полевых условиях (частота заражения 33,33 %, или на 60 % меньше, чем в контроле). Выработка защитных ферментов и белков была больше, а морфологические и физиологические характеристики оказались лучше у растений, обработанных ризосферными и эндофитными бактериями (в частности, растения реагировали на обработку усилением роста). В этом сообщении продемонстрирована индукция системной устойчивости у банана с помощью ассоциированных бактерий, что может иметь практическое значение для разработки приемов защиты культуры банана от вируса BBTV (42).

Некоторые авторы отмечают, что системный биопротекторный эффект зависит от степени колонизации тканей микробиотой (57). Так, у пшеницы наблюдаемый антагонизм эндофитов в отношении патогенной микрофлоры был в большей степени следствием активации защитных механизмов растения-хозяина, а не результатом прямых антагонистических отношений в микробиоте (58). В экспериментах по изучению влияния эндофитного гриба Neotyphodium lolii на индукцию специфических защитных механизмов заселенные растения оказались гораздо менее восприимчивы к инфекции Fusarium poae . У многолетних трав, заселенных эндофитами, количество хитиназ существенно выше, чем у интактных растений, и зависит от времени инокуляции (59).

Некоторые эндофиты способны положительно влиять на устойчивость растений к неблагоприятным абиотическим факторам (60). Так, микоризные грибы улучшают нейтрализацию натрия при солевом стрессе (61), что может служить механизмом повышения толерантности растений в условиях засолении. Подобный прием используют и в культуре тканей, чтобы усилить адаптивность растений к абиотическому стрессу (в частности, к солевому), и некоторые эндофиты рассматриваются при этом как полезные и эффективные инструменты (62).

В качестве примера приведем исследование эндофитных бактериальных сообществ у шести генотипов Prunus avium L., различающихся характером роста при микроразмножении in vitro (38). Для анализа некуль-тивируемых фракций эндофитных бактерий была составлена клоновая библиотека амплифицированных фрагментов 16S рДНК. Бактериальное разнообразие исследовали с помощью анализа длины рестрикционных фрагментов (restriction fragment length polymorphism — RFLP) рибосомальной ДНК с секвенированием клона для каждой определенной таксономической единицы. Для этого использовали праймеры 799f и 1492r-Y, позволяющие разделить амплифицированные фрагменты 16S рДНК. Очищенные ПЦР-про-дукты были клонированы в векторе pJet1.2 и перенесены в Escherichia coli DH10B. Устойчивые к ампициллину колонии E . coli отбирали и тестировали в ПЦР с использованием рестриктаз HpaII, HhaI и BsuRI. В результате преобладающей группой эндофитов оказались микобактерии Mycobacterium sp., выявленные в клоновых библиотеках у всех анализируемых генотипов рода Prunus. Другими доминантными бактериальными группами у легко-размножаемых генотипов были Rhodopseudomonas sp. и Microbacterium sp. Структура эндофитных сообществ существенно различалась у легко- и трудноразмножаемых in vitro генотипов: у первых выявили группы бактерий, стимулирующие рост растений.

Что касается промышленного применения эндофитов в биотехнологии и производства препаратов биоинокулянтов, то главная проблема заключается в поиске наиболее эффективного штамма или комбинации штаммов. Более 80 % эндофитов не выявляются при высеве на общепринятые питательные среды (71), что создает трудности при получении чистой культуры, идентификации и использовании многих штаммов. Кроме того, необходимо быть уверенным, что выделенный эндофит снова заселит внутренние ткани растений и будет оказывать положительный эффект. Еще одна трудность — совместимость эндофитов, выделенных из одного о вида растений с растениями другого вида.

Итак, один из инновационных подходов, признаваемый международными экспертами перспективным для формируемой сельскохозяйственной модели, заключается в применении биологизированных технологий на основе естественных процессов, происходящих в системе почва—растение. В этой связи ассоциированные с растением микроорганизмы и продукты 922

их метаболизма рассматриваются как ресурс при разработке биотехнологий и их применения для эффективной адаптации и укоренения микроклонов, а также в защите растений. При введении растительных эксплантов в стерильную культуру они подвергаются стрессовому воздействию из-за повреждения тканей и обработки агрессивными стерилизующими веществами, антибиотиками и др. Это может быть причиной внезапного возникновения вредоносных эндофитов в процессе последующего пассирования. Какой фактор изменяет характер взаимодействия эндофита и его хозяина, приводя к развитию патологического процесса вместо мутуалистических взаимоотношений, пока неясно. Единственным способом контролировать процессы в таких системах остается выбор оптимального времени пассирования, оптимальных условий культивирования и состава питательной среды для поддержания мутуалистического симбиоза, выгодного как для растения-хозяина, так и для его эндофитов.