К изучению безопасности длительного применения противовоспалительного средства на основе экстракта мегастробилов Picea abies

Логинова Наталья Павловна – доктор медицинских наук, заведующий кафедрой гистологии, эмбриологии и цитологии (e-mail: ; тел.: 8 (902) 475-90-67; ORCID: .

Мащенко Петр Сергеевич – кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры токсикологической химии; доцент, заведующий кафедрой фармакологии и фармации (e-mail: ; тел.: 8 (909) 104-41-44; ORCID: .

Семакин Дмитрий Олегович – кандидат фармацевтических наук, старший преподаватель кафедры фармакогнозии (e-mail: ; тел.: 8 (982) 117-51-05; ORCID: .

Результаты ранее проведенных исследований показали высокую противовоспалительную активность водного экстракта Picea abies мегастробилов [1]. Установлена его высокая антирадикальная активность по способности связывать свободный стабильный радикал 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил, сопоставимая по степени выраженности эффекта с известными антиоксидантами. Антирадикальная активность водного экстракта мегастробилов Picea abies наибольшая у экстрактов, полученных из сырья, заготовленного в период с сентября по март¹. Высокую ан-тирадикальную активность водных и спиртовых извлечений мегастробилов хвойных растений подтверждают данные других исследований [2–5].

Проводится много исследований, направленных на изучение процесса всасывания процианиди-нов в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ). Мономерные единицы процианидинов ̶ катехин и эпикатехин ̶ способны всасываться в ЖКТ. Доказано, что скорость адсорбции процианидинов снижается по мере увеличения их молекулярной массы. Некоторые процианидины при попадании в желудок расщепляются под действием кислоты до олигомеров и мономеров [6–9].

Мономеры процианидинов могут всасываться в тонком кишечнике, а олигомеры и полимеры разлагаются в толстом кишечнике под действием кишечной микрофлоры. Мономерные проантоциани-дины могут всасываться парацеллюлярным путем благодаря своим гидрофобным свойствам, что позволяет им сохранять свою первоначальную структуру и проявлять активность [10, 11]. Всасыванию процианидинов может препятствовать совместный прием жирной пищи, замедляют их всасывание и углеводы, кроме того, при образовании комплексов с белками биодоступность процианидинов значительно снижается [12, 13].

В эпителиальных клетках происходит модификация процианидинов, метилирование и глюкурониро-вание, что приводит к повышению их биодоступности. После всасывания процианидины и их метаболиты попадают в печень, где могут быть дополнительно модифицированы ферментами [14]. Процианидины были обнаружены во всех органах включая головной мозг. Они способны проникать через гематоэнцефалический барьер и оказывать нейропротекторный эффект. В эксперименте, проведенном на крысах, после перорального приема 500 мг/кг процианидинов пиковая их концентрация в головном мозге достигалась через 30 мин. При этом большая часть процианидинов выводится из организма с калом [12, 15].

Процианидины могут проявлять антикоагулянтную и антиагрегантную активность, что может повышать риск кровотечений и гематом. Введение высоких доз танинов и процианидинов может вызывать раздражение слизистой ЖКТ тракта [16]. При этом неизвестно, насколько может вызывать повреждение ЖКТ и образование гематом длительное введение экстракта, содержащего процианидины.

При определении острой токсичности водного экстракта Picea abies мегастробилов по методу В.В. Прозоровского установлено, что водный экстракт мегастробилов Picea abies относится к классу малотоксичных веществ со значением среднесмертельной дозы более 10 300 мг/кг [1]. Остается актуальным вопрос о том, какое влияние оказывает экстракт на разные системы органов при длительном введении в течение нескольких месяцев.

При оценке безопасности применения нового лекарственного средства необходимо учитывать не только его влияние на внутренние органы, поведение, характер слизистых, но и на элементный статус организма. Химические элементы являются важнейшей составляющей как растительного, так и животного организма. В составе водного экстракта мегастробилов Picea abies основной группой биологически активных веществ являются проциани-дины. Процианидины обладают сильной хелатирующей способностью по отношению к железу, меди и свинцу и ряду других элементов [17–20].

Цель исследования – определение уровня безопасности на основе изучения хронической токсичности водного экстракта мегастробилов Picea abies на различные органы и ткани лабораторных животных.

Материалы и методы. Сырьем для получения экстракта служили мегастробилы ели обыкновенной (Picea abies (L.) Karst., Pinaceae), произрастающей на территории Пермского края, Российская Федерация. Мегастробилы заготавливали в Ильинском районе Пермского края в период с сентября по март. Заготовленное сырье высушивали воздушно-теневым способом. Экстракт получали из сборного образца, включающего сырье всех месяцев заготовки. Около 50 г мегастробилов Picea abies, измельченных до частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, помещали в колбу, добавляли 1,5 ч воды (гидромодуль 1: 30) и экстрагировали при перемешивании в течении 1,5 ч при нагревании 80–85 °С. По окончании экстракции сырье отделяли от экстракта фильтрованием. Полученный экстракт сгущали под вакуумом при температуре 80–85 °С в 10 раз от первоначального объема. Далее отделяли балластную, неактивную фракцию путем охлаждения упаренного экстракта при температуре -18 °С в течение 15 мин. При этом выпадал осадок, в который попадали: часть полисахаридного комплекса, белки, дубильные вещества, смолистые вещества. Осадок уплотняли центрифугированием и отбрасывали. Надосадочную жидкость выпаривали в вакуум-выпарном аппарате до густой массы и высушивали в сушильном шкафу при температуре 50 °С [1].

Экстракт представляет собой аморфный порошок светло-коричневого цвета со специфическим запахом, растворимый в воде, частично растворимый в 50- и 70%-ном спирте этиловом и не растворимый в диэтиловом эфире, этилацетате, хлороформе. В эксперименте использовались белые лабораторные аутбредные крысы обоих полов стока линии Wistar. Подготовка животных включала отбор по полу, возрасту и состоянию здоровья. В экспериментальные и контрольные группы включали здоровых животных без признаков воспаления и других патологий, что соответствует методике определения хронической токсичности2. В рамках выделенной субпопуляции был выполнен рандомизированный отбор с использованием генератора случайных чисел в экспериментальные группы по 10 животных каждого пола (одна экспериментальная группа самцов, одна контрольная группа самцов, одна экспериментальная группа самок, одна контрольная группа самок). Животные в группах маркировались методом нанесения сквозных индивидуальных меток. Проверка качества рандомизации выполнялась до эксперимента на основе тестирования значимости сдвигов масс и гомогенности дисперсий.

Исследуемое вещество (водный экстракт мегастробилов Picea abies ) растворяли в теплой воде очищенной, предварительно растерев в фарфоровой ступке, и вводили животным экспериментальной группы перорально в дозе 12 мг/кг (доза определена в соответствии с человеческой дозировкой с учетом пересчета) ежедневно в течение трех месяцев. В качестве эквистрессового воздействия животным в контрольной группе вводилась дистиллированная вода.

По окончании срока наблюдения животных выводили из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом с соблюдением этических принципов «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в других научных целях» (Страсбург, 18.03.1986). Забор органов для гистологического исследования проводили сразу после остановки сердца. Для микроскопического изучения взяты кусочки органов: сердце, почки, желудок, тонкая кишка. После забора органы фиксировали в течение 24 ч в 10%-ном забуференном нейтральном растворе формалина с последующей заливкой в парафин по общепринятой схеме, готовили гистологические срезы толщиной 5 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Микроскопирование и фотографирование препаратов проводили с помощью микроскопа «Ломо Микмед-6» при увеличении 100, 200, 400 и 900 и цифровой фотокамеры ToupCam.

Элементный состав образцов костной ткани определяли с использованием рентгенофлюоресцентного метода на энергодисперсионном рентгенофлюоресцентном спектрометре марки QUANT’X компании Thermo Scientific, США. Для определения золы исследуемые образцы сжигали в муфельной печи в течение 10 ч при температуре 600 °С. Содержание элементов рассчитывали в мг/г массы кости.

Статистическую обработку результатов эксперимента проводили методами математической статистики с помощью t -критерия Стьюдента, с использованием программы Microsoft Excel. Количественные признаки представлены как M (среднее арифметическое). Достоверность отличий между группами считали значимыми при р ≤ 0,05.

Результаты и их обсуждение. При ежедневном введении в течение 12 недель водного экстракта мегастробилов Picea abies в дозе 12 мг/кг крысам обоих полов стока линии Wistar не обнаружено летальности животных в контрольной и экспериментальной группах как самцов, так и самок. Изменений в поведении, состоянии шерсти, состоянии слизистых у животных контрольных и экспериментальных групп не выявлено.

У двух животных в экспериментальной группе самцов были обнаружены мелкие гематомы на задних конечностях. У животных контрольных групп гематом не наблюдалось.

При ежедневном введении в течение 12 недель сухого водного экстракта мегастробилов Picea abies в дозе 12 мг/кг не было выявлено достоверных отличий в результатах массометрии контрольных и экспериментальных групп. При анализе динамики веса у самок статистически значимых различий между средними весами экспериментальной и контрольной групп выявлено не было. Самцы крыс, подвергавшиеся хроническому введению сухого экстракта мегастробилов Picea abies , медленнее набирали массу. Однако статистическая значимость ни в одной из временных точек достигнута не была (рис. 1).

При длительном пероральном введении исследуемого вещества наибольшему влиянию подверглись органы ЖКТ. В связи с этим для определения степени местного действия изучаемого препарата

а

б

Рис. 1. Динамика массы тела лабораторных крыс, получавших экстракт мегастробилов Picea abies на протяжении 12 недель (точками показаны средние значения массы тела групп в конкретный момент времени, «усами» обозначены верхние и нижние 95%-ные доверительные интервалы. Сплошная линия – контрольная группа, пунктирная линия – экспериментальная группа): а – самцы; б – самки

Тонкая кишка самцов этой же группы имела признаки нормального строения. Слизистая оболочка формировала ворсинки и крипты, покрытые однослойным столбчатым каемчатым эпителием. Строение покровного эпителия не отличалось в контрольной и экспериментальной группах. Бокаловидные клетки крупные, в области ворсинок – с признаками секреторной активности. В криптах энтероциты в состоянии митоза. В собственной пластинке слизистой и подслизистой оболочки кровеносные и лимфатические капилляры неравномерно расширенные, часть из них содержит клетки крови. В мышечной оболочке без структурных особенностей. В прослойках между слоями мышц четко верифицируются слегка расширенные сосуды и нервные ганглии. В целом, строение стенки кишки у самцов экспериментальной группы соответствовало контролю (рис. 2, 3).

В результате исследования установлено, что в гистологической структуре изучаемых органов у самцов в контрольной и экспериментальной группах специфических особенностей строения не было.

Для определения токсического влияния экстракта были исследованы структурные особенности почек и сердца крыс в контрольной и экспериментальной группах, разделенных по гендерному признаку.

У животных экспериментальной группы (самцы и самки) изменений в структуре сердца не выявлено. Эндокард состоял из эндотелия и соединительной ткани, его строение не отличалось от контрольных данных. Кардиомиоциты миокарда, формируя функциональные волокна, имели эухром-ные ядра и равномерно окрашенную оксифильную цитоплазму с поперечной исчерченностью. В строме миокарда, в узких ее прослойках из соединительной ткани определялись неравномерно расширенные кровеносные капилляры. Строение кардиомиоцитов и стромы миокарда соответствовало таковому в группе контроля. Наружная оболочка сердца имела обычное строение. Гистологическое строение сердца у самцов и самок опытной группы не имело гендерных отличий и соответствовало строению органов крыс группы контроля (рис. 6).

Рис. 2. Контрольная группа (самцы). Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 400: 1 - желудок, слизистая оболочка, железы; 2 – подслизистая и часть мышечной оболочки; 3 – тонкая кишка, слизистая оболочка, ворсинки и крипты; 4 – тонкая кишка, часть слизистой оболочки с криптами, подслизистая и мышечная оболочки

Рис. 3. Экспериментальная группа (самцы). Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 400: 1 - желудок, слизистая оболочка, железы; 2 – подслизистая и часть мышечной оболочки; 3 – тонкая кишка, слизистая оболочка, ворсинки и крипты; 4 – тонкая кишка, часть слизистой оболочки с криптами, подслизистая и мышечная оболочки

Рис. 4. Контрольная группа (самки). Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 400: 1 - желудок, слизистая оболочка, железы; 2 – желудок, часть слизистой, подслизистая и часть мышечной оболочки; 3 – тонкая кишка, слизистая оболочка, ворсинки; 4 – тонкая кишка, мышечная оболочка

Рис. 5. Экспериментальная группа (самки). Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 400: 1 - желудок, слизистая оболочка, железы; 2 – желудок, часть слизистой, подслизистая и часть мышечной оболочки; 3 – тонкая кишка, слизистая оболочка, ворсинки и крипты; 4 – тонкая кишка, часть слизистой оболочки с криптами, подслизистая и мышечная оболочки

Рис. 6. Самцы. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 400: 1 - контрольная группа, сердце, миокард;

2 – экспериментальная группа, сердце, миокард; 3 – контрольная группа, почка, корковое вещество;

4 – экспериментальная группа, почка, корковое вещество

В почках экспериментальной группы хорошо различимо корковое и мозговое вещество. В корковом веществе определялись почечные тельца нефронов, проксимальные и дистальные извитые канальцы. Структура канальцев не имела особенностей. Выстилка проксимальных и дистальных отделов представлена однослойным кубическим эпителием, просвет канальцев был свободен. Почечные тельца заполнены сетью капилляров и четко просматриваемой капсулой нефрона. Просвет капсулы был свободен. Строение почечного тельца у животных экспериментальной группы не отличалось от такового в контрольной группе. В канальцах мозгового вещества структурных особенностей не выявлено. Как и у животных группы контроля, стенка этих канальцев выстлана однослойным низким кубическим эпителием. Просвет канальцев был свободным. Пространство между канальцами в корковом и мозговом веществе заполнено соединительной тканью с кровеносными сосудами. Строение сосудов не имело особенностей. Таким образом, гистологическое строение почек у самцов и самок экспериментальной группы не имело гендерных отличий и соответствовало строению органов крыс группы контроля (рис. 7).

Следующим этапом работы было исследование состава костной ткани на фоне длительного введения экстракта. Результаты представлены в таблице. После трехмесячного введения водного экстракта мегастробилов Picea abies у лабораторных животных не наблюдалось снижения содержания основных элементов в костной ткани – кальция и фосфора. Средние значения по содержанию кальция и фосфора были выше в опытной группе, но различия не имели статистической значимости.

Крысам обоих полов стока линии Wistar ежедневно в течение 12 недель перорально вводили водный экстракт мегастробилов Picea abies в дозе 12 мг/кг. В исследовании было проведено разделение животных по гендерному признаку с выделением экспериментальной и контрольной групп.

Длительное пероральное введение водного экстракта мегастробилов Picea abies не привело к гибели животных ни в одной из исследуемых групп. В ходе анализа установлено, что прирост массы тела у самцов экспериментальной группы был ниже по сравнению с самцами контрольной группы, но статистическая значимость ни в одной из сравниваемых точек не была достигнута. В группах самок никаких изменений в скорости набора массы тела

Рис. 7. Самки. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 400: 1 - контрольная группа, сердце, миокард;

2 – экспериментальная группа, сердце, миокард; 3 – контрольная группа, почка, корковое вещество;

4 – экспериментальная группа, почка, корковое вещество

Элементный состав костной ткани на фоне трехмесячного введения водного экстракта мегастробилов Picea abies

Элемент	Содержание, мг/г
	Контрольная группа	Опытная группа	p -value
Са	127,55 ± 25,64	146,39 ± 9,9	0,2741
Р	34,81 ± 15,55	49,74 ± 10,38	0,2423

Примечание: * p – значение по критерию Стьюдента; p < 0,05 свидетельствует о наличии достоверных отличий от данных контрольной группы.

не наблюдалось. Не наблюдалась разницы между экспериментальными и контрольными группами в характере волосяного покрова, состоянии слизистых оболочек. Животные двух сравниваемых групп потребляли одинаковое количество корма и жидкости. Длительное введение водного экстракта мегастробилов Picea abies не оказывало влияния на поведение крыс при сравнении данных между экспериментальной и контрольной групп животных.

Обнаруженные мелкие гематомы у двух самцов крыс могут свидетельствовать о влиянии про-цианидинов экстракта мегастробилов Picea abies на систему свертывания крови. Процианидины экс- тракта могут ингибировать агрегацию тромбоцитов путем усиления выделения оксида азота эндотелием сосудов [21].

Гистологическое исследование сердца и почек самцов и самок в эксперименте показало отсутствие токсического влияния водного экстракта мегастробилов Picea abies . В сердце животных экспериментальных групп не наблюдалось изменения в строении оболочек сердца, за исключением неравномерного расширения капилляров межмышечной стромы. Однако схожие изменения были установлены и в контрольных группах самцов и самок. Гистологическое строение почек у животных опытных групп не было изменено.

Расширение сосудов микроциркуляторного русла в органах пищеварительной системы и в сердце у животных как экспериментальной, так и контрольной групп не сопровождалось изменением проницаемости стенок сосудов, не приводило к развитию отека, клеточной инфильтрации или каких-либо других явных признаков нарушения кровообращения. Выявленные изменения носят неспецифический характер и, вероятно, причиной их появления стало общее воздействие на животных других внешних факторов, не связанных с введением исследуемого вещества.

Наблюдаемое неравномерное расширение лимфатических сосудов и капилляров может быть частично связано с воздействием процианидинов и флавоноидов при длительном введении экстракта. Известны исследования, в которых установлена способность флавоноидов и процианидинов некоторых растений вызывать вазодилатацию [23, 24]. Наибольшая концентрация процианидинов после введения наблюдается в брыжеечном жире, что позволяет предположить, что процианидины перемещаются по организму преимущественно по лимфатической системе [8]. При применении проциа-нидинов происходит увеличение уровня эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS), что ведет к увеличению выработки оксида азота и улучшению работы эндотелия [25]. Расширение кровеносных и лимфатических сосудов под действием проциани-динов и флавоноидов экстракта мегастробилов Picea abies требует дальнейшего изучения. Данные литературных источников не исключают развития вазодилатации при применении экстрактов, содержащих процианидины.

Безопасность длительного применения экстрактов с высоким содержанием процианидинов была доказана и в других исследованиях. При введении экстракта виноградных косточек с высоким содержанием процианидинов наблюдалось снижение ожирения у животных, вызванного высоко жи- ровой диетой, а также снижение системных маркеров воспаления (фактора некроза опухоли альфа и С-реактивного белка) [23].

Также было показано, что пероральное применение в течение трех месяцев пищевой добавки «Пикногенол», содержащей процианидины коры средиземноморской сосны, повышает тонус и эластичность сосудов нижних конечностей, что благоприятно сказывается при устранении симптомов варикозного расширения вен. Побочные эффекты при применении указанного средства среди участников исследования не зафиксированы [26].

Для оценки влияния длительного перорального введения исследуемого экстракта на всасывание и распределение химических элементов в организме животных определяли содержание элементов в костной ткани. Ключевыми элементами, от поступления которых в первую очередь зависит формирование костной ткани, являются кальций и фосфор. Дефициты этих элементов приводят к развитию многих заболеваний опорно-двигательного аппарата, включая остеопороз.

Результаты исследования показывают тенденцию к увеличению содержания кальция и фосфора в костях крыс и свидетельствуют, что длительный пероральный прием исследуемого экстракта безопасен для нормального развития костной ткани.

Выводы:

Финансирование. Исследование выполнено при поддержке Пермского научно-образовательного центра «Рациональное недропользование», 2023.