Эритроцитарные и лейкоцитарные клеточные характеристики у коров, инфицированных Anaplasma marginale и вирусом бычьего лейкоза

Одну из глобальных ключевых проблем современного животноводства составляют потери от инфекционных заболеваний (1, 2). Существенно изменить ситуацию не удается, несмотря на совершенствование вакцин и антибиотиков и их активное применение. Предполагается, что более перспективным направлением может стать формирование групп животных с повышенной устойчивостью к наиболее распространенным патогенам. Однако для этого необходимы углубленные представления о механизмах развертывания инфекционного процесса и ключевых звеньях взаимодействия между патогеном и организмом хозяина.

В молочном скотоводстве самая распространенная причина экономических убытков — инфицированность вирусом энзоотического бычьего лейкоза (Bovine leukemia virus, BLV) (3, 4). В некоторых странах Южной Америки, например в Аргентине, 90,9 % стад крупного рогатого скота (КРС) заражено BLV (5). В связи со сложным влиянием на иммунную систему хозяина до сих пор не удается разработать методы эффективной вакцинации жи- вотных, защищающей их от этого ретровируса (6, 7). Контроль распространения BLV дополнительно осложняется тем, что, как правило, иммунная система хозяина осуществляет негативную селекцию против В-лимфоцитов, продуцирующих полноразмерные вирусные частицы (8). Для того чтобы предупредить распространение BLV, предложены различные программы по выявлению инфицированных животных на основании идентификации антител к BLV в периферической крови и (или) провирусной ДНК в геномах. В дополнение к иммунологическому и генетическому тестам применяют подсчет лимфоцитов в периферической крови животных. Сочетание всех трех методов наиболее эффективно и позволяет повысить надежность выявления инфицированных коров (1). Однако нужно учитывать, что инфицированность животных BLV часто сопровождается повышением чувствительности к бактериальным инфекционным агентам, таким как Mycobacterium bovis (9), к Escherichia coli (10), ростом заболеваемости маститом (11), что может, в свою очередь, приводить к изменениям числа лейкоцитов в периферической крови.

Механизмы иммунного ответа на инвазию A. marginale изучены недостаточно полно, но известно, что у КРС активируются CD4+ T-лимфоциты, секретирующие γ -интерферон, а также выработка антител IgG1 и IgG2 (преимущественно к иммуннодоминантному и гипервариабельному поверхностному белку MSP2 A. marginale , а также к белкам MSP1, MSP3, MSP4 и MSP5) (31-35). Предполагается, что действие антител направлено на нейтрализацию клеток A. marginale до их внедрения в эритроциты и (или) на опсонизацию с последующим фагоцитозом макрофагами (22).

В последние годы в качестве маркеров хронического воспаления, связанного, в том числе, с преднеопластическими состояниями при различных заболеваниях, широко используются соотношение числа нейтрофилов и лимфоцитов, число тромбоцитов и изменчивость эритроцитов по морфологическим характеристикам (36). Эти параметры можно определить на автоматическом гемоанализаторе, что позволяет получать достаточно объективные данные о модификациях гемопоэза при развитии патологии.

Для того чтобы оценить чувствительность скота, инфицированного BLV, к бактериальным инфекциям, и сопутствующие этому изменения морфологических показателей крови, в настоящей работе мы впервые протестировали коров голштинизированной черно-пестрой породы на присутствие провирусной ДНК BLV в геномах и A. marginale — в эритроцитах с учетом клеточного состав периферической крови (численность эритроцитов и лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов, эозинофилов, базофилов). Кроме того, сравнили средний объем и гетерогенность эритроцитов по диаметру (анизоцитоз) как показатели, отражающие изменение состояния (например, при приеме ряда антимикробных препаратов) и развитие патологий, включая гормональные отклонения, нарушения в работе костного мозга при лейкоцитозе, некоторые злокачественные заболевания. Обнаружено, что инфицирование животных BLV не способствует перекрестному заражению анаплазмой, более того, среди свободных от A. marginale больше половины животных инфицированы BLV и почти у трети выражен лейкоцитоз.

Цель работы заключалась в изучении изменчивости эритроцитарных и лейкоцитарных характеристик у специализированного молочного скота, естественно инфицированного Anaplasma marginale и вирусом бычьего лейкоза Bovine leukemia virus .

Методика . Кровь для исследования отбирали из яремной вены у черно-пестрых голштинизированных коров (67 гол.) в возрасте 2-5 лет (ЗАО «Можайское», Московская обл.).

Эритроцитарные и лейкоцитарные профили и характеристики эритроцитов определяли на автоматическом гематологическом анализаторе Abacus junior Vet5 («Diatron», Австрия; принцип работы основан на методе Культера). Использовали индивидуальные образцы свежей цельной периферической крови каждого животного (100 мкл), стабилизированной EDTA.

Носителей провирусной ДНК BLV выявляли с использованием радиальной иммунодиффузии по Манчини (РИД) и методом ПЦР, разработанным нами ранее (37). Методы оценки инфицированности животных A. marginale и степени риккетсемии подробно описаны нами ранее (38, 39).

Данные анализировали в программе Statistica 6.0 («StatSoft Inc.», США). Значимыми считали различия при P < 0,05. В таблицах приведены средние арифметические ( X ) и ошибки средних арифметических ( х ).

Результаты . Из 20 особей, свободных от провирусной ДНК BLV по двум тестам (реакция иммунодиффузии — РИД и ПЦР), 13 (65 %) были инфицированы A. marginale , а из 22 носителей провирусной ДНК BLV A. marginale выявили у 11 (50 %). То есть в группе животных, инфицированных BLV, не наблюдалось повышенной чувствительности к A. marginale .

Анализируя вовлеченность разных популяций клеток периферической крови в развитие инфекции A. marginale, мы определили их представленность у инфицированных A. marginale и свободных от инфекции коров (табл. 1). Согласно прилагаемым рекомендациям производителя гемоанализатора, все изученные показатели соответствовали физиологической норме для вида Bos taurus, за исключением явно повышенного содержания лейкоцитов у коров, не инфицированных бактериальным патогеном. То, что у инфицированных A. marginale животных число эритроцитов тоже оставалось в пределах нормы, может объясняться персистирующей стадией инфекционного процесса, на что указывали характерные при анаплазмоно-сительстве значения риккетсемии (от 1,58½105 до 2,31½106/мл крови) (28).

Статистически достоверные различия (P < 0,05) между инфицированными и свободными от A . marginale особями проявились только по лейкоцитам и лимфоцитам — в сторону уменьшения их популяции у инфицированных животных (см. табл. 1). Очевидно, что эти различия обусловлены тем, что в группу не инфицированных бактериальным патогеном попали инфицированные BLV животные с высоким лейкоцитозом (см. табл. 1). При этом из 6 коров с высоким лейкоцитозом (> 20½10⁹/л) лишь одна была заражена A. marginale , а 5 вошли в группу из 18 особей, свободных от ана-плазмы. Следовательно, изменения в профилях популяций лейкоцитов, индуцируемые BLV, не повышали вероятность инфицирования A. marginale.

1. Эритроцитарные и лейкоцитарные профили периферической крови у чернопестрых голштинизированных коров, инфицированных Anaplasma marginale и свободных от инфекции ( Х ± х , ЗАО «Можайское», Московская обл.)

Показатель	Допустимые пределы для Bos taurus	Не инфицированные A. marginale		Инфицированные A. marginale ( n = 23)
		всего ( n = 18)	свободные от Bovine leukemia virus ( n = 7)
Клеточная популяция: эритроциты, ½1012/л	5-10	6,53±0,18	6,83±0,18	6,23±0,18
лейкоциты, ½109/л	4-12	15,21±1,63*	10,18±0,67	10,87±0,98*
лимфоциты, ½109/л	2,5-7,5	9,85±1,77*	4,85±0,83	5,62±1,00*
моноциты, ½109/л	0-0,84	0,74±0,17	0,52±0,11	0,34±0,08
нейтрофилы, ½109/л	0,6-6,7	4,07±0,69	4,54±0,48	4,41±0,50
эозинофилы, ½109/л	0,1-1,0	0,51±0,09	0,45±0,05	0,49±0,06
базофилы, ½109/л	0-0,5	0,0089±0,0011	0,0110±0,0010	0,0104±0,0020
тромбоциты, ½109/л	100-800	87,72±35,23	10,29±6,32	86,91±33,94
Морфология эритроцитов: средний объем, fl	40-60	45,56±0,89	44,86±0,82	45,00±0,73
изменчивость по диаметру, %		19,66±0,33	20,83±0,40	19,63±0,38

* Различия между инфицированными и свободными от инфекции особями статистически значимы при

P < 0,05.

По эритроцитарной компоненте у неинфицированных животных статистически достоверными (P < 0,05) были корреляции между числом эритроцитов и эозинофилов ( r = - 0,5), эритроцитов и тромбоцитов ( r = - 0,5); между гетерогенностью эритроцитов по диаметру и числом лейкоцитов ( r = - 0,5), лимфоцитов ( r = - 0,5), тромбоцитов ( r = - 0,6) и базофилов ( r = +0,6). То есть у неинфицированных животных наблюдалась взаимосвязь между увеличением числа эритроцитов и уменьшением — эозинофилов и тромбоцитов (маркеры воспалительных процессов), а повышенная изменчивость эритроцитов по морфологии коррелировала с пониженной представленностью лейкоцитов и лимфоцитов. Несколько иные достоверные корреляционные взаимоотношения выявили у инфицированных животных: между числом эритроцитов и нейтрофилов — r = +0,5, эритроцитов и базофилов — r = +0,5; между гетерогенностью эритроцитов по диаметру и числом базофилов — r = +0,4, числом тромбоцитов — r = - 0,7 и средним объемом эритроцитов — r = - 0,6. Положительная корреляция числа эритроцитов и нейтрофилов позволяет предположить активацию неспецифического иммунного ответа у инфицированных A. marginale коров.

Таким образом, общепринятое представление, что инфицирование животных одним патогеном, сопровождаемое изменением иммунореактивности, способствует повышению чувствительности к другому, в случае инфекций A. marginale и BLV не получает подтверждения. В целом это соответствует заключению ряда авторов о том, что каждый инфекционный 394

агент специфически взаимодействует с иммунной системой хозяина, и для разных патогенов такие механизмы часто не пересекаются (40).

Инфицированность животных ретровирусом BLV (без учета наличия анаплазмы, поскольку ее присутствие, судя по представленным данным, не меняет численного соотношения клеточных популяций) (см. табл. 1) оценивали в традиционном тесте на наличие антител к белкам оболочки BLV в периферической крови (РИД) и по интеграции провирусной ДНК BLV в геном хозяина. Из 67 исследованных коров 33 были серонегативными в РИД, но при этом у одной в геноме содержалась провирусная ДНК BLV. У 7 из 34 животных с положительным результатом в РИД отсутствовала провирусная ДНК BLV. Эти данные соответствуют выводам выполненных нами ранее исследований, в которых также не наблюдали полного совпадения между оценками инфицированности животных в РИД и результатами обнаружения провирусной ДНК BLV (41). Следует отметить, что такое несовпадение наблюдалось при использовании для выявления интеграции провирусной ДНК BLV разных вирусных генов ( env , gag , pol ). Полученные данные согласуются с недавним сообщением M. Nishiike и соавт. (1). Обследовав 774 коровы, они показали, что у 7 % животных при наличии в крови антител к BLV провирусная ДНК BLV, присутствие которой в геноме животных оценивали по наличию нуклеотидных последовательностей вирусного гена tax , не выявлялась.

Не исключено, что в основе такого расхождения могут лежать различия между животными по числу В-лимфоцитов, инфицированных BLV, и иммунному ответу на инфекцию. В этой связи мы сравнили распределение популяций клеток периферической крови у инфицированных и неин-фицированных BLV коров (табл. 2).

2. Эритроцитарные и лейкоцитарные профили периферической крови у чернопестрых голштинизированных коров, свободных от инфекции и инфицированных вирусом бычьего лейкоза при разном развитии лейкоцитоза ( Х ± х , ЗАО «Можайское», Московская обл.)

Показатель	РИД - , BLV - ( n = 21)	РИД+,	BLV+
		без высокого лейкоцитоза ( n = 18)	с максимальным лейкоцитозом ( n = 6)
Клеточная популяция:
эритроциты, ½1012/л	6,59±0,19	6,15±0,17	6,34±0,36
лейкоциты, ½109/л	10,00±0,56	11,73±0,88	25,49±1,01
лимфоциты, ½109/л	4,14±0,24	6,12±0,73*	21,70±1,08**
моноциты, ½109/л	0,35±0,06	0,28±0,09*	1,61±0,24*
нейтрофилы, ½109/л	5,10±0,44	4,63±0,83**	1,66±0,36**
эозинофилы, ½109/л	0,43±0,06	0,59±0,09	0,51±0,18
базофилы, ½109/л	0,0119±0,0011	0,0088±0,0027	0,0067±0,0021
тромбоциты, ½109/л	12,90±9,91	160,81±47,55**	122,33±78,28**
Нейтрофилы:лимфоциты	1,26±0,10	0,88±0,21*	0,08±0,02*
Морфология эритроцитов:
средний объем, fl	44,19±0,83	46,12±0,86	46,50±1,09
изменчивость по диаметру, %	20,84±0,27	18,55±0,34	18,83±0,31

П р и м е ч а н и е. РИД — реакция иммунодиффузии, BLV — вирус бычьего лейкоза (определяли по наличию провирусной ДНК в геноме методом ПЦР).

*, ** Соответственно P < 0,05 и P < 0,01 — пороги статистической достоверности различий между инфицированными и свободными от инфекции BLV особями.

У животных с высоким лейкоцитозом наблюдалось статистически достоверное (P < 0,05) повышение числа лимфоцитов, моноцитов и тромбоцитов, понижение — нейтрофилов и, соответственно, соотношения числа нейтрофилов и лимфоцитов. У инфицированных BLV коров без выраженного лейкоцитоза существенные отличия от неинфицированных обнаруживались только по числу тромбоцитов (см. табл. 2). При этом у 7 коров с РИД+, но без встройки провирусной ДНК BLV распределение клеточных популяций в периферической крови соответствовало физиологической норме (табл. 3). Особенностью этой группы животных оказался необычно высокий статистически достоверный (P < 0,05) коэффициент корреляции между числом лейкоцитов и нейтрофилов (r = 0,871178).

3. Распределение клеток периферической крови у черно-пестрых голштинизиро-ванных коров с антителами к вирусу бычьего лейкоза в отсутствие прови-русной ДНК ( n = 7, Х ± х , ЗАО «Можайское», Московская обл.)

Клеточная популяции	Показатель
Эритроциты, ½1012/л	6,40±0,19
Лейкоциты, ½109/л	8,11±0,47
Лимфоциты, ½109/л	3,57±0,13
Моноциты, ½109/л	0,31±0,10
Нейтрофилы, ½109/л	3,59±0,61
Эозинофилы, ½109/л	0,64±0,13
Базофилы, ½109/л	0,0042±0,0020

П р и м еч а ни е. Наличие антител определяли в реакции иммунодиффузии (РИД), провирусной ДНК вируса бычьего лейкоза в геноме коров — методом ПЦР.

У коров, свободных от BLV (по результатам РИД и отсутствию провирусной ДНК) обнаружилось множество положительных корреляций между числом агранулоци-тов и гранулоцитов, а также тромбоцитов (табл. 4): между числом лимфоцитов и моноцитов, лимфоцитов и нейтрофилов, лимфоцитов и базофилов, моноцитов и эозинофилов, нейтрофилов и базофилов, эозинофилов и базофилов, моноцитов и тромбоцитов, эозинофилов и тромбоцитов (см. табл. 4). То есть у животных, свободных от ин- фекции, изменения в представленности производных белого ростка в периферической крови были тесно взаимосвязаны. Инфицированность BLV (РИД+ и встройка провирусной ДНК) сопровождалась фактическим разрушением всех этих положительных корреляций в группе клеток белого ростка крови. У зараженных особей проявлялись положительные корреляции между числом лимфоцитов и моноцитов, отрицательные — базофилов и тромбоцитов, лимфоцитов и моноцитов, лимфоцитов и нейтрофилов. В группе инфицированных коров при относительно низком лейкоцитозе статистически достоверными были только две корреляции: положительная — между размером популяций лимфоцитов и моноцитов, отрицательная — базофилов и тромбоцитов, а на фоне высокого лейкоцитоза (> 20½109/л)

сохранялась только одна статистически достоверная негативная корреляция — для соотношения лимфоцитов и базофилов.

4. Коэффициенты корреляции между числом агранулоцитов, гранулоцитов и тромбоцитов в образцах периферической крови у черно-пестрых голштинизи-рованных коров, свободных от вируса бычьего лейкоза ( n = 20, ЗАО «Можайское», Московская обл.)

Клеточная    Лимфоциты Моноциты Нейтрофилы Эозинофилы Базофилы популяция

Тромбоциты

Лимфоциты        1,000000     0,514220*      0,507795*      0,382689      0,591109* Моноциты         0,514220*     1,000000      - 0,244767      0,675024*     0,147069 Нейтрофилы       0,507795*     - 0,244767       1,000000      0,151900      0,626046* Эозинофилы       0,382689     0,675024*      0,151900       1,000000      0,464138* Базофилы          0,591109*     0,147069      0,626046*      0,464138*     1,000000 Тромбоциты        0,064150     0,488814*      - 0,285535      0,558992*     - 0,055497

0,064150 0,488814* - 0,285535 0,558992* - 0,055497 1,000000

П р и м еч а ни е. У животных не выявлялись антитела к вирусу бычьего лейкоза в реакции иммунодиффузии и провирусная ДНК в геноме при определении методом ПЦР.

* Корреляции статистически значимы при P < 0,05.

В целом, с учетом физиологической нормы для разных популяций клеток периферической крови выраженные отличия инфицированных BLV животных от контрольной группы проявились в тромбоцитозе, на фоне лейкоцитоза — в резком падении количества нейтрофилов.

Нейтрофилы формируют первую линию клеточной защиты от патогенов, в значительной мере обеспечивая врожденный иммунитет против микроорганизмов. При фагоцитировании патогена нейтрофилы продуцируют свободные радикалы, которые его разрушают. Обнаружено, что в молоке коров, зараженных BLV, содержание нейтрофилов существенно умень- шается (11), при этом для особей с лейкоцитозом и высокой нагрузкой провирусной ДНК BLV характерна пониженная экспрессия γ-интерферона (IFN-γ) моноцитами периферической крови. IFN-γ способствует фагоцитозу и продукции свободных радикалов нейтрофилами, что может, в частности, объяснять снижение функции нейтрофилов наряду с уменьшением их количества у инфицированных BLV коров. В ранних публикациях также отмечался тот факт, что сыворотка крови инфицированных BLV коров подавляет фагоцитарную активность нейтрофилов (42).

Накоплен большой объем данных о выраженном влиянии экспрессии провирусной ДНК BLV, в частности гена tax , на клеточную стресс-реактивность, апоптоз, темпы клеточного обновления, иммунную систему инфицированных животных (7, 43, 44). Ранее нами было показано, что именно у животных с высоким лейкоцитозом удается выявить экспрессию вирусной РНК BLV в RT-PCR (4). Эти данные совпадают с результатами многих исследователей, в частности японских, которые обнаружили наибольшее количество вирусной РНК BLV в периферической крови коров с самым высоким лейкоцитозом (1). Очевидно, что повышенная экспрессия провирусной ДНК BLV, которая сопровождается лейкоцитозом, неизбежно будет приводить к изменениям сетевых взаимоотношений между различными популяциями лейкоцитов, что мы наблюдали в своем исследовании.

Таким образом, выявленная нами распространенность сочетанной инфекции BLV и A. marginale и изменения в клеточных популяциях периферической крови коров не отражают взаимного увеличения чувствительности к этим патогенам. Одна из особенностей профилей популяции лейкоцитов (в основном, соответствующих норме), отличающая инфицированных A. marginale коров от неинфицированных, — статистически достоверная положительная корреляция между числом эритроцитов и нейтрофилов.

В отношении BLV полученные данные свидетельствуют о том, что ни один из имеющихся к настоящему времени методов подтверждения инфицированности этим вирусом (обнаружение антител к антигенам BLV в РИД, ПЦР-анализ на наличие провирусной ДНК BLV, превышение числа лейкоцитов относительно физиологической нормы 10-12½109/л) не исключает ложноположительных или ложноотрицательных результатов. Самое существенное отличие при инфицированности BLV (даже на фоне низкого лейкоцитоза) заключается в исчезновении существующих в норме корреляционных связей между размером разных популяций лейкоцитов, свидетельствующее о разрушении сетевых взаимоотношений между ними. Обращает на себя внимание то, что у животных с высоким лейкоцитозом наблюдается выраженная нейтрофилопения, что совпадает с данными литературы об изменении содержания нейтрофилов в молоке на фоне инфи-цированности BLV и высокого лейкоцитоза (11). Учитывая необходимость в более простом способе выявления наиболее инфекционно опасных животных в промышленных условиях, по-видимому, целесообразно одновременно оценивать вирусную нагрузку (количество вирусной РНК BLV в периферической крови) и выраженность лейкоцитоза.

Итак, инфицирование вирусом бычьего лейкоза (BLV) не способствует перекрестному заражению Anaplasma marginale . Статистически достоверные корреляции (P < 0,05) по эритроцитарной компоненте у неинфи-цированных и инфицированных анаплазмой животных неодинаковы, а положительная связь между количеством эритроцитов и нейтрофилов позволяет предположить активацию неспецифического иммунного ответа при инфекции A. marginale . Инфицированность BLV приводит к разрушению всех имеющихся положительных корреляций между размером популяций 397

клеток белого ростка крови, наблюдаемых у неинфицированных особей. Выраженные достоверные различия проявляются в развитии тромбоцитоза, а у особей с лейкоцитозом — в резком падении количества нейтрофилов. При выявлении в стадах инфекционно опасных по BLV животных наиболее целесообразно оценивать степень лейкоцитоза в сочетании с вирусной нагрузкой (количеством РНК BLV в периферической крови).