Этологические и генетические основы устойчивости медоносной пчелы (Apis mellifera) к клещу Varroa destructor (обзор)

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда, проект ¹ 25-16-00176.

Медоносная пчела ( Apis mellifera ) — не только ключевой опылитель в глобальных экосистемах и сельском хозяйстве (1-3), но и важнейший модельный объект для изучения социального поведения, иммунитета и адаптации (4). Популяции пчел по всему миру вынуждены приспосабливаться к разнообразным климатическим условиям, новым патогенам, паразитам (например, таким как клещ Varroa destructor ) и антропогенным факторам (5-7). Понимание генетических основ этих адаптивных признаков — одна из главных задач современной пчеловодческой науки и практики.

Одним из приоритетных направлений остается поиск генетических маркеров устойчивости к самому опасному паразиту пчел — клещу Varroa destructor (8-11). Исследования в этой области сфокусированы на двух основных поведенческих механизмах. Первый — это гигиеническое поведение, второй — поведение по уходу (груминг) (12-15).

Цель настоящего обзора — систематизировать современные научные подходы к изучению генетических и поведенческих механизмов устойчивости медоносной пчелы ( Apis mellifera ) к паразитическому клещу Varroa destructor и оценить перспективы их применения в селекционных программах, включая традиционные методы отбора и инновационные геномные технологии.

В настоящее время заражение пчелиных семей V. destructor оказывает негативное влияние на пчеловодство по всему миру. Внутри запечатанных ячеек с расплодом материнские особи клещей и их потомство прокалывают наружные покровы хозяина и используют в качестве источника пищи жировое тело развивающейся куколки (16, 17). Это ослабляет куколку и сокращает продолжительность жизни выходящей из нее взрослой особи (18). Такие имаго оказываются в меньшей степени способны к добыче корма и поддержке пчелиной семьи (19). Уменьшение продолжительности жизни отдельной особи трансформируется в негативные последствия для приспособленности всей пчелиной семьи, причем размер осенней популяции Var-roa выступает в качестве существенного прогностического фактора зимней смертности пчел (20). В то же время, несмотря на то, что начальная скорость гибели пчелиных семей может быть очень высока, в популяциях A. mellifera , не обрабатываемых против Varroa , возможно достаточно быстрое формирование устойчивости к последним (21, 22). Кроме того, эти клещи выступают в качестве векторов распространения многих бактериальных, грибковых и вирусных инфекционных заболеваний пчел, включая вирус острого пчелиного паралича (acute bee paralysis virus, ABPV) (23, 24), вирус деформированного крыла (deformed wing virus, DWV) (25-28) и вирус медленного пчелиного паралича (slow bee paralysis virus, SBPV) (29, 30).

Особи A. mellifera , проявляющие признаки гигиенического поведения, обладают способностью детектировать, распечатывать и удалять зараженный расплод из улья до того, как болезнетворный организм достигнет инфекционной стадии (14, 15, 31, 32). Исследования последних лет значительно углубили понимание нейробиологических основ гигиенического поведения, чувствительного к Varroa (varroa-sensitive hygiene, VSH), подтвердив модель разделения труда между так называемыми сенсорами и исполнителями.

Процесс инициируется ограниченной группой рабочих пчел (сенсоров), обладающих повышенной чувствительностью обонятельной системы. A. McAfee с соавт. (33) не только подтвердили роль олеиновой кислоты как ключевого триггера, но и идентифицировали специфические обонятельные рецепторы (оlfactory receptors, ORs) в антеннах пчел, избирательно настроенные на обнаружение этого «запаха смерти». Показано, что у пчел VSH-942

линий экспрессия таких рецепторов статистически значимо выше, что обеспечивает их пороговую чувствительность к летучим сигналам от зараженного расплода, исходящим через восковую крышечку (34).

После того как сенсор идентифицирует и начинает вскрывать ячейку, к работе подключаются исполнители. K.M. Wagoner с соавт. (35) показали, что этот процесс высокоскоординирован. Исполнители реагируют не столько на первоначальный запах, сколько на вибрационные или тактильные сигналы, испускаемые сенсором в процессе вскрытия, а также на усилившийся обонятельный стимул из частично вскрытой ячейки. То есть весь процесс гигиенического поведения в целом по большей части зависит от тех рабочих пчел, которые первыми детектируют зараженный паразитами расплод и инициируют его распечатывание (10, 36-38). Это позволяет другим особям (вероятно, менее чувствительным) более явно распознать стимулы от пораженного расплода через частично вскрытую крышечку и завершить его гигиеническое удаление.

Для исследования гигиенического поведения пчел часто используют полевой метод, который состоит в регистрации времени, необходимого пчелиной семье на то, чтобы обнаружить, распечатать и удалить расплод c участка сот размером 5 на 6 см, содержащего около 100 личинок и куколок на сторону. Опытный фрагмент предварительно вырезают с рамки с расплодом, выдерживают в течение 1 сут при - 20 ° С и затем помещают в улей с исследуемой семьей (39).

Известно, что на выраженность гигиенического поведения влияют условия окружающей среды. Например, поступающий нектар увеличивает скорость удаления погибшего и больного расплода (40, 41). Другой фактор, вносящий вклад в вариацию результатов исследования, может быть связан с источником замороженного расплода: пчелы могут быстрее удалять расплод с чужим запахом по сравнению с замороженным расплодом, полученным из их же улья (42).

Таким образом, инициация гигиенического поведения зависит как от чувствительности обоняния индивидуальной пчелы, так и от профиля запаха и интенсивности стимула, которым служит аномально развивающийся расплод (43). При этом известно, что заражение Varroa представляет собой менее интенсивный стимул для активизации гигиенического поведения по сравнению с другими заболеваниями расплода.

Следует отметить, что этот метод имеет ряд недостатков: низкая стандартизация (результаты сильно зависят от источника расплода — чужой удаляется быстрее своего); силы семьи и сезонных условий (наличие медосбора); субъективность оценки (визуальное определение очищенной ячейки персоналом может варьировать) и трудоемкость (метод требует много времени и ручного труда, что затрудняет масштабные исследования). Эти факторы приводят к значительной вариабельности результатов и снижают воспроизводимость теста.

Альтернативный метод оценки гигиенического поведения, предложенный Л.С. Кривцовой (44), основан на регистрации способности пчелиной семьи удалять инородные объекты из гнездового пространства. В качестве тестового материала используют стандартизированный образец бумаги, который размещают на дне улья. Количественная оценка гигиенической активности осуществляется посредством измерения разницы массы бумажного образца до и после нахождения в улье в течение установленного временного интервала. Метод тоже имеет ряд недостатков (сила семьи, конструкция улья и др.) и не подходит для массовой оценки.

О.А. Модин (45) для оценки гигиенического поведения предложил использовать стандартизированные тест-объекты из акварельной бумаги, размещаемые в центральной части гнезда. Метод позиционируется как усовершенствованный подход к описанию гигиенического поведения, позволяющий минимизировать субъективность оценки и обеспечить сопоставимость результатов между различными исследованиями. Используя этот метод на пчелах карпатской и приокского типа среднерусской пород, А.З. Бран-дорф с соавт. (46) установили высокую гигиеническую активность последних (78,4 %), в то время как у карпатских показатель составлял 69,1 %.

В.И. Комлацкий и соавт. (47) провели сравнительный анализ гигиенического поведения двух пород медоносных пчел (карника и карпатская). При тестировании по методике «удаление замороженного расплода» пчелы породы карника показали способность по вскрытию запечатанного расплода выше на 4 %, а по удалению из сотовых ячеек погибших куколок — больше на 9,1 % по сравнению с пчелами породы карпатская.

В то же время частота встречаемости гигиенического поведения среди пчелиных семей относительно низка и составляет около 10 % (48, 49). Поэтому особый интерес представляет селекция пчел, благоприятствующая этому признаку. Одним из наиболее известных примеров естественной устойчивости служит популяция медоносных пчел, состоящая из 150 семей, на острове Готланд (Швеция), где в 1999 году были зарегистрированы колонии, приобретшие резистентность к V. destructor и выживавшие без соответствующего лечения (50).

Также стоит отметить природные популяции медоносных пчел во Франции (51) и Норвегии (52), демонстрирующие устойчивость к V. destructor . В частности, норвежская популяция существовала в условиях постоянного заражения клещом более 19 лет, что служит ярким доказательством долгосрочной адаптации (52).

Всестороннее изучение подобных популяций чрезвычайно важно для понимания генетических, эволюционных и эпидемиологических механизмов развития устойчивости к Varroa (53, 31). Однако эти природные популяции пчел не используются в коммерческом пчеловодстве, поскольку имеют существенные недостатки — низкую медовую продуктивность и постоянное роение.

В этом отношении популяции дальневосточных пчел, сосуществовавшие с V. destructor в течение длительного времени, представляют большой интерес для селекции: они обладают высокой выраженностью гигиенического поведения и даже частично передают этот признак при скрещивании с другими породами (54).

Другим фактором, обеспечивающим устойчивость пчелиных семей к варроатозу, служит груминг: пчелы повреждают и удаляют клещей с собственного тела (аутогруминг) или с тел других пчел (аллогруминг) (55). Такое поведение в значительной степени способствует устойчивости колонии к клещам за счет увеличения смертности паразитов и регулирования роста их популяции (56-58). Эффективность груминга зависит не только от самого факта снятия клеща, но и от способности пчелы его повредить. Пчелы используют свои ноги, а именно специальные щеточки и гребешки, чтобы схватить и раздавить клеща. Поврежденный клещ погибает или теряет способность к размножению, что критически важно для сдерживания популяции V. destructor . Такое поведение — наследуемый признак, и его активность сильно варьирует между породами и популяциями пчел.

Примечательно, что африканизированные пчелы — один из лучших примеров естественной, долгосрочной толерантности к клещам Varroa в колониях (56, 59-61). В процессе естественного отбора в Новом Свете, куда клещ Varroa был интродуцирован, африканизированные пчелы развили исключительно высокую активность груминга по сравнению со своими европейскими собратьями. Эта поведенческая адаптация служит ключевым компонентом их выживаемости и позволяет их колониям существовать без обработок акарицидами, демонстрируя модель успешного сосуществования с паразитом.

Работы по выявлению генетических факторов, обусловливающих различную восприимчивость медоносных пчел к возбудителям, представляют собой относительно новое направление (62-65).

Первые исследования экспрессии генов позволили предположить, что в основе устойчивости к варроатозу лежат скорее различия в физиологии и поведении, нежели особенности иммунного ответа (66). Кроме того, степень устойчивости хозяина к паразитическому клещу может быть охарактеризована различными особенностями метаболизма и передачи нервных импульсов (67). В настоящее время функциональная геномика предоставляет мощные инструменты изучения взаимоотношений «хозяин-паразит» у медоносных пчел. Геномные ресурсы, созданные в процессе реализации проекта «Геном медоносной пчелы» (The Honeybee Genome Sequencing Consortium, 2006) (68) и новые технологии анализа экспрессии генов — это интегрированный и обширный источник для молекулярных исследований взаимодействия медоносной пчелы и клещей Varroa (69).

Первоначально изучение QTL (quantitative trait locus), ассоциированных с устойчивостью к варроозу, проводилось с использованием микросателлитов (70) и ПДРФ-анализа (71). Были выявлены соответственно шесть (3 значимых и 3 предположительных) и семь возможных QTL, относящихся к гигиеническому поведению. Однако сравнение полученных результатов практически невозможно из-за использования двумя исследовательскими группами разных карт сцепления.

При изучении популяций медоносной пчелы с острова Готланд, выживших после поражения V. destructor , было проведено QTL-картирование этого признака. Пораженные и непораженные паразитами трутни были исследованы раздельно, и в их геномах проведен скрининг потенциальных QTL с использованием 216 микросателлитных маркеров (72). Было выделено три предполагаемых целевых участка на 4-й, 7-й и 9-й хромосомах, но ярко выраженный эпистаз между тремя этими локусами существенно затрудняет их использование в селекционных программах.

J.M. Tsuruda с соавт. (62) идентифицировали 1536 SNP, секвенируя ДНК медоносных пчел, и использовали эти данные для создания SNP-чипа низкой плотности. С его помощью был проведен поиск QTL, оказывающих влияние на гигиеническое поведение пчел против V. destructor . Важнейший из них обнаружен на 9-й хромосоме. В то же время с использованием гибридизационного чипа (44 тыс. SNP) ассоциаций на этой хромосоме не обнаружили (73).

При поиске SNP, ассоциированных с гигиеническим поведением у A. mellifera carnica, было выявлено 6 однонуклеотидных полиморфизмов, показавших значительную полногеномную ассоциацию с DUVB (обнаружение и распечатывание расплода, зараженного Varroa, detection and uncapping of Varroa-parasitized brood). Четыре из них пространственно ассоциированы с 4 генами-кандидатами (гены рецептора аденозина, циклин-зави-симого активатора киназы-5, рецептора октапамина бета-2R и одорант-связывающим белком 1) (73). Октапаминовые рецепторы насекомых играют несколько функциональных ролей, которые у млекопитающих обычно связаны с адреноэргическими рецепторами. Эти функции включают модуляцию входных сигналов органов чувств, а также участие в реализации процессов памяти и обучения (74).

Исследование транскрипционного ответа на паразитических клещей, проведенное при сравнении линий A. mellifera , устойчивых и чувствительных к V. destructor , позволило идентифицировать комплекс из 148 генов со значительно различающимися паттернами экспрессии (66). Экспрессия 32 из них варьировала в зависимости от присутствия Varroa , 116 — в зависимости от генотипа, и экспрессия двух генов находилась в зависимости одновременно от двух этих факторов. Пчелы, устойчивые к паразитам, характеризовались преимущественно разницей в экспрессии генов, регулирующих развитие и чувствительность нейронов, а также обоняние. Различия в обонянии и чувствительности к стимулам служат (по крайней мере частично) параметрами, вносящими вклад к устойчивости пчел к V. destructor (33, 34).

С использованием полногеномного ассоциативного анализа высокой плотности в популяциях медоносных пчел, устойчивых к V. destructor , был идентифицирован экдизон-индуцируемый ген Mblk-1 , который играет центральную роль в механизме подавления репродукции клеща (suppressed mite reproduction, SMR). Экдизон инициирует одновременно и метаморфоз у насекомых, и размножение у Varroa . Клещи не могут самостоятельно синтезировать этот гормон, но получают его вместе с пищей (гемолимфой личинок) (75, 76). С использованием количественного ПЦР-анализа удалось выявить взаимосвязь экспрессии генов экдизон-зависимых генов устойчивости к паразиту с его размножением и рационом клещей (77).

В связи с тем, что паразиты используют компоненты личинок пчел для запуска своего репродуктивного цикла, мутации в цикле биосинтеза экдизона у организма-хозяина могут стать ключевым инструментом селекции и разведения медоносных пчел, устойчивых к варроатозу. Результаты, полученные на мухах Drosophila , позволяют предположить, что ген Mblk-1 активно экспрессируется в жировом теле, которое, как было недавно показано, служит основным источником пищи для клещей Varroa (78). Число пчелиных семей и индивидуумов, несущих эти SNP, безусловно, ограничено, а для некоторых QTL несущие их особы вообще единичны, но большинство маток в действительности могут быть гетерозиготны по изучаемым аллелям, что позволит проводить селекционную работу на повышение устойчивости отечественных популяций пчел к V. destructor .

M. S otek с соавт. (79) в масштабном исследовании, проведенном в 77 административных районах Чешской Республики, предприняли попытку оценить генетический потенциал резистентности местных популяций пчел. С помощью разработанной панели для генотипирования методом SNaPshot авторы проанализировали разнообразие 13 SNP-маркеров: маркеры гигиенического поведения (6), подавления репродукции клещей (SMR) (5), общего иммунного ответа (1) и резистентности к аскосферозу (1). Несмотря на успешное естественное распространение аллелей SMR, критически низкая частота благоприятных аллелей VSH и устойчивости к аскосферозу создает угрозу массовой гибели семей при снижении эффективности химических обработок.

Четырехлетнее исследование M.G. De Lorio с соавт. (80) демонстрирует успешность целенаправленной селекции на усиление VSH через отбор по признаку SMR. Матку осеменяли спермой одного трутня, чтобы контролировать материнский и отцовский генетический вклад. Наблюдалось устойчивое увеличение средних показателей SMR (22,1 % в 2021 году, 41,0 % в

2024 году). Эти результаты подтверждают потенциал целевых программ разведения для усиления экспрессии VSH в популяциях медоносных пчел.

В работе, проведенной с целью изучения ассоциаций между грумин-говой активностью и экспрессией некоторых генов иммунной и нервной систем, системы детоксификации, а также генов, участвующих в развитии и поддержании здоровья, установлено, что активные чистильщики (intense groomers, IG) были более эффективны, поскольку им требовалось существенно меньше времени для начала процесса груминга и меньшее число попыток для успешного удаления клещей со своего тела по сравнению с ленивыми чистильщиками (light groomers, LG).

Также показано, что относительная представленность мРНК неуре-ксина-1 была выше в группе активных чистильщиков (IG) по сравнению с остальными группами: ленивыми чистильщиками (LG); пчелами, не проявляющими груминговой активности (NG), и пчелами без клещей (контроль). Количество мРНК поли-U-связывающего фактора kd 68 и цитохрома P450 было значительно выше в группе IG по сравнению с контрольными пчелами. Содержание мРНК гименоптацина оказалось существенно выше в группе IG по сравнению с NG, но не отличалось от такового у контрольной группы. Представленность транскрипта вителлогенина не менялась в зависимости от типа груминговой активности. Однако количество мРНК гена blue cheese было значительно понижено у пчел группы IG по сравнению с соответствующим показателем в группах LG и NG, но не отличалось от показателя в контрольной группе. Эффективное удаление клещей активными чистильщиками коррелировало с отличным от других групп паттерном экспрессии генов (81). Полученные результаты позволяют предположить, что груминговая активность может быть связана с паттерном экспрессии жизненно важных генов у пчел.

M. Guichard с соавт. (9) предложили метод количественной ПЦР для оценки экспрессии гена Neurexin-1 в качестве молекулярного биомаркера сенсорной чувствительности, потенциально позволяющего частично заменить или дополнить трудоемкие поведенческие тесты.

D. Kabakcı с соавт. (82) при изучении генетических основ устойчивости медоносных пчел (экотип Mu g la, Apis mellifera anatoliaca ) к клещу V. destructor выявили значительное повышение экспрессии трех ключевых генов: гименоптаецина ( hym ) — в 2,90, неурексина-1 ( AmNrx1 ) — в 2,95 и CYP9Q3 — в 3,26 раза в результате селекционной программы по сравнению с контрольной группой (p < 0,01). Полученные результаты демонстрируют, что целенаправленная селекция на устойчивость к Varroa приводит к молекулярным изменениям, связанным с защитным поведением (автогруминг и аллогруминг). Указанные гены могут служить эффективными молекулярными маркерами для преселекции пчел с повышенной резистентностью к клещу Varroa в селекционных программах.

Современная селекция медоносных пчел на устойчивость к V. destructor представляет собой динамичную область, где традиционные методы фенотипического отбора все активнее дополняются и вытесняются высокопроизводительными геномными технологиями.

Наиболее радикальным и перспективным инструментом служит система геномного редактирования CRISPR-Cas9, применение которой достигло значительного прогресса за короткий период. В 1987 году Y. Ishino с соавт. (83) обнаружили в ДНК бактерии Escherichia coli короткие палиндром-ные повторы (CRISPR). В начале 1990-х F.J. Mojica с соавт. (84) продолжили эти исследования, выявив CRISPR последовательности у архей, в частности у Haloferax mediterranei. В 2002 году исследователи из Голландии идентифицировали группу генов, которая была названы CAS (CRISPR-ассоциированные гены) (85). В отличие от традиционной селекции, которая комбинирует существующие аллели, CRISPR позволяет целенаправленно и точно модифицировать конкретные гены, ассоциированные с тем или иным признаком.

Исследование CRISPR/Cas9 на медоносных пчелах впервые провели H. Kohno с соавт. (86) в 2016 году. Эта группа ученых разработала базовый протокол редактирования генома медоносных пчел для анализа функций генов. В качестве мишени был выбран ген основного белка маточного молочка 1 ( mrjp 1), поскольку он экспрессируется преимущественно у взрослых особей, и ожидается, что его мутация не повлияет на нормальное развитие. Результаты свидетельствовали о том, что ген mrjp1 не был эссенциальным (незаменимым) для нормального развития трутней, по крайней мере, до стадии куколки.

В 2018 году этой же группой был нокаутирован ген mKast , который преимущественно экспрессируется в клетках Кеньона (Kenyon cells, KCs) среднего типа (mKCs) мозга медоносной пчелы. Исследователи сообщили, что ген mKast не относится к необходимым для нормального развития и полового созревания. Несмотря на то, что нокаут mKast не привел к очевидным фенотипическим изменениям, эта работа имела важное значение, поскольку показала, что, как и в случае с mrjp1 , не все гены являются эссенциальными для базового выживания и развития в лабораторных условиях. Возможно, функция mKast проявилась бы в более сложных поведенческих задачах или в определенных условиях окружающей среды (87). В 2019 году X.F. Hu с соавт. (88) улучшили протокол, разработанный T. Kubo с соавторами в 2016 году. Ключевым изменением стала микроинъекция непосредственно в область формирования зиготы в течение 2 ч после откладки яйца. Точный временной интервал и место инъекции оказались критическими для достижения высокой эффективности редактирования. Такой подход позволил добиться одностадийного получения биаллельных нокаут-мутантов, что значительно снижало мозаицизм (наличие как отредактированных, так и неотредактированных клеток в одном организме) и упрощало процесс получения гомозиготных мутантов.

CRISPR-Cas9 позволяет исследовать гены, которые контролируют развитие различных каст (маток, рабочих пчел, трутней) в зависимости от факторов окружающей среды (например, питания). Это помогает понять молекулярные механизмы, лежащие в основе полифенизма (89). Несмотря отсутствие прямых CRISPR-исследований, направленных на создание устойчивости пчел к V. destructor посредством изменения их генома, эта технология находит применение в создании пчел, устойчивых к пестицидам, за счет изменения генов, отвечающих за детоксикацию или целевые участки для инсектицидов (90).

CRISPR-подобные системы или методы, основанные на гомологичной рекомбинации, активно применяются для редактирования геномов бактерий-симбионтов из кишечника пчел, что позволяет изучать взаимодействия хозяин—микроб и создавать модифицированные бактерии для борьбы с патогенами или улучшения здоровья пчел (91, 92).

Однако, несмотря на значительные успехи, применение CRISPR у медоносных пчел сопряжено с определенными трудностями: сложность доставки конструкций в яйцо, особенности уникальной структуры семьи, в которой признак должен стабильно проявляться у рабочих особей, а также серьезные этические и регуляторные барьеры, ограничивающие использование генетически модифицированных организмов (ГМО) в окружающей среде.

В обозримом будущем эта технология будет служить, прежде всего, мощнейшим инструментом функциональной валидации генов-кандидатов in vivo: редактируя конкретный ген у лабораторной пчелы, можно с высочайшей точностью установить его причинно-следственную связь с проявлением VSH или груминга, что укажет на наиболее перспективные мишени для традиционной селекции.

Итак, достижение успеха в выведении пчелиных семей, устойчивых к варроатозу, требует интеграции традиционных методов селекции с передовыми геномными технологиями. Ключевые направления включают глубокое изучение гигиенического поведения и груминга у пчел на нейробио-логическом и молекулярном уровнях, а также идентификацию и валидацию генетических маркеров (SNP, QTL), ассоциированных с этими признаками. Использование молекулярных биомаркеров (например, экспрессируемого гена Neurexin-1 ) может дополнить трудоемкие поведенческие тесты. Генетические исследования выявили ряд генов-кандидатов, связанных с обонянием, нервной системой, иммунитетом и метаболизмом, подчеркивая по-лигенную природу устойчивости. Природные популяции, адаптировавшиеся к Varroa , представляют собой ценный генетический ресурс для селекционных программ. Технология CRISPR-Cas9 служит мощным инструментом для функциональной валидации генов in vivo, однако ее прямое применение в коммерческой селекции пчел ограничено техническими, этическими и регуляторными барьерами. В обозримом будущем CRISPR будет преимущественно использоваться для идентификации наиболее перспективных мишеней традиционной селекции. Для успешной реализации селекционных программ необходим сбалансированный подход, который не только обеспечит повышение устойчивости к Varroa , но и сохранит важные хозяйственные характеристики пчел. Внедрение интегрированных стратегий, сочетающих геномную селекцию и фенотипический отбор, а также международное сотрудничество и стандартизация методов критически важны для создания устойчивых популяций медоносных пчел в долгосрочной перспективе.