Кардиопротекторные свойства агонистов каннабиноидных рецепторов

В 1999 г. американскими фармакологами [24, 38] были получены данные о существовании третьего каннабиноидного рецептора. Рецептор присутствовал в эндотелио-цитах и проявлял высокое сродство к эндогенному СВ-агонисту анандамиду и метанандамиду (синтетический аналог анандамида), но не взаимодействовал с другими

СВ-агонистами [38]. Рецептор ингибировался селективным антагонистом СВ1-рецепторов SR141716A [38]. Авторы открытия назвали рецептор “SR141716A-чувстви-тельным эндотелиальным анандамидовым рецептором” [38]. В 2003 г. было доказано, что названный рецептор относится к G-белок-сопряженным рецепторам [11, 32]. Он пока не клонирован. В 2000 г. итальянские физиологи [16], выполняя эксперименты на трансгенных мышах с делецией гена СВ1-рецептора, получили данные о существовании G-белок-сопряженного анандамидового рецептора в головном мозге. В отличие от эндотелиального рецептора, новый анандамидовый рецептор был не чувствителен к СВ1- и СВ2-антагонистам [16]. Он также пока не клонирован.

Таким образом, в настоящее время доказано существование по меньшей мере четырех каннабиноидных рецепторов: СВ1-, СВ2-, GPR55-рецепторы и эндотелиальный анандамидовый рецептор.

Эндогенные агонисты каннабиноидных рецепторов. В 1992 г. международный коллектив исследователей [14] сообщил об открытии первого эндогенного каннабиноида – анандамида (арахидонилэтаноламид). Затем установили [22], что эндоканнабиноидом является 2-арахи-доноилглицерол. В 2001 г. был обнаружен эндоканнаби-ноид – ноладин-эфир [22]. В 2004 г. идентифицирован еще один эндоканнабиноид – олеамид [27].

Кардиопротекторные эффекты агонистов каннабиноидных рецепторов. Основными проявлениями ишемического и реперфузионного повреждения сердца являются: некроз, апоптоз кардиомиоцитов, сократительная дисфункция, аритмии, эндотелиальная дисфункция [1, 6, 7, 33]. Установлено, что каннабиноиды способны повышать устойчивость сердца к действию ишемии и реперфузии [2–4, 8, 13, 28, 29]. Инфаркт-лимитирующий эффект каннабиноидов проявляется как in vivo [2, 8], так и in vitro [3, 4, 28, 29], поэтому исследователи полагают, что ключевую роль в реализации кардиопротекторного действия каннабиноидов играют процессы, происходящие на уровне сердца [3, 4, 28, 29, 37]. В 2002 г. мы обнаружили, что агонист СВ1- и СВ2-рецепторов HU-210 уменьшает соотношение зона инфаркта/область риска (ЗИ/ОР) после 45-минутной коронароокклюзии и 2-часовой реперфузии [2, 8]. Областью риска принято назвать зону ишемии (зона гипоперфузии), которая всегда больше зоны некроза. Позднее нами было показано, что ин-фаркт-лимитирующий эффект HU-210 in vivo не проявляется в условиях блокады СВ1-рецепторов и сохраняется после блокады СВ2-рецепторов [3]. Добавление HU-210 в перфузат изолированного сердца перед моделированием тотальной ишемии (45 мин) и реперфузии (30 мин) обеспечивает снижение выброса креатинфосфокиназы в перфузионный раствор, оттекающий от сердца [3]. Согласно нашим данным [3], кардиопротекторный эффект HU-210 является следствием активации протеинкиназы С. Представленные факты свидетельствуют о том, что HU-210 повышает толерантность кардиомиоцитов к действию ишемии-реперфузии за счет активации СВ1-рецеп-торов и повышения активности протеинкиназы С.

Эндогенные каннабиноиды также способны повышать устойчивость сердца к ишемии-реперфузии. Физиологи из Канады подвергали крыс тепловому шоку (heat shock stress) [25], через 24 ч у крыс изолировали сердца, на которых моделировали 30-минутную коронароокклюзию и 2-часовую реперфузию. Тепловой шок обеспечивал уменьшение соотношения ЗИ/ОР в 2,5 раз. Инфаркт-ли-митирующий эффект сохранялся при добавлении в перфузат СВ1-антагониста SR141716, но исчезал после блокады СВ2-рецепторов с помощью SR144528 [25]. Карди-опротекторный эффект шока не проявлялся после добавления в перфузионный раствор ингибитора NO-синтазы L-NAME (NG-Nitro-L-arginine methyl ester) [25]. Эти данные говорят о том, что инфаркт-лимитирующий эффект шока связан с активацией СВ2-рецепторов эндогенными каннабиноидами, которые, по-видимому, активируют NO-синтазу. Эти данные согласуются с результатами исследований D. Harris и соавт. [23], которые обнаружили, что сосудорасширяющий эффект анандамида не проявляется в условиях блокады NO-синтазы с помощью L-NAME. В 2001 г. физиологи из Канады [26] показали, что эндогенные каннабиноиды участвуют в кардиопротекторном эффекте липополисахарида (ЛПС). Крысам вводили ЛПС, через 24 ч у них извлекали сердце и перфузировали его по методу Лангендорфа. Ишемию моделировали, снижая коронарный проток до 0,6 мл/мин, реперфузия продолжалась 60 мин [26]. Блокада СВ2-рецепторов с помощью SR144528 устраняла инфаркт-лимитирующий эффект ЛПС, также действовал ингибитор NO-синтазы NG-nitro-L-arginine [26]. Антагонист СВ1-рецепторов SR 141716 не влиял на кардиопротекторный эффект ЛПС [26]. Как известно, одним из проявлений ишемического и реперфузионного повреждения сердца является эндотелиальная дисфункция [33]. В 2003 г. J.F. Bouchard и соавт. [9] обнаружили, что ишемическое прекондиционирование предупреждает нарушение эндотелий-зависимой вазодилатации, вызванное ишемией и реперфузией изолированного сердца. Прекондиционирование воспроизводили с помощью 5-минутной ишемии за 5 мин до глобальной ишемии изолированного сердца. Вазопротекторный эффект прекондиционирования не проявлялся в условиях блокады как СВ1-рецеепторов, так и после ингибирования СВ2-рецепторов [9]. Эндогенные каннабиноиды паль-митоилэтаноламид и 2-арахидонилглицерол (2-АГ) имитировали вазопротекторное действие прекондиционирования [9]. В 2011 г. фармакологи из Мадрида опубликовали результаты своих экспериментов на изолированном перфузируемом сердце крысы [20]. Перед изоляцией сердца животным внутрибрюшинно вводили агонист СВ1-и СВ2-рецепторов WIN 55,212-2 (1 мг/кг), in vitro моделировали глобальную ишемию (45 мин) и реперфузию (60 мин). Оказалось, что во время реперфузии каннабиноид не влияет на давление, развиваемое левым желудочком, и на конечное диастолическое давление, но существенно снижает сопротивление коронарных артерий, что авторы расценивают как вазопротекторный эффект [20]. Названный протекторный эффект сохранялся после блокады СВ1-рецепторов и исчезал после ингибирования СВ2-рецепторов [20]. Принято считать, что повышенное сопротивление коронарных артерий в реперфузионном периоде является следствием эндотелиальной дисфункции [33]. Представленные факты говорят о том, что эндогенные и экзогенные каннабиноиды за счет активации СВ2-рецепторов предупреждают повреждение эндотелия коронарных сосудов, вызванное ишемией-реперфузией изолированного сердца.

В 1996 г. B.C. Gho и соавт. обнаружили [19], что предварительная 15-минутная окклюзия брыжеечной артерии повышает устойчивость сердца к действию 60-минутной ишемии и последующей реперфузии, что характеризуется уменьшением соотношения ЗИ/ОР. Пятнадцатиминутная ишемия левой почки также способствовала уменьшению индекса ЗИ/ОР при коронароокклюзии и реперфузии [19]. Этот кардиопротекторный феномен в англоязычной литературе получил название “remote preconditioning” или “preconditioning at a distance”, что можно перевести как “дистантное прекондиционирование” [5, 6]. В 2008 г. было показано [21], что блокада СВ2-рецепторов устраняла кардиопротекторный и анти-аритмический эффект транзиторной ишемии тонкой кишки у крыс. Блокада СВ1-рецепторов не повлияла на защитный эффект прекондиционирования [21]. Эти данные указывают, что эндоканнабиноиды участвуют в ин-фаркт-лимитирующем эффекте дистантного прекондиционирования.

В 2009 г. французские физиологи [13] опубликовали результаты своих экспериментов на трансгенных мышах с делецией гена СВ2-рецептора (СВ2-/-), в качестве контроля использовали обычных мышей. У мышей вызывали 1-часовую коронароокклюзию, а после 24-часовой реперфузии проводили реокклюзию с последующей оценкой соотношения ЗИ/ОР. Фармакологические агенты вводили за 5 мин до реперфузии. В группе контроля индекс ЗИ/ОР составлял 34%, а в группе СВ2-/- – 45%. Инъекция селективного СВ2-агониста JWH133 в дозе 3 мг/кг обеспечивала уменьшение соотношения ЗИ/ОР до 24% у обычных мышей и не влияла на этот показатель у трансгенных особей [13]. Мы обнаружили, что агонист СВ1- и СВ2-рецепторов HU-210 при внутривенном введении крысам с коронароокклюзией за 5 мин до реперфузии способствует уменьшению соотношения ЗИ/3Р [6]. Представленные данные говорят о том, что эндоканна-биноиды играют важную роль в регуляции устойчивости кардиомиоцитов к действию ишемии-реперфузии. Кроме того, наши данные и данные французских коллег свидетельствуют о том, что активация СВ-рецепторов может имитировать феномен посткондиционирования, то есть предупреждать появление реперфузионных повреждений кардиомиоцитов после того, как ишемическое повреждение клеток сердца уже произошло [5].

В 2001 г. J.A. Wagner и соавт. [39] установили, что гипотензия при коронароокклюзии и реперфузии связана с активацией СВ1-рецепторов. Вместе с тем выживаемость контрольных крыс с экспериментальным инфарктом через 2 ч после коронароокклюзии составляла 70%, а в группе животных, получавших антагонист СВ1-рецепторов SR141716A, гибель составила 36% (p<0,05) [39]. Данный факт свидетельствует о том, что эндогенные агонисты СВ1-рецепторов снижают артериальное давление при коронароокклюзии, но в то же время увеличивают выживаемость животных в условиях экспериментального инфаркта миокарда.

В 2005 г. N.J. Underdown и соавт. [37], выполняя эксперименты на изолированном перфузируемом сердце крысы, моделировали 30-минутную глобальную ишемию и 60-минутную реперфузию. Они обнаружили, что анан-дамид и метанандамид уменьшают соотношение ЗИ/ОР в 2,5 раза, тогда как агонист СВ1- и СВ2-рецепторов HU-210 (1 мкМ) не оказывал подобного эффекта. Авторам не удалось выявить инфаркт-лимитирующий эффект у селективного СВ1-агониста ACPA и у селективного СВ2-аго-ниста JWH-133 [37]. Перфузию СВ-агонистами начинали за 5 мин до ишемии и продолжали в течение всего реперфузионного периода. Инфаркт-лимитирующий эффект анандамида не проявлялся в условиях блокады СВ1-и СВ2-рецепторов. Представленные факты позволили авторам работы сделать вывод, что кардиопротекторный эффект анандамида связан с активацией каннабиноидного рецептора, отличного от СВ1- и СВ2-рецепторов, поскольку агонисты этих рецепторов не влияют на устойчивость миокарда к ишемии-реперфузии [37]. Работа британских физиологов противоречит нашим данным [3, 4], поскольку нам удалось воспроизвести кардиопротек-торный эффект HU-210 в концентрации 0,1 мкМ, а британским коллегам этого добиться не удалось, хотя они использовали HU-210 в 10 раз большей концентрации. По нашему мнению, решающую роль сыграл протокол эксперимента. Физиологи из Великобритании добавляли HU-210 в перфузат за 5 мин до ишемии и продолжали перфузию с HU-210 в течение всего реперфузионного периода [37]. Мы же имитировали феномен прекондиционирования, то есть осуществляли перфузию с HU-210 только в течение 10 мин и прекращали перфузию с препаратом за 10 мин до ишемии [3, 4].

В 2004 г. итальянские физиологи [15] опубликовали результаты своих экспериментов, выполненных на мышах с коронароокклюзией и реперфузией. Оказалось, что инъекция агониста СВ1- и СВ2-рецепторов WIN 55,212-2 способствует уменьшению соотношения ЗИ/ОР на 30%. Этот эффект сохранялся в условиях селективной блокады СВ1-рецепторов, но исчезал после применения СВ2-антагониста АМ630. Кроме того, было установлено, что инъекция одного АМ630 способствовала увеличению соотношения ЗИ/ОР [15]. Селективный ингибитор СВ1-ре-цепторов АМ251 не влиял на индекс ЗИ/ОР. Инфаркт-лимитирующий эффект WIN 55,212-2 сопровождался снижением активности в ткани сердца миелопероксидазы [15]. Последняя, как известно (Jordan J.E. et al., 1999), является индикатором аккумуляции в миокарде нейтрофилов, которые усиливают ишемическое и реперфузионное повреждение сердца. Эти факты говорят о том, что активация СВ2-рецепторов экзогенными и эндогенными каннабиноидами способствует повышению толерантности миокарда к действию ишемии-реперфузии за счет уменьшения аккумуляции в миокарде нейтрофилов.

В 2006 г. группа проф. Z. Vogel [36] обнаружила, что каннабиноид ∆9-ТГК способен повышать толерантность изолированных неонатальных кардиомиоцитов крысят к действию гипоксии. Гипоксию моделировали, помещая кардиомиоциты на 60 мин в среду с аргоном без глюкозы [36]. За 24 ч до воспроизведения гипоксии кардиомиоциты инкубировали в присутствии ∆9-ТГК. Гипоксия вы- зывала утечку из кардиомиоцитов лактатдегидрогеназы (ЛДГ), что свидетельствует о некрозе кардиомиоцитов. Каннабиноид ∆9-ТГК снижал выброс ЛДГ. Если в среду инкубации за 1 ч до ∆9-ТГК добавляли СВ2-антагонист SR144528, то цитопротекторный эффект не наблюдался, также действовал ингибитор NO-синтазы L-NAME [36]. Селективный СВ1-антагонист SR141716 не влиял на ци-топротекторный эффект ∆9-ТГК. Кроме того, выяснилось, что ∆9-ТГК в 3 раза увеличивал продукцию радикала оксида азота (NO·). Этот эффект устранял SR144528, но не SR141716. С помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени по уровню мРНК оценивали экспрессию каннабиноидных рецепторов в неонатальных кардиомиоцитах. Оказалось, что они экспрессируют только СВ2-рецептор [36]. ∆9-Тетрагидроканнабинол в 4 раза увеличивал количество индуцибельной NO-синтазы. Представленные данные свидетельствуют, что использованный авторами каннабиноид имитирует феномен позднего прекондиционирования за счет активации СВ2-рецепто-ров и повышения продукции NO·индуцибельной NO-синтазой. Поздним прекондиционированием принято называть повышение толерантности кардиомиоцитов к действию длительной ишемии-реперфузии через 24 ч после воздействия кратковременной ишемии-реперфузии [6].

Казалось бы, эти данные противоречат результатам наших исследований [3], которые свидетельствуют о том, что инфаркт-лимитирующий эффект HU-210 связан с активацией СВ1-рецепторов, которые, по данным израильских физиологов, отсутствуют в кардиомиоцитах [36]. На наш взгляд, все дело в возрасте особей. Как показали S.M. Brown и соавт. [10], мРНК СВ2-рецептора отсутствует в миокарде взрослых крыс. Согласно данным и S. Galiegue соавт. [18], в миокарде человека отсутствует мРНК СВ1-рецептора. В 2003 г. с помощью иммуноблотинга J.A. Wagner и соавт. [40] обнаружили в миокарде взрослых крыс СВ1-рецептор, а 2 года спустя они подтвердили существование этого рецептора в сердце крыс иммуногистохимическим методом [41]. Каннабиноидный СВ2-ре-цептор в миокарде взрослых особей им обнаружить не удалось [41]. В то же время, согласно данным канадских исследователей, в сердце взрослых крыс присутствует мРНК и белки СВ1- и СВ2-рецептора [29]. Каннабиноидный СВ1-рецептор экспрессируется преимущественно в эндотелиоцитах артериол и капилляров, а СВ2-рецептор удается обнаружить в кардиомиоцитах и эндотелиоци-тах крупных артерий [29]. Следовательно, литературные данные о наличии субтипов СВ-рецепторов в миокарде носят противоречивый характер, поэтому представляется уместным предположить, что кардиопротекторный эффект каннабиноидов у взрослых особей может быть связан с оккупацией как СВ1-, так и СВ2-рецепторов. Канадские физиологи [29] на изолированном перфузируемом сердце крысы воспроизводили 90-минутную ишемию низкого протока, снижая коронарный проток до 0,6 мл/мин, после чего следовала 30-минутная реперфузия. Фармакологические агенты добавляли в перфузат за 5 мин до ишемии, продолжительность перфузии с препаратами продолжалась на протяжении всего периода ишемии и заканчивалась в момент начала реперфузии, то есть общая продолжительность перфузии с фармакологичес- кими агентами составляла 95 мин [28]. Селективный агонист СВ1-рецепторов arachidonyl-2-chloroethylamide (ACEA, 50 нМ) и селективный агонист СВ2-рецепторов JWH015 (50 нМ) уменьшали соотношение ЗИ/ОР [28, 29]. Инфаркт-лимитирующий эффект ACEA не проявлялся в условиях блокады NO-синтазы с помощью NG-nitro-L-arginine, кардиопротекторный эффект JWH015 в этих условиях сохранялся [29, 36].

Таким образом, литературные данные о роли каннабиноидных рецепторов в регуляции толерантности сердца к действию ишемии-реперфузии носят противоречивый характер. Одни исследователи сообщают о том, что инфаркт-лимитирующий эффект каннабиноидов связан с активацией СВ1-рецепторов [3], другие авторы полагают, что кардиопротекторный эффект экзогенных и эндогенных каннабиноидов является результатом активации СВ2-рецепторов [15, 21, 25, 26, 36], некоторые исследователи полагают, что защитный эффект каннабиноидов связан со стимуляцией агонистами как СВ1-, так и СВ2-рецепторов [28, 29]. Кроме того, N.J. Underdown и соавт. [37] считают, что кардиопротекторный эффект каннабиноидов не зависит от активации СВ1- и СВ2-рецеп-торов, а связан с активацией особого каннабиноидного рецептора, который чувствителен только к анандамиду и метанандамиду и не взаимодействует с другими СВ-аго-нистами.

Сигнальный механизм кардиопротекторного действия каннабиноидов. Как мы уже отмечали выше, в сигнальном механизме защитного действия каннабиноидов важную роль играет NO-синтаза [25, 29, 36]. Общеизвестно, что в патогенезе ишемического и реперфузионного повреждения сердца большое значение имеет окислительный стресс [33], поэтому французские физиологи предположили [13], что каннабиноиды могут повышать устойчивость кардиомиоцитов к действию ишемии-реперфузии за счет повышения устойчивости клеток сердца к окислительному стрессу. Кардиомиоциты обычных мышей и СВ2-/-особей инкубировали 18 ч в присутствии Н₂О₂, которая вызывала гибель почти 90% клеток. У контрольных и трансгенных мышей процент гибели кардиомиоцитов был идентичным. Селективный СВ2-агонист JWH133 (конечная концентрация 1 мкМ) в этих условиях увеличивал выживаемость клеток почти в 5 раз. Защитный эффект JWH133 не проявлялся, если в среду инкубации был добавлен селективный СВ2-антагонист АМ630 (5 мкМ) [13]. Эти данные свидетельствуют о том, что кар-диопротекторный эффект каннабиноидов может быть следствием увеличения толерантности кардиомиоцитов к окислительному стрессу.

В 2003 г. Р. Lepicier и соавт. [28] попытались проанализировать роль протеинкиназ в кардиопротекторном действии каннабиноидов. Эксперименты проводили на изолированном перфузируемом сердце крысы. Ишемию продолжительностью 2 ч моделировали, снижая коронарный проток до 0,6 мл/мин. Длительность реперфузии – 20 мин. Некроз кардиомиоцитов оценивали по уровню ЛДГ и креатинфосфокиназы (КФК) в перфузате, оттекающем от сердца. Агонисты СВ-рецепторов (анандамид, пальмито-илэтаноламид, 2-АГ) добавляли в перфузионный раствор за 15 мин до ишемии. Каннабиноиды оставались в пер- фузионном растворе вплоть до реперфузии [28]. Уровень ЛДГ и КФК в перфузате снижал агонист СВ2- и GPR55-рецептров пальмитоилэтаноламид и агонист СВ1- и СВ2-рецепторов 2-АГ. Анандамид не влиял на концентрацию ЛДГ и КФК в перфузате. Антагонист СВ2-рецепторов SR144528 устранял цитопротекторный эффект пальми-тоилэтаноламида и 2-АГ. Антагонист СВ1-рецепторов SR141716A блокировал кардиопротекторный эффект только 2-АГ. Эти факты говорят о том, что повышения толерантности сердца к ишемии-реперфузии можно добиться, стимулируя как СВ1-рецептор, так и СВ2-рецеп-тор. Авторы исследовали сигнальный механизм цитоп-ротекторного эффекта пальмитоилэтаноламида. Оказалось, что защитный эффект названного каннабиноида не проявлялся в условиях селективной блокады протеинки-назы С хелеритрином [28]. Ингибитор ERK1/2-киназы (extracellular signal-regulated kinase) PD98059 и блокатор р38-киназы SB203580 устраняли цитопротекторный эффект пальмитоилэтаноламида. Кроме того, Р. Lepicier и соавт. [28] показали, что названный каннабиноид индуцирует фосфорилирование ERK1/2-киназы и р38-кина-зы, что принято рассматривать как признак активации киназ [42]. Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, что кардиопротекторный эффект пальмитоилэтаноламида связан с активацией протеинки-назы С, р38-киназы, ERK1/2-киназы. Однако не ясно, какова роль этих киназ в цитопротекторном эффекте агонистов СВ1- и СВ2-рецепторов, поскольку, по данным некоторых авторов, названный каннабиноид не является агонистом СВ1 и СВ2-рецепторов [12], а взаимодействует только с GPR55-рецепторами [34].

Таким образом, каннабиноиды имитируют инфаркт-лимитирующий эффект пре- и посткондиционирования. Кроме того, установлено, что каннабиноиды могут предупреждать реперфузионное повреждение коронарных артерий. Рецепторная природа инфаркт-лимитирующе-го эффекта каннабиноидов является предметом обсуждения. Сигнальный механизм кардиопротекторного эффекта агонистов СВ1- и СВ2-рецепторов практически не изучен.

Работа подготовлена при поддержке гос. контрактов № 02.740.11.0714, контракт № 11.519.11.2016, № 11.519.11.2028, и РФФИ гранты: 10-04-00288, 11-04-00467, 11-04-98001, 11-04-98000, 11-04-98004, 12-04-91152. Авторы выражают признательность за техническую помощь Н.А. Данильченко, М. Октопусу, И.С. Хохловой, В.В. Ключарёву