К вопросу о специфике репродукции вируса лейкоза крупного рогатого скота и методов его выявления

Вирус лейкоза КРС или бычий вирус лейкоза (BLV) относится к семейству ретровирусов, роду дельтавирусов. Его доля в структуре инфекционной патологии постоянно растет.

Клетками-мишенями для BLV являются В-лимфоциты с поверхностными иммуноглобулинами IgM, белками главного комплекса гистосовместимости класса 11, а также с маркерами СД 5+, СД 11b+ и CD25. Геном BLV обнаружен и в клетках СД3+, СД 4+, СД8+ и γδ-Т-клетках. Однако только в В-лимфоцитах происходит репродукция вируса (1).

Геном вириона BLV представляют две идентичные, ассоциированные друг с другом одноцепочечные +РНК. Вместе с нуклеокапсидными и капсидными белками они формируют капсид вириона, а оболочка его образуется из компонентов клеточной мембраны с включенными в них вирусными гликопротеидами gp51 и gp 28.

Считается, что в вирионе должна быть обратная транскриптаза (РНК-зависимая ДНК-полимераза или ревертаза) по аналогии с изученными ретровирусами. Когда вирус проникает в клетку и его геном освобождается от белков, на основе одной из нитей вирусной РНК с помощью этой ревертазы синтезируется ДНК, далее она замыкается в кольцо, проникает в ядро клетки и встраивается в ее геном (2). Биологическая роль второй цепи вирусной РНК не известна.

Филогенетическое сравнение различных ретровирусов показало, что экзогенный онковирус BLV отличается от всех С вирусов млекопитающих тем, что широко распространен в стадах и вместе с вирусом Т-клеточного лейкоза человека (HTLV) относится к особой группе типа Е (3). Кроме того, экспериментально установлено, что в процессе созревания вириона при выходе его из клетки происходит расщепление крупных белков в вирионе, в то время как масса ревертазы составляет 80 тысяч дальтон.

Показано также, что в вирионе молекулы РНК связаны друг с другом с помощью матриксного (р15) и нуклеокапсидного (р12) белков через область, близкую к месту связывания праймера(4), т.е. эти РНК ассоциированы своими 3'-концами.

Учитывая новые экспериментальные данные о репликации, мы предлагаем для рассмотрения новую схему репродукции вируса лейкоза крупного рогатого скота. После проникновения вируса в клетку и освобождения его генома на одной из нитей РНК со свободного 5'-конца начинается трансляция вирусспецифических белков. Доказано (4), что продуктом трансляции геномной РНК является белок-предшественник Pr145gag-pol, из которого в процессе созревания образуются ферменты, необходимые для синтеза ДНК на матрице РНК. Синтез минус-цепи ДНК на матрице второй вирусной РНК, которая может оставаться связанной с первой молекулой в процессе трансляции, начинается с 3'-конца. Осуществляет этот процесс вновьсинтезированная ревертаза. После отделения РНК от минус-цепи ДНК на последней начинается синтез плюс-цепи ДНК. Образовавшаяся двуцепочечная ДНК в виде цепи или кольца проникает в ядро и встраивается в геном, при этом достраиваясь с концов идентичными длинными повторами нуклеотидов (LTRs) и превращаясь в провирусную форму. Если эта ДНК оказывается под активным регуляторным районом, она начинает активно транскрибироваться, т.е. начинается активная репродукция вируса лейкоза в данной клетке. Если же регуляторный район будет неактивным, провирус будет существовать в организме, не проявляя себя, т.е. не вызывая образование специфических антител. Однако, распространение его в организме уже началось даже после полного подавления репродукции его в конкретном очаге. Оно осуществляется путем митоза клеток с молчащим встроенным в геном провирусом – клональной экспансии.

При отсутствии механизма редактирования в процессе синтеза ДНК на матрице РНК появление ошибок, т.е. точечных замен нуклеотидов в провирусной ДНК, возрастает на несколько порядков по сравнению с синтезом хромосомной ДНК Если эти замены не влияют на вторичную структуру вирусных белков антигенов, то они будут узнаваемыми специфическими к ним антителами. Если же замена аминокислот в белке приведет к такому изменению, то результатом его может быть исчезновение эпитопа в антигене. В таком случае использование антител, специфических к данному антигену, может привести к ложноотрицательным результатом.

Особенностью ретровирусов является высокая вариабельность их геномов по сравнению с другими видами вирусов. За последние 10 лет выявлено 7 генотипов BLV(5), в республике Татарстан – 2 генотипа (6). В связи с этим возникает необходимость изучения эффективности существующих методов диагностики лейкоза с использованием антигенов тех или других генотипов. Гетерогенность генотипов вируса может быть связана со степенью накопления провируса в клетках при лимфоцитозной и безлимфоцитозной формах лейкоза. В первом случае провируса в клетках лимфоцитов много и синтез антител к нему идет активно, во втором – нет образования антител и, следовательно , серодиагностика лейкоза даст ложноотрицательные результаты.

Тот факт, что клетками-мишенями BLV являются В-лимфоциты с поверхностными IgM, навел нас на мысль о возможности образования иммунных комплексов - провирусная ДНК-IgM в процессе разрушения пораженной клетки. Такие комплексы нами были выявлены (7) а это свидетельствует о возможности третьего способа распространения вируса в клетке, кроме указанных выше, т.е. с помощью циркулирующих иммунных комплексов - провирусная ДНК-IgM, так как установлено, что и невключенная в геном провирусная ДНК обладает инфекционностью. Роль этого комплекса в патологии лейкоза не изучена.

Не следует забывать и то, что высокая вариабельность генома BLV – это одно из благоприятных условий для преодоления видовых барьеров данным вирусом, а также помнить и о других факторах риска заражения животных – ятрогенные мероприятия, кровососущие насекомые и др.

Учитывая все вышесказанное, можно сделать вывод о большой сложности полного выявления зараженных животных серологическими методами, необходимо комплексное исследование животных, т.е. параллельное применение молекулярно-генетических методов анализа.

Используя методы ПЦР, следует учитывать, что даже единичная замена нуклеотида в участке гена белка-референта приводит к ложноотрицательным результатам (8). Следовательно, для проведения анализа методом ПЦР необходимо одновременное использование нескольких праймеров и желательно как для генов, отличающихся консервативностью, так и для генов повышенной вариабельности (гены белков регуляторов репродукции вируса).

Заключение. М олекулярные механизмы репродукции вируса лейкоза полностью не расшифрованы.

Выявлены циркулирующие в крови инфицированных вирусом лейкоза животных иммунные комплексы – провирусная ДНК-IgM, в которых ДНК обладает инфекционностью.

Генотипированием в республике Татарстан выявлены 2 генотипа вируса лейкоза крупного рогатого скота.

ЛИТЕРАТУРА: 1.Wo D.,Murakami K.et al. In vivo transcription of bovine leukemia virus and bovine immunodeficiency-like virus// Virus Research – 2003 – v.7 –p.81. 2. Сергеев В.А., Орлянкин Б.Г. Структура и биология вирусов животных.// М. «Колос» - 1983 – с.36. 3. Maxieux R. Gessain A. New human retroviruses: HTLV-3 and HTLV-4// Med.Trop. (Mars)-2005-v.65 – p.525. 4. Gillet N., Florius A et al.// Retrovirology – 2007 - №4 – p.18. 5. Rodriguez S.M/, Golemba M.D. et al. Bovine leukemia virus can be classified into seven genotypes: evidence for the existence of the novel classes// Gen Virol – 2009 – v.90 – Pt.11 – p/ 2788-97. 6. Шаева А.Ю. Молекулярно генетический анализ вируса лейкоза крупного рогатого скота ( ВЛ КРС)// Уч. Записки КГАВМ – 2009 – т.196 – с.319-323. 7. Зиннатов Ф.Ф., Тюрикова Р.П., Камалов Б.В. Внеклеточная провирусная ДНК лейкоза крупного рогатого скота в патогенезе этой инфекции.// Мат-лы 1Y съезда Рос. Общ-ва биохимиков. Г.Новосибирск – 2008 г.8. Limansky A., Limanskaya O. Comparison of primer sets for detection of bovine leukemia virus by polymerase chain reaction.// Bull. Vet.Inst. in Putawy – 2002 – v.46 – p.27-36.

К ВОПРОСУ О СПЕЦИФИКЕ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И МЕТОДОВ ЕГО ВЫЯВЛЕНИЯ

Хазипов Н.З., Тюрикова Р.П.

Резюме

На основе последних экспериментальных данных рассматривается новая схема репликации вируса лейкоза КРС, приводятся данные о выявлении иммунного комплекса – провирусная ДНК-IgM в крови инфицированных BLV коров и результатах использования методов генотипирования лейкоза в хозяйствах республики Татарстан.

ABOUT SPECIFIC OF THE BOVIN LEUKEMIA VIRUS REPRODUCTION AND METHODS ITS DISCAVERY

Khazipov N.Z., Tjurikova R.P.