К искусственному заражению растений подсолнечника современными патотипами возбудителя ржавчины для использования в селекции на иммунитет

Введение. В последние годы происходит интенсивное распространение ржавчины на подсолнечнике в России. В некоторых регионах периодически возникают эпифитотии [1; 2]. Связано это с расширением посевных площадей подсолнечника, нарушениями севооборотов и появлением новых рас возбудителя. Проведённая нами идентификация расовой принадлежности возбудителя ржавчины из некоторых регионов возделывания подсолнечника в РФ позволила выявить новые патотипы, среди которых чаще встречался обозначенный кодовым номером 700, наравне со старой расой 300, существовавшей ещё в 80-х годах прошлого века [3]. Действенным и экологически безопасным методом контроля ржавчины является селекция на устойчивость. Для успешной селекции необходим надёжный метод искусственного заражения растений. В 80-е годы прошлого века был разработан и успешно применялся метод оценки устойчивости растений подсолнечника при искусственном заражении возбудителем ржавчины [4]. При этом были определены оптимальные климатические режимы для инокуляции и выращивания растений. Известно, что ржавчинные грибы требовательны к температуре, и для прорастания спор разных видов возбудителя, паразитирующих да- же лишь на одной культуре, необходимы разные температурные режимы [5]. Основным источником распространения ржавчины на растениях подсолнечника в период их вегетации являются уредини-оспоры. При сложившихся для патогена благоприятных условиях за период вегетации возбудитель может производить огромное количество этих спор, что способствует нарастанию степени поражения. Инфекционный процесс начинается с прорастания урединиоспор и продолжается до образования на листьях новых урединий. Успех этого процесса определяется тем, насколько близка температура окружающей среды к оптимальной для патогена. Многие авторы отмечали приуроченность возбудителя ржавчины к относительно прохладной погоде с повышенной влажностью и считали оптимальной температуру 18–21 оС [6; 7]. Однако все исследования по биологии возбудителя ржавчины подсолнечника в РФ относятся к 40, 60, 80-м годам прошлого века, когда самой распространённой расой была раса 1 (по современной номенклатуре 100). За последние 30 лет погодные условия в регионах возделывания подсолнечника в РФ характеризуются повышенной температурой по сравнению со средней многолетней. Так, например, в Тамбовской области распространение ржавчины до 100 % при интенсивности поражения до 80 % наблюдалось в 2010 и 2015 гг., когда средняя температура в июле составляла 28,2 оС [8]. Правильно подобранный температурный режим при искусственном заражении растений подсолнечника возбудителем ржавчины – один из главных факторов успеха селекционной работы при выявлении устойчивых генотипов.

Цель данного исследования: уточнить влияние относительно пониженных температур на Puccinia helianthi – возбудителя ржавчины подсолнечника в РФ, и определить оптимальный температурный диапазон для искусственного заражения листьев подсолнечника современными патотипами возбудителя ржавчины в лабораторных условиях.

Материалы и методы. Исследования проведены в лаборатории иммунитета отдела биологических исследований ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК в 2020–2021 гг. Объектом исследования служили моно-пустульные изоляты P. helianthi с кодами вирулентности 300 и 700, которые выделяли и размножали на восприимчивом сорте подсолнечника ВНИИМК 8883.

Изучали прорастание при разных температурах зрелых урединиоспор, которые легко высыпались из пустул (урединий) (рис. 1).

Рисунок 1 – Споры (показаны стрелкой) патотипа Puccinia helianthi Schwein с кодом вирулентности 300, высыпавшиеся из урединий (у), обозначенных белыми стрелками

Свежесобранные и хранившиеся в морозильной камере при температуре -20 оС в течение одного и двух месяцев уреди-ниоспоры помещали в чашки Петри диаметром 9 см с 10 мл стерильной воды. В один из вариантов добавляли фрагмент зелёного листа подсолнечника размером 1,5–2 см2. Чашки выдерживали при разных температурных режимах: 18, 20, 22, 25 оС. Через 1 и 4 часа подсчитывали в 10 полях зрения количество проросших и непроросших спор с помощью микроскопа (Motic ВА 310) при увеличении 10х. Фотографии урединиоспор делали при увеличении 40х (рис. 2). Определяли процентное соотношение количества про- росших спор к их общему количеству в поле зрения.

Заражали суспензией урединиоспор предварительно выращенные растения подсолнечника в фазе одной и двух пар настоящих листьев. Семена восприимчивого к ржавчине сорта ВНИИМК 8883 по 10 штук высевали в двухкилограммовые пластиковые горшки, наполненные смесью почвы и песка в соотношении 2 : 1.

Рисунок 2 – Урединиоспоры Puccinia helianthi Schwein при увеличении 40х (ориг.)

Растения выращивали в камере «Биотрон-5» при оптимальных для подсолнечника режимах освещённости и температуры. В каждом варианте было по 20 учётных растений. Заражение растений проводили путём опрыскивания суспензиями урединиоспор монопустульных изо-лятов рас 300 и 700 возбудителя ржавчины. Концентрация каждой суспензии составляла 110 тысяч урединиоспор в 1 мл воды. После инокуляции через 40–60 мин растения помещали на 24 ч во влажную камеру при температуре 20 оС. Далее размещали их при температурных режимах 22, 24, 26 и 28 оС. Учитывали продолжительность латентного (инкубационного) периода в зависимости от температуры после заражения, возраста растений и кода вирулентности возбудителя. Количество образовавшихся урединий на одном семядольном и одном настоящем листе каждого учётного растения подсчитывали на 9-й день после заражения. Экспериментальные данные обрабатывали методом дисперсионного анализа [9].

Результаты и обсуждение. В результате исследований установлено, что по-ражаемость листьев подсолнечника и особенно степень поражения находятся в прямой зависимости от величины инфекционной нагрузки и жизнеспособности урединиоспор.

Далеко не все урединиоспоры могут быть жизнеспособными и вызывать поражение даже при наличии оптимальных для этого условий. В этой связи у облигатных паразитов количество спор, необходимое для искусственного заражения, исчисляется сотнями в 1 мл суспензии. Так, например, возбудителю ржавчины пшеницы для того чтобы образовалась одна или несколько пустул требуется более ста урединиоспор [5]. Поэтому имеет значение проверка способности к прорастанию спор, используемых в приготовлении суспензии для инокулирования листьев подсолнечника.

Урединиоспора P. helianthi Schwein имеет две диаметрально расположенные поры, через которые осуществляется её прорастание появлением ростковой трубки (рис. 3).

Рисунок 3 – Проросшие в воде урединиоспоры Puccinia helianthi Schwein, стрелками обозначены ростковые трубки (увеличение: а, б – 40х; в – 10х) (ориг.)

Процесс образования ростковых трубок в большой степени зависит от условий хранения и зрелости урединиоспор, а также от температуры окружающей среды и наличия влаги. По нашим наблюдениям, зрелые, только что собранные урединиоспоры начинали прорастать через час их пребывания в контакте с водой при температуре 25 оС. Любой срок хранения в морозильной камере замедлял прорастание спор на 2–3 часа.

При температуре 18 оС количество проросших спор было минимальным независимо от кода вирулентности и присутствия фрагмента листа подсолнечника. При 20, 22 и 25 оС присутствие зелёного листа стимулировало прорастание спор. У обеих рас наибольший процент проросших спор (56 и 49 %) был при 20 и 25 оС (52 и 47 %) (табл. 1). При этом у патотипа 300 количество проросших спор всегда было больше при всех изученных температурных режимах и одинаковых условиях хранения спор до инокуляции. Мы полагаем, это может быть связано с тем, что эта старая раса в эволюционном плане более совершенна и пластична, чем появившаяся в РФ сравнительно недавно раса 700. Как известно, у облигатных паразитов интенсивно развиваются и совершенствуются в первую очередь свойства, обеспечивающие завоевание плацдарма, с которого пойдёт его дальнейшее развитие в растении-хозяине.

Таблица 1

Количество проросших урединиоспор Puccinia helianthi Schwein патотипов 300 и 700 (%) через 4 часа пребывания в воде в зависимости от температурных условий и наличия фрагмента зелёного листа подсолнечника

ВНИИМК, 2020–2021 гг.

Вирулентный код	Количество проросших урединиоспор (%) при температуре, оС
	18		20		22		25
	*1	**2	1	2	1	2	1	2
300	3	5	41	56	32	45	34	52
700	2	4	28	49	29	38	28	47

Прорастание: *1 – в воде;

**2 – в воде с фрагментом листа

В селекционной практике при искусственном заражении растений подсолнечника определение жизнеспособности урединиоспор перед инокуляцией является необходимым элементом в коррекции инфекционной нагрузки. Данные таблицы 1 свидетельствуют о том, что для определения жизнеспособности урединиоспор при использовании в приготовлении инокулята достаточно проращивать их при 20–25 оС в присутствии фрагмента листа подсолнечника.

Процесс заражения листа подсолнечника начинается с проникновения ростковой трубки споры возбудителя ржавчины в устьице. Ему способствуют наличие воды и оптимальные температурные условия.

Наиболее интенсивный рост и спорообразование гриба были отмечены при температурах 26 и 28 оС на всех инфицированных растениях. Первый симптом успешного заражения – бледно-зелёные точечные пятна на настоящих листьях – появлялся на 5–6-й день после заражения (рис. 4).

Рисунок 5 – Урединии на семядольном (слева) и первом листе (справа) растений подсолнечника, зараженных в фазе первой пары настоящих листьев патотипом 300 Puccinia helianthi Schwein, при температуре 22 ^оС (ориг.)

Рисунок 4 – Первый симптом (точечная бледно-зелёная пятнистость) поражения возбудителем ржавчины Puccinia helianthi Schwein листа подсолнечника при температуре 26 ^оС (ориг.)

Первые урединии на семядольных и настоящих листьях при такой температуре появлялись на 6–7-й день, тогда как при других режимах – на 8–9-й день. Степень поражения – среднее количество урединий, сформировавшихся в дальнейшем на одном листе, всегда превышала минимальное значение (5 урединий), описанное в работе Yang с соавторами [10], при заражении как первой, так и второй пар настоящих листьев обоими патотипами при всех изученных температурных режимах (рис. 5).

Наивысшая степень поражения учётных растений расой 300 была отмечена при температуре 22 оС и существенно на 5%-ном уровне значимости превосходила таковую при других температурных режимах. Как сказано выше, раса 300 уже имелась на полях РФ в 80-х годах прошлого века, когда средние суточные температуры воздуха были ниже, чем в настоящее время.

Наши данные показывают, что эта раса адаптирована к более низким температурам, хотя она проявила себя достаточно пластичной и способной успешно развиваться в широком диапазоне температур при наличии других необходимых для её жизнедеятельности факторов.

При температурах 26 и 28 оС количество урединий расы 300 на учётных листьях через 9 дней после заражения растений разного возраста (фазы 1-й и 2-й пар настоящих листьев) не имело существенных различий и было достаточно высоким для дифференциации восприимчивых генотипов подсолнечника (табл. 2).

Таблица 2

Среднее количество урединий, образовавшихся при искусственном заражении расой 300 возбудителя ржавчины растений подсолнечника сорта ВНИИМК 8883 разного возраста при разных температурах, через 9 дней после заражения

ВНИИМК, 2020–2021 гг.

Учётный лист	Количество урединий (шт./лист) при температуре, оС
	22	24	26	28	НСР 05
Фаза развития растений: первая пара настоящих листьев
Семядольный	21,6	25,1	12,7	13,8	6,84
Настоящий	81,7	31,5	50,1	39,7	19,3
Фаза развития растений: вторая пара настоящих листьев
Семядольный	36,2	18,9	10,4	16,0	8,9
Настоящий	101,4	97,4	45,9	47,0	17,9

Инфекционный процесс у растений, заражённых расой 700 в условиях изу- ченного диапазона температур, проходил с образованием меньшего количества урединий (рис. 6).

Рисунок 6 – Урединии Puccinia helianthi Schwein расы 700 на семядольном (слева) и настоящем (справа) листьях подсолнечника при температуре 28 ^оС (ориг.)

Возраст растений в момент заражения повлиял на количество урединий. На растениях, имевших вторую пару настоящих листьев, количество образовавшихся пустул расы 700 почти в два раза превышало таковое у инфицированных в стадии первой пары. Однако в диапазоне изученных температур, достоверных на 5%-ном уровне значимости, различий по среднему количеству урединий выявлено не было (табл. 3).

Количество пустул, образовавшихся при заражении как первой пары настоящих листьев, так и второй, было достаточным для идентификации восприимчивых генотипов подсолнечника.

Таблица 3

Среднее количество урединий, образовавшихся при искусственном заражении расой 700 возбудителя ржавчины растений подсолнечника сорта ВНИИМК 8883 разного возраста при разных температурах

ВНИИМК, 2020–2021 гг.

Учётный лист	Количество урединий (шт./лист) при температуре, оС
	22	24   \	26    1		28	НСР 05
Фаза развития растений: первая пара настоящих листьев
Семядольный	7,9	7,3	3,9	4,2		2,3
Настоящий	29,6	28,1	24,0	22,6		6,7
Фаза развития растений: вторая пара настоящих листьев
Семядольный	10,4	7,6	9,0	8,0		3,7
Настоящий	45,6	42,0	32,7	41,2		11,0

Выводы. Для определения жизнеспособности можно использовать как свежесобранные, так и замороженные урединиоспоры Puccinia helianthi Schwein. Хранение в замороженном состоянии замедляет процесс прорастания спор на 2–3 часа по сравнению со свежесобранными. Присутствие фрагмента зелёного листа подсолнечника в воде, используемого для прорастания, увеличивает процент проросших спор.

Инкубационный период патотипов 300 и 700 P. helianthi при температурном режиме 26–28 ^оС сокращается на 2–3 дня, что имеет существенное значение как для быстрой идентификации расовой принадлежности изолятов возбудителя, так и для ускорения срока оценки генотипов подсолнечника при селекции на иммунитет. Существенное значение для ускорения этой работы имеет также заражение растений подсолнечника в фазе первой пары настоящих листьев при температуре 22 ^оС с последующим 24-часовым пребыванием их во влажной камере при 20 ^оС и дальнейшим увеличением температурного режима выращивания до 26–28 ^оС.