К вопросу о маркировании локусов Pl, контролирующих устойчивость подсолнечника к возбудителю ложной мучнистой росы

Введение. Болезнь подсолнечника – ложная мучнистая роса, вызываемая облигатным паразитом – оомицетом Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni, является одной из самых вредоносных. При благоприятных условиях для развития возбудителя, болезнь вызывает значительное сокращение урожая семян подсолнечника и содержания в них масла [1]. К настоящему времени в мире обнаружено более 45 физиологических рас патогена и наблюдается постоянное возникновение новых, более вирулентных. Так, если до 2007 г. в Европе насчитывалось 13 рас патогена, в Америке – 20, в России в Краснодарском крае – 7, то уже к 2015 г. их число возросло до 24 в Европе и до 40 в Америке [1; 2]. В Краснодарском крае за последние 5 лет идентифицированы три новых расы: 334, 713 и 733 [4].

Наиболее эффективным методом контроля над возбудителем болезни является введение доминантных генов устойчивости к нему в растение-хозяина. Устойчивость к P. halstedii контролируется генами Pl. Впервые они были идентифицированы в культурном подсолнечнике еще в 70-х годах прошлого столетия, обозначены как Pl 1 и Pl 2 , контролировали устойчивость к расам 100 и 300 соответственно [5; 6]. Позднее они были картированы как относящиеся к восьмой группе сцепления LG на генетической карте SSR-локусов (Simple Sequence Repeat) [7]. Гены Pl 3 и Pl 4 контролируют устойчивость к этим же расам, локализация их на генетической карте подсолнечника пока не известна [8]. Гены Pl 5 и Pl 8 контролируют устойчивость к 16-и расам P. halstedii [9]. Эти два гена сцеплены и относятся к тринадцатой группе сцепления на генетической карте SSR-локусов. Ген Pl 6 так же, как Pl 1 и Pl 2 , расположен в восьмой группе сцепления LG и контролирует устойчивость к расам 100, 300, 700, 703, 710, 330, 770 и 730. К этой же группе сцепления относятся и кластеры генов Pl 7 , Pl 9 , Pl 10 [10]. Анализ публикаций, посвященных картированию генов устойчивости подсолнечника к P. halstedii , показал, что тип их расположения является одиночным диаллельным, то есть один локус имеет множество кодоминантных аллелей, контролирующих устойчивость к разным расам патогена [8; 9; 13; 16; 28]. Сгруппированы они, как минимум, в четырех геномных комплексах в трех группах сцепления (LG) [16].

Цель исследования – поиск ДНК-маркеров для идентификации генов, контролирующих устойчивость к P. halstedii , в селекционном материале ВНИИМК и создание на их основе системы маркеров с последующим использованием ее в селекционных программах, направленных на создание генотипов подсолнечника с комплексной устойчивостью к разным расам возбудителя ложной мучнистой росы.

Материалы и методы Объектом исследования послужили 14 линий-дифференциаторов устойчивости подсолнечника, входящих в международный тест-набор для идентификации рас P. halstedii (таблица).

Таблица 1

Линии-дифференциаторы устойчивости подсолнечника к поражению ложной мучнистой росой, содержащие известные гены Pl

Линия-дифференциатор	Pl -ген	Группа сцепления	Литературный источник
RHA-419	Pl arg	LG1	Dussle et al., 2004; Wieckhorst et al., 2010; Imerovski et al., 2014
XRQ	Pl 5	LG13	Bert et al., 2001; Radwan et al., 2004
83HR4RM	Pl 7	LG8	Jocić et al., 2012
HIR-34	Pl 4	Не определена	Jocić et al., 2012
PSC8	Pl 2	LG8	Gascuel et al., 2014
YVQ	Pl 8	LG13	Gascuel et al., 2014
HA-335	Pl 6	LG8	Bouzidi et al., 2002; Panković et al., 2007
HA-R5	Pl 13	LG1	Mulpuri et al., 2009; Bertero de Romano et al., 2010
HA-R4	Pl 16	LG1	Liu et al., 2012
803-1	Pl 5	LG13	Gascuel et al., 2014
PM-17	Pl 5	LG13	Gascuel et al., 2014
DM-2	Pl 5, Pl 11, Pl 12	LG13	Rahim et al., 2002
RHA-274	Pl 2 , Pl 9, Pl 10	LG8	Gulya et al., 1991; Rahim et al., 2002; Molinero-Ruiz et al., 2002; Romano et al., 2010
RHA-265	Pl 1	LG8	Gedil et al., 2001; Rahim M., 2002

Для выделения ДНК применяли метод, основанный на использовании лизирующего буфера, содержащего гексадеци-лтриметиламмоний бромид (СТАВ) с модификациями [11; 12]. Концентрацию ДНК в полученном препарате определяли визуально по интенсивности свечения пробы объемом 10 мкл в ультрафиолетовом свете в 1 %-ном агарозном геле с добавлением 2 мкл бромистого этидия. Электрофорез растворов ДНК проводили при напряжении 100 V в течение 30 мин в трис-ацетатном буферном растворе (ТАЕ).

Для ПЦР-анализа использовали 12 праймеров (HAP1, HAP2 HAP3, Ha-P1, Ha-P2, Ha-P3, Ha-P4, Ha-P5, Ha-P6, ORS 37, ORS 166 и ORS 1043), разработанных для маркирования локусов Pl 5 Pl 6 Pl 8 [9; 13; 14; 15]. Полимеразную цепную реакцию выполняли в реакционной смеси (25 мкл) следующего состава: 67 мМ Трис-HCl (рН 8,8); 16,6 мM сульфата аммония; 1,5–3,0 мM MgCl 2 ; 0,01 % Tween 20; по 0,2

мM дезоксирибонуклеозидфосфатов; по 10 пМ праймеров; 10 нг матричной ДНК и 1 ед. рекомбинантной термостабильной ДНК-полимеразы (НПО «СибЭнзим», Россия). Реакции проводили в термоциклере S1000тм (BioRad, США) при следующих температурных режимах: начальная денатурация при 95 °С в течение 3 мин, далее 35 циклов с последовательной сменой температур: денатурация при 94 ºС в течение 10 сек, отжиг праймера при 58–63 ºС (в зависимости от праймера) – 30 сек, элонгация при 72 ºС – 1 мин 30 сек и заключительная элонгация 10 мин.

Электрофорез продуктов амплификации проводили в геле, содержащем 2 % агарозы и SВ-буфер, с использованием камеры для горизонтального электрофореза SE-2 (Хеликон, Россия) при напряжении ≈ 200 В, силе тока ≈ 100 мА, в течение 30 мин. Гели окрашивали бромистым этидием. Для визуализации и документирования результатов электрофореза применяли систему цифровой документации видеоизображения BIO-PRINT (Vil-ber Lourmat, Франция).

Результаты и обсуждение. По сообщениям многих авторов, каждая линия-дифференциатор устойчивости из международного тест-набора для идентификации рас P. halstedii содержит один или несколько генов Pl, которые обеспечивают их устойчивость к определенным расам патогена. В таблице представлены 14 линий подсолнечника, соответствующие им гены и группы сцепления, в которых они картированы на генетической карте SSR-локусов.

Для поиска ДНК-маркеров генов устойчивости Pl5, Pl6 и Pl8 к P. halstedii исследовали молекулярно-генетический полиморфизм девяти STS (Sequence-Tagged Site) и трех SSR (Simple Sequence Repeat) локусов ДНК. Результаты ПЦР ДНК линий подсолнечника показали, что только с парой праймеров HAP1 не было получено амплифицированных фрагмен- тов. По остальным 11 локусам были подобраны оптимальные параметры реакции амплификации и получен отжиг соответствующих праймеров на матрице. По четырем локусам (ORS 166, Ha-P3, Ha-P5 и Ha-P6) не было выявлено полиморфных фракций ДНК, поэтому эти маркеры были исключены из дальнейшего исследования.

По пяти локусам (ORS 37, ORS 1043, Ha-P1, Ha-P2 и Ha-P4) выявлен полиморфизм в виде наличия–отсутствия фрагментов ДНК. Для примера на рисунках 1 и 2 представлены фореграммы продуктов амплификации ДНК с праймерами ORS 37 и ORS 1043. В результате ПЦР с праймерами, фланкирующими эти микроса-теллитные локусы, не было получено фрагментов ДНК, характерных для линии НA-335, в генотипе которой присутствует ген Pl 6 ; так же, как и для линий XRQ, YVQ, и 803-1, PM-17, DM-2 – носителей кластеров генов Pl 5 /Pl 8.

Рисунок 1 – Фореграмма продуктов амплификации ДНК линий-дифференциаторов подсолнечника с праймером ORS 1043. Дорожки:1 – RHA-419; 2 – XRQ;

3 – 83HR4RM; 4 – HIR 34; 5 – PSC8; 6 – YVQ; 7 – HA335; 8 – HAR-5; 9 – HAR-4; 10 – 803-1;

11 – PM-17; 12 – DM-2; 13 – RHA-274;

14 – RHA-265; M – маркер молекулярного веса

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 К" М

Рисунок 2 – Фореграмма продуктов амплификации ДНК линий-дифференциаторов подсолнечника с праймером ORS 37.

Дорожки: 1 – RHA-419; 2 – XRQ;

3 – 83HR4RM; 4 – HIR 34; 5 – PSC8; 6 – YVQ; 7 – Ha335; 8 – HAR-5; 9 – HAR-4; 10 – 803-1;

11 – PM-17; 12 – DM-2; 13 – RHA-274;

14 – RHA-265; M – маркер молекулярного веса

STS-локус HAP3 – один из трех, разработанных для маркирования локуса Pl 6 . Он представляет собой кластер из 13 генов, близко расположенных друг к другу, относящихся к TIR-NBS-LRR классу R-генов и картированных в группе сцепления LG8 на генетической карте SSR [13]. По данным авторов, эта праймерная пара дает четыре полиморфных фрагмента ДНК длиною от 988 до 1811 пар нуклеотидов (п.н.). Из них фракции длиною 988, 1119 и 1811 пар нуклеотидов выявлены у линий подсолнечника, устойчивых к расам 100, 300, 700, 703 и 710, а фрагмент длиною 1406 п. н. – у восприимчивого к этим расам образца. В нашем исследовании у линии НА-335 по локусу НАР3 получено два фрагмента ДНК в указанном диапазоне длин (рис. 3, дорожка 7). У линии РМ-17 (рис. 3, дорожка 8) не выявлено амплифицированных фрагментов ДНК, что может свидетельствовать об отсутствии у неё локуса Pl 6 . У остальных изученных двенадцати линий получены фрагменты ДНК разных длин, отличающиеся от таковых у линии НА-335 (рис. 3).

Был изучен молекулярно-генетический полиморфизм локуса НАР3 у линий подсолнечника селекции ВНИИМК с целью маркирования кластера генов Pl 6 . Для исследования выбраны линии, отличающиеся по устойчивости к разным расам.

М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13 14 К" М

Рисунок 3 – Фореграмма продуктов амплификации ДНК линий-дифференциаторов подсолнечника с праймером НАР3. Дорожки: 1 – RHA-419; 2 – XRQ;

3 – 83HR4RM; 4 – HIR 34; 5 – PSC8; 6 – YVQ; 7 – HА335; 8 – HAR-5; 9 – HAR-4; 10 – 803-1;

11 – PM-17; 12 – DM-2; 13 – RHA-274;14 – RHA-265; M – маркер молекулярного веса

Рисунок 4 – Фореграмма продуктов амплификации ДНК линий подсолнечника селекции ВНИИМК с праймером НАР3.

Дорожки: 1 – НА-335; 2 – Л2018-1; 3 – Л689-15; 4 – Л693-15; 5 – Л697-16; 6 – Л678-15; 7 – Л665-15; 8 – Л700-15; 9 – Л699-15; 10 – ВК920; 11 – ВК917;

12 – СЛ 24 Б; 13 – СЛ 4 Б; 14 – ВК 935 Б;

15 – ВК 934 Б; К – отрицательный контроль; М – маркер молекулярного веса

На рисунке 4 показаны результаты амплификации ДНК этих линий с праймером НАР3. На первой дорожке фрагменты ДНК линии НА-335, далее на дорожках 2–11 представлены линии с разной устойчивостью к расам P. hals-tedii. На дорожке 2 – линия Л2018-1, устойчивая к расам 330, 334, 730 и 710. Далее на дорожках 3–9 представлены фрагменты ДНК линий, устойчивых к расам 330, 730 и 710, но восприимчивых к расе 334, а на дорожках 10–11 – устойчивых только к расе 330, на дорожках 12–14 – восприимчивых ко всем четырем расам. Результаты показали, что ни у одной изученной линии не выявлено точно таких фрагментов ДНК, как у линии НА-335. У линий Л2018-1, Л689-15, Л693-15, Л697-15, Л678-15, Л700-15, ВК 920, ВК 917 с устойчивостью к одной или нескольким расам (дорожки 2–6, 8, 10, 11) не получено амплифицированных фрагментов. Мы предполагаем, что в их геноме отсутствует локус Pl6, а устойчивость к P. halstedii контролируется генами, относящимися к другим группам сцепления. У линий

Л665-15 и Л699-15 получены амплифи-цированные фрагменты ДНК размером от 988 до 1811 п.н. (рис. 4; дорожки 7, 9). У четырех линий, восприимчивых ко всем четырем расам, получены четкие фрагменты одинакового размера, но отличающиеся длиной от линий НА-335, Л665-15 и Л699-15 (рис. 4). Это согласуется с данными из литературных источников, так как праймер НАР3 продуцирует четыре фрагмента ДНК, один из которых соответствует линиям, восприимчивым к расам 100, 300, 700, 703, 710, 330, 770 и 730.

Заключение. В результате проведенного исследования был подобран и апробирован молекулярный STS-маркер НАР3, пригодный для идентификации локуса Pl 6 , контролирующего устойчивость подсолнечника к расам P. halstedii 100, 300, 700, 703, 710, 330, 770 и 730. Этот маркер может стать одним из звеньев системы ДНК маркеров для идентификации тесно сцепленных генов и проведения маркер-вспомогательной селекции на устойчивость подсолнечника к возбудителю ложной мучнистой росы.