К оценке риска развития и прогрессирования неалкогольного стеатоза печени с использованием факторов TNF-, IL-6, VEGF и полиморфизмов их генов

Булатова Ирина Анатольевна – доктор медицинских наук, заведующий кафедрой нормальной физиологии, профессор кафедры факультетской терапии № 2, профессиональной патологии и клинической лабораторной диагностики (e-mail: ; тел.: 8 (342) 217-10-31; ORCID: .

Пестренин Лев Дмитриевич – преподаватель кафедры патологической физиологии (e-mail: ; тел.: 8 (342) 217-10-31; ORCID: .

Шевлюкова Татьяна Петровна – доктор медицинских наук, профессор кафедры акушерства и гинекологии (e-mail: ; тел.: 8 (922) 394-28-08; ORCID: .

Мифтахова Альбина Мавлетьяновна – аспирант кафедры патологической физиологии (e-mail: ; тел.: 8 (963) 871-91-56; ORCID: .

Кривцов Александр Владимирович – кандидат медицинских наук, заведующий лабораторией иммуногенетики (e-mail: ; тел.: 8 (342) 236-86-99; ORCID: .

Гуляева Инна Леонидовна – доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой патологической физиологии (e-mail: ; тел.: 8 (342) 217-10-31; ORCID: .

В структуре патологии печени лидирующее место занимает неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) [1]. Всероссийское исследование DIREG 2 показало, что НАЖБП встречается более чем у одной трети взрослого населения, причем среди этих пациентов неалкогольный стеатоз печени (НАСП) был выявлен в 80 % случаев. По данным некоторых исследователей, НАЖБП в 95 % случаев ассоциирована с метаболическим синдромом, чаще в виде жирового гепатоза [2]. У ряда лиц заболевание осложняется формированием воспаления печени (неалкогольный стеатогепатит). Хроническая воспалительная реакция ведет к развитию фиброза и цирроза, а также предрасполагает к развитию рака печени. Это является стимулом для более внимательного изучения механизмов развития НАЖБП с целью определения факторов риска, в том числе и генетических.

По одним данным, НАЖБП чаще регистрируют у женщин в возрасте 40–50 лет, соотношение мужчин и женщин 1:3, хотя заболевание встречается во всех возрастных группах [3]1. По результатам Всероссийского исследования DIREG 1, которое включало 30 754 человека, женщины с НАЖБП составили 56 %. Согласно этому исследованию наиболее распространенными факторами риска развития НАЖБП были дислипидемия (2-го типа по Фрид-риксену) – у 75,9 % пациентов, артериальная гипертензия – у 69,9 % и гиперхолестеринемия – у 68,8 % [4]. По другим данным, факторами риска развития НАЖБП являлись: мужской пол, возраст от 30 до 59 лет, избыточная масса тела и ожирение (индекс массы тела более 25 кг/м2), гипергликемия, гипертриглицеридемия, гиперхолестеринемия [5].

Единого хорошо изученного механизма развития НАЖБП не существует. Патогенез НАЖБП многофакторный и включает в себя следующие процессы: главное звено – инсулинорезистентность и изменение профиля гормонов – регуляторов жирового обмена, формирование гиперинсулинемии, активация липолиза в жировой ткани, повышение количества свободных жирных кислот, активация процессов глюконеогенеза в печени, приводящих к гипергликемии, повышение продукции липопротеидов очень низкой плотности и снижение захвата триглицеридов с развитием дислипидемии, повышение активности провоспалительных цитокинов и свободных радикалов с развитием воспаления в печени, что в конечном счете ведет к прогрессированию стеатоза в стеатогепатит и фиброз печени с дальнейшим возможным переходом в цирроз [6].

Одним из компонентов сложного патогенеза развития и прогрессирования НАЖБП является воспаление, основными медиаторами которого выступают цитокины. К ключевым цитокинам можно отне- сти интерлейкин-6 (IL-6) и фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), они стимулируют воспаления, регулируют апоптоз и некроз гепатоцитов, усугубляют инсу-линорезистентность, а также индуцируют фиброз [7].

По данным ряда исследований [8–10], TNF-α коррелирует со степенью жировой дистрофии печени и активирует адгезивные свойства эндотелиальных клеток. Рядом авторов было установлено повышение уровня IL-6 в крови больных НАЖБП [11–13]. При этом концентрация IL-6 в печени имела прямую корреляцию с активностью воспаления, выраженностью фиброза и уровнем этого цитокина в крови, особенно при прогрессировании НАЖБП [14].

Васкулоэндотелиальный фактор роста (VEGF) при воспалительном процессе активирует выработку коллагена звездчатыми клетками печени и механизмы неоангиогенеза. В ряде исследований, проведенных на крысах с НАЖБП и метаболическим синдромом, было показано, что дисфункция эндотелия возникает еще до начала воспаления и развития фиброза в печени [15–18].

В последние годы активно изучают проблему наследственной предрасположенности к развитию НАЖБП. К значимому аспекту следует отнести наличие полиморфизма генов, регулирующих имму-новоспалительные процессы [19]. Гены цитокинов высокополиморфны. Тем не менее количество исследований, направленных на изучение связи полиморфизма генов TNF-α и IL-6 с развитием НАЖБП, невелико, а результаты порой противоречивы. Возможно, это связано с наличием особенностей распределения частот аллелей и генотипов в популяции, обусловлено регионом проживания, расовыми различиями, а также разным методическим подходом. Например, соотношение частот аллелей (А к G) по -308G>A полиморфному маркеру гена TNF у населения Азиатско-Тихоокеанского региона составляет 1,2–7 %, у здоровых жителей Китая – около 3,3 %, а в других популяциях находится в пределах от 12 до 24 %. При этом генотип АА по данному гену у жителей Азиатско-Тихоокеанского региона не встречается, тогда как у представителей других народностей обнаруживается в 1,2–7,9 % [20].

В ряде исследований определялся вклад мутаций в промоторной части гена IL-6 в развитие патологии печени, однако полученные результаты оказались достаточно противоречивыми. По данным литературы, у европейцев с неалкогольным стеато-гепатитом и гепатоцеллюлярной карциномой частота встречаемости аллеля С по -174G>C маркеру гена IL-6 значимо выше, чем в группе здоровых [21, 22]. Также было обнаружено, что носительство аллеля С по -174G>C полиморфизма гена IL-6 ассоциируется с развитием неалкогольного стеатогепатита в рос- сийской популяции [23]. Однако в другом исследовании корреляции данного полиморфизма с развитием патологии печени выявлено не было [24].

Цель исследования – разработать систему расчета риска развития и прогрессирования неалкогольного стеатоза печени (НАСП) на основе интерлейкина-6 (IL-6), фактора некроза опухоли альфа (TNF-α), васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF) и полиморфизма генов TNF-α в регионе -308G/A (rs1800629), IL-6 в регионе -174G/С (rs1800795) и VEGFA в регионе -634G/C (rs2010963).

Материалы и методы. Обследовано 52 больных неалкогольной жировой болезнью печени с клинической формой неалкогольного стеатоза печени (НАСП), из них женщин было 35 (67 %), мужчин – 17 (33 %). Средний возраст пациентов составил 43,0 ± 11,1 г. Наличие стеатоза печени подтверждали путем ультразвукового исследования. В исследование не включали пациентов с жировым гепатозом алкогольной и лекарственной этиологии, которая устанавливалась во время сбора анамнеза, а также не включали больных с неалкогольным стеатогепатитом, который устанавливался оценкой уровня трансаминаз. Анализируемые выборки были одинаково подвержены влиянию факторов, вызывающих развитие НАСП. Преобладание в нашей случайной выборке в Пермском крае лиц женского пола с НАСП сопоставимо с данными более крупных всероссийских исследований [3, 4]¹.

В группу контроля вошли 65 практически здоровых человек, сопоставимых по полу и возрасту с основной группой пациентов, без патологии печени и другой патологии, ассоциированной с метаболическим синдромом. Всеми участниками была получена полная информация об исследовании и подписано добровольное информированное согласие.

Уровень цитокинов TNF-α, IL-6 и VEGF в сыворотке крови 15 практически здоровых лиц и 40 больных НАСП определяли методом ИФА на спектрофотометре Stat-Fax 2100 (США) с применением наборов фирмы ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).

Исследование полиморфизма генов TNF-α в регионе -308G/A, IL-6 в регионе -174G/С и VEGFA в регионе -634G/C у 52 пациентов с НАСП и 65 здоровых доноров осуществляли на амплификаторе Real-time CFХ-96 (Bio-Rad Laboratories, Inc., США). Использовали аллель-специфическую ПЦР «SNP-Скрин» (ЗАО «Синтол», г. Москва).

Для определения риска развития и прогрессирования НАСП проводилась оценка генетического профиля пациентов и доноров в зависимости от встречаемости генотипов и аллелей исследуемых полиморфизмов генов по разработанной нами шкале балльной оценки.

Значение баллов:

0 – по трем полиморфизмам пациент гомозиготен по протективным аллелям;

• 1    – гетерозиготен по одному из двух генов;

• 2    – гетерозиготен по двум генам;

• 3    – обследуемый имеет обе аллели риска по одному гену, гомозиготен по протективным аллелям по другому гену;

• 4    – по одному гену у обследуемого имеются обе аллели риска, по другому гену обследуемый гетерозиготен;

• 5    – обследуемый по обоим генам гомозиготен по аллелям риска TNF-α (АА) / VEGFA (СС).

По предложенной шкале при наличии у здоровых доноров 0–1 балла риск развития НАСП оценивается как низкий, 2–3 баллов – умеренный, 4–5 баллов – высокий. При выявлении у пациентов 0–1 балла риск прогрессирования НАСП оценивается как низкий, 2–3 баллов – умеренный, 4–5 баллов – высокий.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы Statistica 7.0. Количественные параметры были представлены в виде медианы и интерквартильного размаха ( Q 1– Q 3). Значимость различий независимых групп оценивалась с помощью критерия Манна – Уитни. Для оценки взаимосвязей применяли коэффициент корреляции Спирмена ( r ) с определением уровней значимости. Метод χ ² использовали для описания соотношения частот генотипов и аллелей исследуемых полиморфизмов генов. По таблице сопряженности (кросстабуляции) выявляли зависимость между изучаемыми качественными признаками с использованием коэффициента сопряженности Пирсона ( Ki )². Достоверными считались различия между выборками при р < 0,05.

Результаты и их обсуждение. По результатам обследования у пациентов с НАСП концентрации TNF-α, IL-6 и уровень VEGF в сыворотке крови были значимо выше, чем в контрольной группе ( p = 0,03, p = 0,00003 и р = 0,001 соответственно) (табл. 1).

Таблица 1

Концентрации цитокинов TNF-α, IL-6 и VEGF в контрольной группе и у пациентов с НАСП ( Me , 25-й и 75-й перцентили)

Показатель	Контрольная группа, n = 15	Пациенты НАСП, n = 40	p
TNF-α, пг/мл	0 (0; 0,02)	1,1 (0; 3,15)	0,03*
IL-6, пг/мл	0 (0; 0)	0,9 (0; 2,2)	0,0003*
VEGF, пг/мл	86,65 (10,7; 132,4)	184,6 (94,7; 291,6)	0,001*

П р и м е ч а н и е : р – значимость различий, * – статистически значимые различия.

Повышение уровня исследуемых провоспали-тельных цитокинов в крови больных НАСП характеризует наличие воспалительного синдрома, что было отмечено и рядом других авторов при НАЖБ [8, 11–13]. При этом TNF-α достоверно коррелировал с концентрацией IL-6 ( r = 0,54; p = 0,0001).

Увеличение концентрации VEGF в сыворотке крови пациентов с НАСП может свидетельствовать о развитии дисфункции эндотелия при этой патологии. Полученные нами данные согласуются с результатами ряда других исследований, подтвердивших наличие эндотелиальной дисфункции при стеатозе печени не только биохимическими, но и функциональными методами [25, 26].

У 52 пациентов с НАСП и 65 здоровых доноров практически с одинаковой частотой выявлялись генотипы GG гена TNF-α: в 13,46 и 21,54 % соответственно (χ² = 3,23; р = 0,25; ОR = 0,57) и GА – в 78,85 и 78,46 % соответственно (χ² = 1,28; р = 0,96; ОR = 1,02) полиморфизма гена TNF-α в позиции rs1800629. Значимых различий по распределению аллелей G и А гена TNF-α в регионе -308G/A в изучаемых группах не было обнаружено ( р = 0,58 и р = 0,58 соответственно) (табл. 2).

Однако генотип АА гена TNF-α в регионе -308G/A значимо чаще регистрировался у больных НАСП, чем в популяции здоровых (7,69 и 0 % со- ответственно; χ2 = 6,05; р = 0,04; ОR = 1,76), что отмечали другие исследователи у жителей Азиатско-Тихоокеанского региона [20]. Возможно, носительство генотипа АА гена TNF-α (rs1800629) значимо в плане генетической предрасположенности к НАСП.

По полиморфизму гена IL-6 в регионе -174G/С (rs1800795) значимых различий нами не было выявлено. В обеих когортах отмечено преобладание генотипа GС – в 52,31 и 51,92 % соответственно (χ² = 0,36; р = 0,97; ОR = 0,98). Аллели G и С также встречались с одинаковой частотой ( р = 0,58 и р = 0,50 соответственно) (табл. 3). В работах других исследователей также опубликованы данные об отсутствии связи этого полиморфизма с развитием НАЖБ [24].

При изучении аллельных вариантов гена VEGFA (G-634C) в позиции rs2010963 нами было установлено, что генотип GС преобладал у здоровых в 35,38 % (χ² = 7,71; р = 0,04). Однако гомозигота СС обнаруживалась значимо чаще в когорте больных НАСП – в 28,85 % случаев с высокой вероятностью ( ОR = 3,36), а у здоровых – лишь в 10,77 % (χ² = 6,18; р = 0,02). Аллель С гена VEGFA в регионе -634G/C у больных НАСП регистрировался в 54,81 % случаев, что было значимо выше, чем у доноров (χ² = 6,83; р = 0,01; ОR = 2,00) (см. табл. 2).

Таблица 2

Частота встречаемости аллельных вариантов генов TNF-α в регионе -308G/A (rs1800629), IL-6 в регионе -174G/С (rs1800795) и VEGFA в регионе -634G/C (rs2010963) у пациентов с НАСП и в группе здоровых доноров

Генотип / аллели генов		Доноры ( n = 65), % ± m	НАСП ( n = 52), % ± m	ОR	р
TNF-α - 308G/A	GG, %	21,54 ± 5,1	13,46 ± 4,73	0,57	0,25
	GA, %	78,46 ± 5,1	78,85 ± 5,66	1,02	0,96
	AA, %	0 ± 0	7,69 ± 3,69	1,76	0,04*
Аллели	G-аллель, %	58,46 ± 4,32	52,88 ± 4,89	0,72	0,58
	A-аллель, %	39,23 ± 4,28	47,12 ± 4,89	1,38	0,58
IL-6 -174G/С	GG, %	32,31 ± 5,8	28,85 ± 6,28	0,85	0,69
	GС, %	52,31 ± 6,2	51,92 ± 6,93	0,98	0,97
	СС, %	15,38 ± 4,47	19,23 ± 5,47	1,31	0,59
Аллели	G-аллель, %	58,46 ± 4,32	54,81 ± 4,88	0,86	0,58
	С-аллель, %	41,54 ± 4,32	45,19 ± 4,88	1,16	0,58
VEGFA -634G/C	GG, %	35,38 ± 5,93	19,23 ± 5,47	0,43	0,04*
	GC, %	53,85 ± 6,18	51,92 ± 6,93	0,93	0,84
	CC, %	10,77 ± 3,85	28,85 ± 6,28	3,36	0,02*
Аллели	G-аллель, %	62,31 ± 4,25	45,19 ± 4,88	0,50	0,01*
	C-аллель, %	37,69 ± 4,25	54,81 ± 4,88	2,00	0,01*

П р и м е ч а н и е : OR – отношение шансов, р – значимость различий, * – различия статистически значимые.

Таблица 3

Генетический профиль доноров и пациентов с НАСП

Группы	Баллы
	0	1	2	3	4	5
Доноры, % (абс.)	9 (6)	42 (27)	35 (23)	3 (2)	11 (7)	–
НАСП, % (абс.)	2 (1)	23 (12)	40 (21)	4 (2)	29 (15)	2 (1)

Нами не было выявлено значимых различий в частотах генов у женщин и мужчин с НАСП. Учитывая тот факт, что гены расположены в аутосомах (неполовых хромосомах) и наследуются независимо от пола, мы полагаем, что гендерный фактор не оказывает значимого влияния на риск развития НАСП.

Таким образом, можно предположить, что предиктором развития НАСП является аллель С в локусе гена VEGFA (G-634C). В наших предыдущих исследованиях была показана его значимость при хро-низации вирусных заболеваний печени [27].

Следовательно, риск развития НАСП ассоциирован с носительством генотипа АА гена TNF-α -308G/A и генотипа СС гена VEGFA -634G/C.

При оценке зависимости по таблице сопряженности в группе с НАСП была выявлена взаимосвязь полиморфизма региона -308G/A гена TNF-α с активацией выработки цитокинов TNF-α и IL-6 ( Ki = 0,558; р = 0,043 и Ki = 0,597; р = 0,042 соответственно), что может приводить к прогрессированию иммуновоспалительного синдрома в группе носителей.

Для определения риска развития и прогрессирования НАСП проводилась оценка генетического профиля здоровых доноров и пациентов в зависимости от встречаемости генотипов и аллелей генов TNF-α в регионе -308G/A и VEGFA в регионе -634G/C по разработанной нами шкале балльной оценки. По предложенной шкале при наличии у здоровых доноров 0– 1 балла риск развития НАСП оценивается как низкий, 2–3 баллов – как умеренный, 4–5 баллов – как высокий. При выявлении у пациентов 0–1 балла риск прогрессирования НАСП оценивается как низкий, 2–3 баллов – как умеренный, 4–5 баллов – как высокий.

В группе доноров более половины (51 %) имели низкий риск развития НАСП (0–1 балл по шкале), 38 % – умеренный (2–3 балла), 11 % – высокий (4 балла) (табл. 3).

В группе пациентов 25 % имели низкий риск прогрессирования НАСП (0–1 балл), почти половина больных (44 %) – умеренный (2–3 балла), а треть обследуемых (31 %) – высокий риск (4–5 баллов) по шкале.

Выводы. Среди больных НАСП преобладают женщины в возрасте от 32 до 54 лет (67 %). У больных НАСП выявлены высокие уровни провоспали-тельных цитокинов TNF-A и IL-6, а также повышенная концентрация VEGF, что свидетельствует о наличии воспалительного синдрома и эндотелиальной дисфункции при данной патологии.

У пациентов с НАСП в регионе -308G/A гена TNF-α значимо чаще обнаруживалась гомозигота АА, чем в популяции доноров.

При изучении комбинаций аллельных вариантов гена -634G/C VEGFA в позиции rs2010963 гомозигота СС и аллель С значимо чаще регистрировались в группе больных НАСП, чем у практически здоровых лиц.

По генотипам и аллелям полиморфизма гена IL-6 в регионе -174G/С (rs1800795) не выявлено достоверной разницы. Следовательно, риск развития НАСП ассоциирован с носительством генотипа АА гена TNF-α -308G/A и генотипа СС гена VEGFA -634G/C, особенно в сочетании с высоким уровнем провоспалительных цитокинов.

Предлагаемые подходы с применением анализа генетического профиля по генам TNF-α в регионе -308G/A и VEGFA в регионе -634G/C позволяют провести раннюю неинвазивную диагностику риска развития НАСП у здоровых (при наличии 4–5 баллов риск оценивается как высокий) и риска возможного прогрессирования НАСП у больных (при наличии 4–5 баллов риск развития и соответственно прогрессирования оценивается как высокий) и могут быть использованы в практическом здравоохранении.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.