К вопросу серологической диагностики туберкулеза крупного рогатого скота

Эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота во многих странах остается напряженной (Данко, 2009; Michel, Müller, van Helden, 2010). Связано это с повышением лекарственной устойчивости микобактерий; их способностью передаваться через животных других видов, являющихся носителями возбудителя туберкулеза; с изменчивостью патогенных свойств возбудителя, и другими факторами. Туберкулез продолжает распространяться во многих странах, а также стал проявляться в тех регионах, которые долгое время считались благополучными по этому заболеванию не только у животных, но и у человека (Delaune, Janvier, Rapp et al., 2012; Goodchild, Watkins, Sayers et al., 2012; Di Marco, Mazzone, Capucchio et al., 2012). При осуществлении эпизоотологического контроля определяют степень риска возникновения и распространения инфекционной болезни, адекватность проводимых противоэпизоотических мероприятий с учетом факторов эпизоотологического риска (элементы окружающей среды, условия содержания и обитания и т.п., которые существенно увеличивают риск возникновения заболеваемости или непосредственно обусловливают заболевание), а также группы риска (популяции или субпопуляции животных, наиболее восприимчивых к конкретной рассматриваемой инфекционной патологии) (Пашкина, Чвала, Пашкин и др., 2011).

Микобактерии бычьего вида, Mycobacterium bovis , вызывают заболевание у крупного рогатого скота, свиней, верблюдов, коз, овец, оленей, кошек, собак, лисиц, барсуков и многих других животных, а также у человека. Своевременная диагностика и изолирование больных животных являются главными элементами борьбы с этим заболеванием. Внутрикожная туберкулиновая проба и γ-интерферон тест играют ключевую роль в диагностике и контроле туберкулеза крупного рогатого скота. Однако на сегодняшний день они малоэффективны, что обусловлено недостаточной чувствительностью и специфичностью этих диагностических методов.

Исследования проводились в компании «Enfer Scientific», г. Нэйс, Ирландия. Нами был изучен ряд антигенов, синтезируемых и образуемых при разрушении бактерий M.bovis , для выявления их антителообразующих свойств у инфицированного крупного рогатого скота. Наименования антигенов, использованных в данной работе, представлены в таблице 1.

1. Антигены и их принадлежность к генетическому локусу M.bovis .

Пробы сывороток крови от здоровых животных из хозяйств, благополучных по туберкулезу в течение не менее 5 лет, были предоставлены Департаментом сельского хозяйства Ирландии. Сыворотки крови от зараженных животных были получены на санбойне, при этом брались пробы только от коров, у которых инфицирование M.bovis было подтверждено постмортальными гистопатологическими и/или бактериологическими исследованиями.

Методом мультиплексного хемилюминесцентного иммуноанализа выявляли уровень антител к указанным выше антигенам описанным ранее способом (Whelan, Shuralev, O'Keeffe, et al., 2008). Микропланшеты иммобилизировали антигенами в мультиплекс варианте на специальном оборудовании – AD3400, BioDot. В лунки вносили исследуемые сыворотки крови в разведении 1:250 в буферном растворе для проб в объеме 50 мкл, с последующей инкубацией в течение 90 минут. После промывки планшет в лунки вносили поликнональные кроличьи антитела против бычьего иммуноглобулина, меченные пероксидазой хрена, в разведении 1:3000 объемом 50 мкл, с последующей инкубацией в течение 30 минут. После промывки планшет вносили хемилюминесцентный субстрат в объеме 40 мкл и проводили читку реакции в специальном ридере Enferplex. Данные были получены, используя программное обеспечение Enferplex, которые выражались в относительных световых единицах (RLU). Статистическая обработка результатов проводилась с установлением критерия Стъюдента, используя программное обеспечение SigmaStat (Systat, San Jose, США).

Исследования проб сывороток крови от 522 животных, с подтвержденным гистопатологическими и/или бактериологическими исследованиями положительным диагнозом на туберкулез, показали, что микобактериальные антигены вызывают образование антител у крупного рогатого скота с различной интенсивностью. Наиболее высокий уровень антител обнаружен к ESAT-6, CFP-10, Rv1573c, MPB70, MPB83, α -Crystalin_2, PPE68, PE35. Сигналы к этим антигенам выявлялись на уровне до 50 000 RLU и выше. Несколько слабее антителообразование отмечено к антигенам: Rv3616c, Rv3879c, Rv1572c, Rv2626, Rv1580c, Rv1926c, при этом сигналы улавливались на уровне 5 000 – 40 000 RLU. Однако уровень антител не является основным показателем эффективности использования антигена в диагностических целях. Антителообразование на организменном уровне при инфицировании животного M.bovis не имеет прямой зависимости с популяционным уровнем. Было обнаружено, что наиболее чувствительными антигенами являются ESAT-6, CFP-10, MPB70 и MPB83 – 40,6%, 82,6%, 79,3% и 78,5% соответственно. Необходимо отметить, что антигены с низкой чувствительностью также следует использовать в диагностических целях, так как к ним могут формироваться антитела в организме инфицированного животного, у которого отсутствуют или находятся в малых концентрациях антитела к высокочувствительным антигенам.

Специфичность антигенов также варьировала от 42,4% до 99,1%, что было установлено при исследовании 1489 неинфицированных животных.

При этом у высокочувствительных антигенов ESAT-6, CFP-10, MPB70 и MPB83 она составила 86,6%, 69,7%, 82,3% и 99,1% соответственно.

Проведенный нами анализ результатов показал, что при комбинированном подходе учета уровня антител к различным антигенам позволяет увеличить чувствительность и специфичность метода, если принимать во внимание реакцию не к одному отдельному антигену, а комплексно оценивать результаты. Этот подход позволил увеличить чувствительность и специфичность метода до 93,1% и 98,4% соответственно. Таким образом, исследованиями установлено, что серологический метод диагностики бычьего туберкулеза должен основываться на комплексном мультиплексном подходе, с использованием нескольких антигенов. Данный метод вполне может дополнять используемый в настоящий момент метод туберкулинизации для выявления инфицированных животных, их изолирования с целью борьбы с распространением туберкулеза крупного рогатого скота.

ЛИТЕРАТУРА: 1.Данко Ю.Ю. Туберкулез пятнистых уссурийских оленей в условиях Северо-Запада России : автореф. дисс. канд. ветер. наук : 16.00.03 / Данко Юрий Юрьевич. – Санкт-Петербург. – 2009. – 20 с. 2.Пашкина Ю.В., Чвала А.В., Пашкин А.В., Демидова Т.Н. Методологический подход к осуществлению эпизоотологического надзора // Учен. зап. / Казанская гос. акад. ветер. мед. им. Н.Э. Баумана.- 2011.-Т.208.- С.76-81. 3.Delaune D., Janvier F., Rapp C., Gerome P., Mechai F., Fabre M., Soler C., Merens A. Update on Mycobacterium bovis infections in France: 4 cases reports. // Ann. Biol. Clin. (Paris).- 2012.- Vol. 70(2).- P.231236. 4.Di Marco V., Mazzone P., Capucchio M.T., Boniotti M.B., Aronica V., Russo M., Fiasconaro M., Cifani N., Corneli S., Biagetti M., Pacciarini M.L., Cagiola M., Pasquali P., Marianelli C. Epidemiological Significance of the Domestic Black Pig (Sus scrofa) in Maintenance of Bovine Tuberculosis in Sicily. // J. Clin. Microbiol.- 2012.- Vol. 50(4).- P.1209-1218. 5.Goodchild A.V., Watkins G.H., Sayers A.R., Jones J.R., Clifton-Hadley R.S. Geographical association between the genotype of bovine tuberculosis in found dead badgers and in cattle herds. // Vet. Rec.- 2012.- Vol. 170(10).- P.259. 6.Michel A.L., Müller B., van Helden P.D. Mycobacterium bovis at the animal-human interface: a problem, or not? // Vet. Microbiol.- 2010.- Vol. 140 (3-4).- P.371381. 7.Whelan C., Shuralev E., O'Keeffe G., Hyland P., Kwok H.F., Snoddy P., O'Brien A., Connolly M., Quinn P., Groll M., Watterson T., Call S., Kenny K., Duignan A., Hamilton M.J., Buddle B.M., Johnston J.A., Davis W.C., Olwill S.A., Clarke J. Multiplex immunoassay for serological diagnosis of Mycobacterium bovis infection in cattle. // Clin Vaccine Immunol. – 2008.- Vol. 15(12).- P.1834-1838.

К ВОПРОСУ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Шуралев Э.А., Ндайишимийе Э.В., Мукминов М.Н.

Резюме

Исследования по разработке эффективного диагностического теста на туберкулез крупного рогатого скота, показали, что чувствительность и специфичность теста могут быть повышены за счет использования двух и более антигенов. В работе показаны результаты изучения ряда микоактериальных антигенов.

SEROLOGICAL DIAGNOSIS OF BOVINE TUBERCULOSIS CHALLENGE

Shuralev E.A., Ndayishimiye E.W., Mukminov M.N.