К вопросу о возбудителях альтернариоза подсолнечника

Введение. Род Alternaria Nees представлен более чем 250 разнообразными видами [1], многие из которых – космополиты, встречающиеся практически повсеместно. Они относятся к микроскопическим грибам, с которыми человек сталкивается наиболее часто. Некоторые виды относятся к оппортунистическим, то есть способным вызывать болезни человека и животных (аллергии, дерматиты, микотоксикозы). Эти грибы были выявлены на большом количестве разнородных субстратов, в том числе, и растительного происхождения. Часть видов – сапротрофы, но большинство – паразиты с некротрофным способом питания и различной специализацией и степенью паразитизма (от факультативных паразитов до факультативных сапро-трофов). Некоторые мелкоспоровые виды (например, A. tenuissima и комплекса A. alternata ) имеют большое количество растений-хозяев, хотя несколько родственных им видов специализированы очень узко, что связано со способностью синтезировать специфичные к хозяину токсины. Остальные же (не мелкоспоровые) виды преимущественно приурочены к одному или нескольким видам растений одного рода, реже нескольких родов, но одного семейства. Целый ряд видов

Alternaria вызывает вредоносные болезни сельскохозяйственных культур, в том числе, и подсолнечника.

Анализ публикаций, как отечественных, так и зарубежных авторов, по аль-тернариозу подсолнечника выявил множество противоречий и неясностей, несмотря на то, что было проведено большое количество исследований, касающихся симптоматики, вредоносности, экологических факторов, влияющих на развитие и распространение болезни, методов ее контроля и т.д. Основная проблема заключается в недостаточной изученности самого патогена. Видовой состав грибов рода Alternaria , заселяющих растения и семена подсолнечника, изучен мало.

До сих пор в ряде работ используются устаревшие определители и методы идентификации, присваиваются нелегитимные наименования видов Alternaria . Любой, из так называемых, мелкоспоровых видов (с конидиями размером до 60 мкм, образующими цепочки) могут обозначать как A. alternata, A. tenuis, A. helianthii или A. he-lianthi [2]. При этом, по определителю E. G. Simmons (2007), A. helianthi (или Alter-nariaster helianthi ) – узкоспециализированный вид с конидиями, по форме близкими к цилиндрической, без нитевидного апикального выроста, размером до 80–130(160) × 18–23(30) мкм [1; 3].

Именно A. helianthi (Hansford) Tubaki et Nishihara чаще всего упоминается в литературе как возбудитель темно-бурой (в некоторых источниках черной) пятнистости подсолнечника. В разные годы этот патоген относили к Helminthosporium и Embellisia, но по современной классификации он вынесен в отдельный род Alternariaster [1; 3]. A. helianthi встречается в большинстве регионов, возделывающих подсолнечник, и продолжает распространяться на новые территории. Так, патоген обнаружен впервые в штате Луизиана США только в 2009 г. [4], в Сингапуре – в 2010 г. [5]. Наибольший ущерб он наносит при сочетании высоких температур (+25…+30 °С) и влажности воздуха свыше 70 % [6; 7]. В Индии, Бразилии, Аргентине и ряде других стран с тропическим и субтропическим климатом альтернариоз – одна из острейших проблем при возделывании культуры. Потери урожая семян могут доходить до 60–90 %, их масличности и всхожести – до 32 % [8–13]. Столь высокая вредоносность обусловила интенсивное изучение A. he-lianthi в разных странах.

В то время как A. helianthi исследован достаточно широко, другие виды, встречающиеся на подсолнечнике, остаются малоизученными.

Первая работа с использованием современных систематических положений и методов идентификации, направленная на выявление видового состава Alternaria на подсолнечнике в регионах Российской Федерации, была выполнена Ф.Б. Ганнибалом (2011). Им проведена очень серьезная ревизия доступной информации по данной теме и сделано заключение, что в настоящее время, помимо космополитных полусапротрофных, систематиками и флористами описано не менее 11 видов Alternaria , ассоциированных с подсолнечником (по определителю E.G. Simmons, 2007). Были проанализированы образцы пораженных частей растений и семян подсолнечника из нескольких регионов России, в том числе и из Краснодарского края. В результате идентифицировано несколько видов с абсолютно разными экологическими свойствами (органотропной специализацией, патогенностью, токсигенностью, требованиями к освещенности и т.д.). Впервые в России был обнаружен специализированный к подсолнечнику вид A. helianthiinficiens E.G. Simmons, Walcz et R.G. Roberts [3].

Также A. helianthiinficiens выявлен в Венгрии и США [14], Сербии [15], Южной Корее [16], Хорватии [13]. Список таких стран будет, безусловно, пополняться, так как этот патоген способен инфицировать семена, а значит, быстрее сможет распространяться на новые тер- ритории [3; 13]. Информации о свойствах гриба мало. Проведенные немногочисленные исследования показали высокую патогенность и потенциальную вредоносность A. helianthiinficiens для подсолнечника [13]. Считают, что он может быть более патогенным для подсолнечника, чем A. helianthi [15], хотя инкубационный период продолжительнее (2–3 дня вместо 1–2 дней) [16].

Среди мелкоспоровых токсигенных видов, выделенных Ф.Б. Ганнибалом, преобладал A. tenuissima (Nees et T. Nees: Fr.) Wiltshire ; выделялись также A. alter-nata (Fr.) Keissl и A. arborescens E.G. Simmons. Многие образцы листьев и семян содержали грибы, отнесенные к комплексу A. infectoria E.G. Simmons , – преимущественно, нетоксигенные слабо патогенные виды [3].

Считается, что неспециализированные мелкоспоровые виды A. tenuissima, A. alternata – полупаразиты, обычно поражающие физиологически старые или поврежденные ткани. Но при определенных погодных условиях они способны вызывать массовое заражение и быть вредо-носносными на различных однолетних культурах (картофель, томат, рапс, подсолнечник и др.). В результате уменьшается фотосинтетическая поверхность листьев, плесневеют плоды и семена, урожай снижается и загрязняется микотоксинами и аллергенами [17]. Вместе с тем, иранскими учеными доказана способность A. alternata активно проникать в ткани здоровых растений и инфицировать их [18].

В последние годы прослеживается тенденция эволюционирования этих видов в сторону паразитизма. Об этом свидетельствует частота сообщений из разных стран об этих видах, как о новых возбудителях болезней культурных растений, например, на цитрусовых в Перу [19], привитых кактусах в Южной Корее [20], гранате в Израиле [21], на гербере, находящейся в одном семействе с подсолнечником, в Болгарии [22] и Иране

• [23], на яблоне и винограде в Краснодарском крае [24; 25].

О том, что A. alternata может поражать подсолнечник так же, как и A. helianthi , уменьшая количество семян в корзинке и их массу (на 16–65 и 15–79 % соответственно), сообщали греческие авторы Lagopodi и Thanassoulopoulos [26]. Однако и в этой работе название вида использовано как эпитет, обобщающий все мелкоспоровые виды Alternaria.

Таким образом, видовой состав представителей рода Alternaria и родственных ему таксонов на подсолнечнике во многих странах, в том числе, и в России, все еще неясен [3]. Ошибочность идентификации вида как объекта исследований может влечь за собой ошибочность самих исследований – их целей, используемых методов, результатов и выводов. Возможно, именно поэтому в разных публикациях представлены противоречащие данные по одним и тем же вопросам: вредоносности и экономической значимости альтер-нариоза и инфицированности семян подсолнечника Alternaria sp. [27–30], эффективности фунгицидов [31; 32] и поискам ресурсов генетической устойчивости [13; 33–35].

Эти активные микроорганизмы с высокой адаптационной способностью продолжают бесконтрольно размножаться и эволюционировать, осваивая новые ниши и субстраты, занимая места других патогенов, борьба с которыми успешна, увеличивать потенциал патогенности. Все это диктует необходимость всестороннего изучения грибов рода Alternaria и других темноокрашенных гифомицетов, ассоциированных с подсолнечником.

Цель данного исследования – определить видовой состав грибов рода Alternaria Nees. на растениях и семенах подсолнечника в некоторых регионах его возделывания в Российской Федерации.

Материалы и методы. В 2011 и 2012 гг. в период вегетации подсолнечника отбирали растения с симптомами альтернари-оза на полях в Краснодарском крае и

Ростовской области. Проводили фитоэкспертизу 70 партий семян разных гибридов и линий подсолнечника, собранных в 2010–2012 гг. в ряде районов Краснодарского края, Воронежской, Волгоградской и Ростовской областей.

Для выделения микобиоты пораженные фрагменты растений и семена (по 100 штук каждого образца) поверхностно стерилизовали, помещали на питательную среду в чашки Петри и инкубировали при 25 °С до появления конидиального спо-роношения или характерного мицелия грибов. Отсевали грибы рода A lternaria (и сходные с ними). Получали монокони-диальные изоляты, которые культивировали в пластиковых чашках Петри на картофельно-морковном агаре (КМА) при 25 °С под лампами дневного света (12-часовой фотопериод). Идентификацию видов A lternaria вели по определителю Simmons [1] и с помощью ключа, составленного Ганнибалом [3], начиная с 3-х суток по 10-е (и позже), посредством микроскопа, анализируя габитус споро-ношения (наличие или отсутствие цепочек спор, их длину и тип ветвления), размер и форму конидий.

Результаты и обсуждение. Из пораженных надземных органов растений подсолнечника за периоды вегетации 2010–2012 гг. получено 411 изолятов гриба. Из них специализированных крупноспоровых видов: A. helianthi – 274 и A. helianthiinficiens – 1; остальные – мелкоспоровые.

Получение чистых культур микро-мицетов осложнялось присутствием других грибов (A. tenuissima , комплексов видов A. infectoria (далее обозначаемого как ′A. infectoria′ ) и A. alternata , Verticilli-um sp., Fusarium sp., Penicillium sp., Bipolaris sp., Rhizopus sp. (на корзинках), а также бактерий.

• * точность идентификации подтверждена Ф.Б. Ганнибалом (ВИЗР, Санкт-Петербург)

A. helianthi (рис. 1) выделялся из разнообразных пятен на листьях, стеблях и корзинках подсолнечника. Из пятен округлых от желтых до коричневочерных с окаймлением или без (в дальнейшем пораженные участки обычно выпадали, оставляя округлые дыры) – на листьях (рис. 2 a ), а также на стеблях и корзинках (позже пятна могли сливаться, образуя сплошное черное пятно) (рис. 2 b ). Из пятен полосковидных от чернокоричневых до черных – на стеблях и корзинке (рис. 2 c ) и от светло- до темнокоричневых c язвами и разрывами тканей – на стеблях, корзинках, черешках и по жилкам листьев (рис. 2 d ). Несколько изо-лятов было получено с семядолей и с листьев растений подсолнечника в фазе 2–3 пар настоящих листьев.

Рисунок 1 – 14-дневные конидии

A. helianthi на питательной среде КМА

A. helianthiinficiens (рис. 3) был изолирован из коричнево-черного округлого пятна (1,7 см в диаметре) на листе подсолнечника (фаза налива семян) в образце из Краснодарского края (г. Краснодар). До этого вид был обнаружен Ф.Б. Ганнибалом (в России впервые) в 2006 г. на листьях подсолнечника в Краснодарском крае (2 изолята) и в 2008 г. – в семенах из Алтайского края (1 изолят) [3].

а

b

c

d

a

b

Рисунок 3 – A. helianthiinficiens:

10-дневное спороношение на питательной среде КМА (a ); конидии со стеблей искусственно зараженных растений подсолнечника ( b )

d

Рисунок 2 — Поражение листьев ( a, b ,d), стеблей ( b, c, d) и корзинок ( b ) подсолнечника патогенном Alternariaster helianthi

Из угловатых желтых, темнеющих до коричнево-бурых, коричнево-черных пятен разного размера на листьях и корзинках, обычно в местах повреждений насекомыми или на растениях, пораженных другими патогенами, самостоятельно или с другими грибами и бактериями вы- делялись мелкоспоровые виды (рис. 4). Преобладал A. tenuissima; A. alternata и 'A. infectoria’встречались реже.

a

b

Рисунок 4 – Поражение листьев ( a ) и корзинки ( b ) подсолнечника мелкоспоровыми видами Alternaria

В результате анализа 70 партий семян подсолнечника урожаев 2010–2012 гг. получено 912 моноконидиальных изолятов грибов рода Alternaria и других темно-окрашенных гифомицетов. A. tenuissima присутствовал в каждом образце и доминировал в большинстве из них. Стабильно выявлялись ′ A. infectoria′ и A. alternata. Несколько изолятов отнесено к A.

arborescens и к другим родам альтер-нариоидных гифомицетов – Stemphylium и Ulocladium . В партиях семян, собранных в 2010 и 2011 гг., встречались грибы, которые по морфологическим признакам могли бы быть идентифицированы как A. roseogrisea Roberts – вид, обнаруженный в семянках подсолнечника и описанный Робертсом несколько лет назад [36]. Упоминаний о его нахождении в публикациях других авторов не нашлось. Такие изоля-ты были причислены к комплексу A. infectoria.

В семенах урожая 2012 г. из Славянского и Белоглинского районов Краснодарского края обнаружено по одному изоляту A. helianthi.

В таблице показаны результаты экспертизы нескольких образцов семян подсолнечника из Воронежской и Волгоградской областей и нескольких районов Краснодарского края. Инфицированность их грибами рода Alternaria и родственными ему видами составляла от 4 до 58 %.

В образцах из Краснодарского края в 2010 г. обнаружено по одному изоляту A. protenta (специализированный крупноспоровый вид) и Bipolaris australiensis (M.B. Ellis) Tsuda & Ueyama ^1* (телеомор-фа Cochiobolus australiensis (Tsuda & Ueyama) Alcorn) (рис. 5) [37–39]. Последний микромицет из семян подсолнечника в России выделен впервые, до этого был обнаружен на них в Индии [40; 41]. Этот вид темноокрашенных гифомицетов известен в медицинской микологии как возбудитель аллергических хронических синуситов, дерматитов и ряда других заболеваний у человека [42–45]. Вызывает пятнистости листьев и стеблей растений [45–47].

** - вид идентифицирован Ф.Б. Ганнибалом

(ВИЗР, Санкт-Петербург)

Таблица

Инфицированность партий семян подсолнечника грибами рода Alternaria и другими темноокрашенными гифомицетами

ЦЭБ ВНИИМК, 2010–2012 гг.

№	Регион/район сбора	Генотип хозяина	Год сбора урожая	Инфицирован-ность образца1, %	Изоляты2, шт.
					всего	A. tenuissima	Комплекс A. infectoria	A. alternata	другие
1	Воронежская область	Авангард	2010	18	19	14	2	1	Stemphylium sp. – 1, Alternaria sp.3– 1
2	Волгоградская область	Кубанский 176 × СГ3	2011	52	40	19	14; в т.ч. A. roseo-grisea4 – 1	5	A. arborescens-2
3		Донской 22		50	31	21	6	3	Ulocladium sp. – 1
4		Сигнал		18	18	7	6	2	Alternaria sp. – 3
5		Юпитер	2012	31	21	15	1	5	–
6		Альтаир		26	28	18	1	6	Alternaria sp. – 3
Краснодарский край
7	Кореновский	Кубанский 930	2010	15	15	10	3	1	B. australiensis – 1
8			2011	31	26	14	10; в т.ч. A. roseo-grisea – 3	1	Alternaria sp. – 1, Stemphylium sp. – 1
9		Кубанский 86		41	32	14	9	8	Alternaria sp. – 1
10		ВК 678 А		27	18	5	7; в т.ч. A. roseo-grisea – 1	6	–
11		ВД 541А	2012	4	6	4	2	–	–
12		ВК 653		16	14	9	1	4	–
13	г. Краснодар	ВК 678 А	2011	46	32	13	13	4	A. arborescens – 2
14				58	40	22	12	6	-
15		ВК 580		58	48	30	12; в т.ч. A. roseo-grisea – 1	3	Alternaria sp.– 1, Stemphylium sp. – 1, Ulocladium sp. – 1
16	Калининский	Меркурий	2010	37	34	24	6; в т.ч. A. roseo-grisea – 1	-	A. protenta- 1, A. arborescens – 1
17	Славянский	ВК 680	2012	22	16	12	2	1	A. helianthi –1
18	Белоглинский	неизвестен		19	19	11	3	2	A. helianthi – 1, Alternaria sp. – 2
19	Крыловской	неизвестен		35	30	23	2	3	Alternaria sp. -1, Stemphylium sp. – 1

1– инфицированность образца темноокрашенными гифомицетами, включая Alternaria sp.; 2– моноконидиальные изоляты; 3– неидентифицируемые по морфологи- ческим признакам изоляты; 4– изоляты, по морфологии идентичные A. roseogrisea, отнесены к комплексу видов A. infectoria

Рисунок 5 – Bipolaris australiensis: 10-дневное спороношение (a ) и конидии

( b ) на питательной среде КМА

При выделении грибов из семян подсолнечника в чистую культуру отмечены случаи ассоциаций разных видов Alternaria друг с другом и иной микобиотой – преимущественно с Rhizopus sp., Fusarium sp., Penicillium sp., Stemphylium sp. и с бактериями.

В ходе данного исследования не удалось определить вид некоторых изолятов по морфологическим признакам. Для их идентификации необходимо применение молекулярно-генетических методов. Прогрессирующее в мире использование данных методов в исследованиях молекулярной филогении Alternaria Nees может значительно изменить в будущем систематику рода, особенно мелкоспоровых видов.

В совокупности, среди выделенных из семян подсолнечника темноокрашенных гифомицетов преобладали мелкоспоровые виды Alternaria : A. tenuissima – 53,6 %, комплекса A. infectoria – 24,5 и A. alternata – 12,9 % (рис. 6).

Полученные в ходе работы данные во многом согласуются с представленными Ганнибалом [3] и дополняют их обнаружением в семенах подсолнечника B. aust-raliensis и A. helianthi. Видовой состав грибов рода Alternaria на подсолнечнике разнороден: значительны различия между видами по степени специализации, токси-генности, патогенности, вредоносности, чувствительности к фунгицидам и многим другим характеристикам. Это обязывает начинать любые исследования, связанные с альтернариозом подсолнечника, с видовой идентификации патогена.

Рисунок 6 – Соотношение видов Alternaria и других темноокрашенных гифомицетов, выделенных с семян подсолнечника (сбор урожая 2010–2012 гг.): другие виды – A. arborescen s, A. protenta, Stemphylium sp., Ulocladium sp. и Bipolaris australiensis, а также неидентифициро-ванные изоляты Alternaria sp.

Таким образом, в настоящее время на подсолнечнике в Краснодарском крае, Волгоградской, Воронежской и Ростовской областях встречаются различающиеся по экологическим особенностям виды Alternaria . Из них специализированные крупноспоровые – A. helianthi, A. helianthiinficiens и A. protenta; мелкоспоровые неспециализированные – A. tenuissima , A. alt e rnata, A. arborescens и комплекс A. infectoria; родственные им Stem-phylium sp. и Ulocladium sp. Впервые в России из семян подсолнечника выделен B. australiensis.

Авторы благодарят Ф.Б. Ганнибала за консультации и помощь при идентификации отдельных видов.