К вопросу о разработке и исследовании липосомальной формы столбнячного и дифтерийного анатоксинов

Начало XXI века ознаменовано бурным ростом нанотехнологических исследований в различных областях нашей жизни. Фармацевтическая нанотехнология вовлекает в сферу своих интересов такие направления, как: – исследование и разработка технологии новых нанопродуктов, которые могут найти применение для создания диагностических, лечебных, реабилитационных систем;

– создание твердых тел и поверхностей с измененной молекулярной структурой;

– организация и специфика промышленного производства продуктов фармацевтической нанотехнологии;

– разработка достоверных аналитических методов оценки нанообъектов и наноструктур, а также нормативов их качества и безопасности;

– изучение токсичности, кумулятивных свойств, экологической безопасности, разработка способов утилизации продуктов нанотехнологии;

– разработка самореплицирующихся (саморазмножаю-щихся) систем на базе биоаналогов – бактерий, вирусов, простейших; развитие наноконтейнер-ных технологий векторной доставки лекарств [4 ,8].

Наноносители как средства доставки лекарств привлекают своими возможностями обеспечения контролируемых параметров фармакокинетики и локализации действия. Более 50% фармацевтических компаний-производителей используют нанотехнологии для разработки систем доставки лекарственных веществ к органам и тканям-мишеням. Эти препараты дают сегодня 80% оборота мировой наномедицины [5, 9].

Липосомы – продукт нанотехнологии, представляющие собой специфические образования, диаметром от нескольких десятков до нескольких тысяч нанометров, состоящие из одного или нескольких слоев липида, окружающих водную фазу [9].

Для практического применения липосом исключительно важна их способность удерживать вещества различной природы: от неорганических ионов и низкомолекулярных органических соединений до крупных белков и нуклеиновых кислот [1].

Включенные в липосомы лекарственные вещества становятся более устойчивыми в организме, более эффективными и менее токсичными, так как изолированы липидной мембраной от повреждающих воздействий внешних условий, в частности, от разрушения в желудочнокишечном тракте [4]. Кроме того, полученные из природных фосфолипидов липосомы, в отличие от полимерных систем доставки лекарств, полностью биодеградируемы и биосовместимы, пригодны для включения в них многих фармакологических агентов, в том числе ферментов, гормонов, витаминов, антибиотиков, иммуномодуляторов, цитостатиков, вакцин.

В настоящее время во многих странах ведутся разработки липосомальных форм вакцин. Некоторые исследователи считают, что иммуногенность вакцин возрастает при заключении их в липосомы. В случае использования липосомальной вакцины иммунный ответ усиливается вследствие того, что антигены, ассоциированые с липосомами, попадают непосредственно в антиген представляющие клетки. Такое эффективное применение вакцин, возможно, позволит сэкономить значительные денежные средства [4].

Примером виросомальной вакцины является субъединичная вакцина для профилактики гриппа Инвивак (Solvay Pharmaceuticals), которая успешно прошла регистрацию в ряде стран Европейского Союза. Эта вакцина представляет собой сферические частицы менее 200 нм с двойным липидным слоем, в котором крепятся гликопротеины на внешней поверхности вируса гриппа, то есть виросомальная частица имитирует частицу натурального вируса. Клинические исследования показали, что полученная вакцина является безопасной и эффективной, особенно для лиц со сниженным уровнем иммунитета. Двойной механизм действия вакцины Инвивак сводится к следующему: виросомы стимулируют β -лимфоциты, что является очень важным для профилактики ассоциированных с гриппом заболеваний. Т-лимфоциты распознают и уничтожают инфицированные клетки. Это позволяет добиваться быстрого восстановления здоровья пациентов после перенесенной вирусной инфекции. Стимуляция гуморального и клеточного иммунитета может быть дополнительным преимуществом новой вакцины.

Липосомы предоставляют возможность конструировать поливалентные вакцины против нескольких штаммов гриппа (сингапурский, пекинский и ямагата), гепатита А и В, дифтерии, столбняка. В Швейцарии одобрено несколько таких вакцин. В этой же стране разработана лицензированная липосомальная вакцина против гепатита А. В США проходит доклиническое изучение вакцина липосомальная менингококковая [7].

Липосомы успешно применяются для иммунизации через слизистые желудочно-кишечного тракта и верхних дыхательных путей (вакцина эшерихиозная, шигеллезная Флекснера). При этом развивается как общий, так и местный секреторный иммунитет [5].

В настоящее время разработаны различные методы получения липосом: ручное встряхивание, выпаривание в обращенной фазе, озвучивание, этанольная инжекция, экструзия, спонтанная везикуляция липидов, микрофлюидизация, сушка распылением, замораживание-оттаивание, гомогенизация при высоком давлении, диализ [7].

Липосомы, полученные разными методами, гетеро-генны по размеру. Так, в результате использования способа ручного встряхивания образуются наиболее крупные липосомы – от 250 до 1900 нм. Однородные по размеру и достаточно мелкие (от 8 до 15 нм) липосомы, обработанные ультразвуком.

Фирма Biocompatibles (Великобритания) разработала полимеризованные липосомы – липогелосомы, в которых фосфолипиды, образующие липосому, связаны друг с другом ковалентными связями, а не слипаются под действием физических сил. Это повышает стабильность липосом, предотвращает их агрегацию. Для получения липогелосом использовали синтетические липиды, которые будучи диспергированы в водной среде и нагреты выше температуры фазового перехода образуют замкнутые пузырьки, состоящие из серии концентрических сфер, разделенных водной фазой [11]. Кроме того, пред- ложен способ получения липосом из спиртово-глицериновых смесей, содержащих различные поверхностноактивные вещества. Лекарственные и вакцинные препараты, изготовленные таким методом, обладают высокой лечебной и профилактической активностью [12].

В литературе имеются сведения об использовании комбинации методов замораживания-оттаивания и обращения фаз для формирования липосом диглицеридного производного метотрексата [2]. Инкапсулирование в липидные везикулы доксорубицина проведено путем совмещения воздействия ультразвука и выпаривания в обращенной фазе [3].

При использовании метода выпаривания в обращенной фазе удается инкапсулировать до 80% гидрофильных веществ и обеспечить включение во внутренний объем липосом значительного количества воды, а также максимально избежать загрязнения липидных везикул посторонней микрофлорой. Кроме того, возможна частичная автоматизация процесса выпаривания в обращенной фазе. При удалении органической фазы из реактора контакт ее с персоналом минимальный. В целом, данный способ технологичен и позволяет включать в липосомы как гидрофильные, так и гидрофобные вещества. Везикулы, полученные таким методом, гетерогенные по размеру: 150–950 нм. Выпариванием в обращенной фазе получена новая магнитоуправляемая форма преднизолона [13].

В настоящей работе предпринята попытка инкапсулирования в липосомы столбнячного и дифтерийного анатоксинов, что является перспективным для создания новых лекарственных форм этих анатоксинов.

Цель работы: получение липосомальной формы столбнячного и дифтерийного анатоксинов методом выпаривания в обращенной фазе, исследование стабильности, специфической активности полученных липосомальных дисперсий.

Материал и методы

В качестве липидной основы использовали лецитин-стандарт производства ЗАО “Биолек” (г. Харьков). Для инкапсулирования применяли анатоксины столбнячный и дифтерийный очищенные концентрированные жидкие (ФГУП “НПО “Микроген” МЗ РФ “Пермское НПО “Биомед”). Липосомы получали методом выпаривания в обращенной фазе. Использовалась пассивная технология инкапсулирования, предусматривающая одновременное диспергирование лекарственного вещества и липида в водном буфере, при этом достигалось одновременное образование липосом с включением в них лекарственного вещества. Изучение стабильности проводили путем центрифугирования липосомальных дисперсий при скорости 1500 об/мин в течение 5 мин. Для определения специфической активности анатоксинов и их липосомальных дисперсий использовали реакцию коагглюти-нации (РКОА). Учет результатов РКОА проводили по 4-крестной системе: ++++ – полная коагглютинация; +++ – хорошо выраженная коагглютинация; ++ – неполная коагглютинация; - – отсутствие коагглютинации.

Результаты и обсуждение

При получении липосомальных дисперсий первоначально проводили исследования по подбору оптимального соотношения липид/анатоксин. Интервал соотношений составил от 1:1 до 1:7. Липосомальные дисперсии используемых анатоксинов по внешнему виду представляли собой однородные молочно-белые эмульсии с различной степенью расслоения. В дальнейшем сравнивали степень расслоения полученных образцов липосомальных дисперсий анатоксинов. Исследование стабильности липосом с применением центрифугирования показало, что наименьшая степень расслоения отмечена для липосомальной дисперсии с соотношением лецитин/ столбнячный анатоксин 1:1 и лецитин/дифтерийный анатоксин 4,5:1. Центрифугат сохранял мутность, наблюдалось появление незначительного осадка. В дисперсиях с другими соотношениями компонентов произошло расслоение эмульсий, что свидетельствует о меньшей стабильности этих дисперсий.

С помощью РКОА провели изучение процесса включения столбнячного и дифтерийного анатоксина в липосомы, тем самым оценивали специфическую активность липосомальных дисперсий.

В таблице представлены результаты анализа липосомальных дисперсий дифтерийного анатоксина с помощью РКОА.

По данным таблицы, дифтерийный анатоксин (положительный контрольный образец) титровался в РКОА до разведения 1:28800 (450 x 64), а липосомальная дисперсия с соотношением лецитин/дифтерийный анатоксин 4,5:1 – до разведения 1:4. В дисперсиях с соотношениями дифтерийный анатоксин/лецитин от 1:1;5 до 1:5,5 образование коагглютинатов отмечалось до разведения 1:32. Это, возможно, свидетельствует, о наличии поверхностной фиксации дифтерийного анатоксина.

Для определения свободного анатоксина липосомальные дисперсии после центрифугирования фильтровали через фильтры “миллипор” (размер пор 0,8 мкм). Полученные фильтраты липосомальных дисперсий с соотношениями лецитин/дифтерийный анатоксин 1,5:1; 2,5:1, представляющие собой прозрачные бесцветные жидкости, давали слабоположительную реакцию коагглютина-ции, следовательно, можно предположить, что часть анатоксина находится в свободном, не связанном с липосомами, состоянии. В дисперсиях с соотношениями леци-тин/дифтерийный анатоксин 3,5:1; 4,5:1; 5,5:1 не происходило образования коагглютинатов, что свидетельствует об отсутствии свободного анатоксина. Промытые ре-суспендированные осадки четко выраженной положительной реакции не давали. Это, вероятно, говорит о включении дифтерийного анатоксина во внутреннее пространство липосом.

Изучение процесса включения столбнячного анатоксина в липосомы с помощью РКОА показало, что он полностью связывался с липосомами, поскольку, после центрифугирования полученной липосомальной дисперсии в надосадочной жидкости он не был обнаружен. Вероятно, столбнячный анатоксин находится внутри липосомы и на ее поверхности, так как полученная липосомальная

Таблица

Анализ липосомальных дисперсий дифтерийного анатоксина с помощью РКОА

Исследуемый материал Специфическая активность Примечание 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 ДА (положительный контрольный образец) исходное разведение 1:450 ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ + - ЛД с соотношениями Л/ДА 1,5:1 ++++ ++++ ++++ +++ ++ + - - Анатоксин на поверхности липосомы 2,5:1 ++++ ++++ ++++ ++ ++ - - 3,5:1 ++++ ++++ +++ ++ ++ - - 4,5:1 +++ ++ - - - Менее выраженная поверхностная фиксация 5,5:1 ++++ ++++ +++ ++ + - - - Анатоксин на поверхности липосомы Профильтрованные ЛД с соотношениями Л/ДА 1,5:1 ++ + - - - Незначительное количество свободного анатоксина 2,5:1 ++ + - - - 3,5:1 - - - Свободный анатоксин отсутствует 4,5:1 - - - 5,5:1 - - - “Пустая” липосомальная дисперсия (отрицательный контроль) - - - - дисперсия со столбнячным реагентом образует четко выраженные коагглютинаты.

Наши предположения подтверждаются данными литературы, согласно которым при получении липосомальных форм белковых соединений молекулы белка могут не только заключаться в липосомы, но и находиться на их поверхности. Исследователи также сообщают, что эти два механизма могут происходить одновременно, то есть часть вещества белковой природы может включиться в липидные везикулы, а часть связаться с их поверхнос-тью.[6].

Исследование с помощью детергента Твина-20 по определению локализации анатоксина на примере липосомальных дисперсий дифтерийного анатоксина, подтвердило включение анатоксина во внутреннее пространство липосом.

Заключение

Таким образом, в проведенных экспериментах нами показана возможность получения стабильных липосомальных дисперсий столбнячного и дифтерийного анатоксинов на основе лецитина с сохранением их специфической активности.