Кариотип сибирской косули (Capreolus pygargus Pall.) Амурско-Зейской равнины

Введение                      при скрещивании Capreolus capreolus (самка, В=0) и

Сибирская косуля Capreolus pygargus Pallas, 1771 широко распространена по территории Евразии: от Волги на западе до Сихотэ-Алиня на востоке. Подвидовая система вида все еще не определена. По морфологическим характеристикам вид включает три подвида (рис. 1): C. p. pygargus (от Волги до Байкала), C. p. tianschanicus Satunin,1906 (= C. c. bedfordi Thomas, 1908) от Тянь-Шаня до Забайкалья, Монголии, Дальнего Востока и Китая) и C. p. mela-notis Mill, 1911 (Тибет, Китай) [6]. В кариотипе сибирской косули помимо 70 хромосом основного набора (названного А-хромосомы) присутствуют добавочные или В-хромосомы, числа которых варьируют от 1 до 14 [6]. Исключение составила одна особь из Новосибирской области, в кариотипе которой В-хро-мосомы не обнаружены (B=0) [14]. Для сибирской косули Дальнего Востока России – C. p. tianschanicus известны кариотипы четырех особей: одной особи из Амурской области (В=8), одной из Еврейской АО (В=6), двух из Приморского края (В=6–8, 10) [7] и двух из Якутии (В=5–7) [1] и одной – из Забайкалья – (В=8, 10, 12) [7]. Для популяции C. p. tianschanicus Горного Алтая изучено шестнадцать особей, для которых отмечено максимальное для вида число В-хро-мосом (14) [4, 5, 14]. Имеющиеся данные позволили Данилкину с соавторами предположить клинальную изменчивость числа добавочных хромосом, т.е. увеличение числа В-хромосом C. pygargus с запада на восток [7].

Для близкого вида – европейской косули Capreolus capreolus Linnaeus, 1758 (2n=70), добавочные хромосомы не обнаружены [10]. Примечательно, что гибриды первого поколения (F1), полученные

Capreolus pygargus (самец, В=10), наследуют В-хро-мосомы сибирской косули (В=3) [6, 7].

Число В-хромосом в кариотипе сибирской косули может быть как стабильным, когда все клетки имеют одинаковое число В-хромосом, так и мозаичным, когда у одного животного имеются клетки с различным числом В-хромосом [6–8]. Характер мозаицизма В-хромосом этого вида исследован слабо.

Молекулярно-генетические исследования генов cytb и контрольного региона мтДНК показали высокую генетическую гетерогенность популяций сибирской косули, не позволяющую четко выделить описанные ранее подвиды [9, 15].

Межпопуляционная дифференциация по данным контрольного региона мтДНК C. p. tianschan-icus была прослежена между тремя популяциями юга Дальнего Востока – одной в Амурской области и двумя в Приморском крае [13]. Показано, что популяция из Амурской области отличается от популяций Приморского края (центральный и Южный Сихотэ-Алинь), которые в свою очередь также дифференцируются.

Цель работы на основе собственных и литературных данных исследовать изменчивость чисел добавочных хромосом C. p. tianschanicus из популяции косуль Амурской области (Амуро-Зейская равнина) и рассмотреть размах изменчивости чисел В-хромо-сом ранее исследованных кариотипов из различных географических регионов.

Материалы и методы

Исследованы кариотипы шести особей сибирской косули: четырех самцов C. p. tianschanicus (№№ 078, 2082, 2099, 001) и двух самок (№№ 2079

Рис. 1. Карта ареала сибирской косули Capreolus pygargus Pallas

Цифры указывают на число В-хромосом. Черный кружок – точка нашего исследования

Fig. 1. Map of the Siberian roe deer Capreolus pygargus Pallas habitat

The figures indicate the number of B chromosomes. A black circle shows the point of our investigation и 2080), отловленных в Амурской области, на западном берегу р. Нора 3 октября 2006 г., во время их осенней миграции (с востока на запад) из Норского заповедника (52° 29,02´ с.ш. 130°01 в.д.). Ранее все эти кариотипированные животные были исследованы молекулярно-генетическими методами для описания генетического разнообразия сибирской косули Дальнего Востока России [13] и сравнительного анализа молекулярно-генетических характеристик древней и современной ДНК этого вида [15]. Хромосомные суспензии приготовлены в полевых условиях из клеток костного мозга ребер методом кратковременной культуры по методике, предложенной Графодатским и Раджабли [3] с модификацией, которая заключалась в том, что клетки до введения в культуру колхицина выдерживали не 1,5–2 суток, как было рекомендовано, а один час. Клетки костного мозга инкубировали в течение 50 минут при температуре 37º С в среде Игла МЕМ с солями Эрла (70 мл) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки фирмы ПАНЭКО (10 мл). Среду добавляли непосредственно перед работой с клетками. Затем в культуру вводили каплю 0,04% колхицина еще на 50 минут. После осаждения клеток на ручной центрифуге (10 мин) надосадочную жидкость сливали и доливали 5 мл гипотонического раствора KHl (560 мг на 100 м дистиллированной воды), тщатель- но перемешивая клетки. Гипотонию клеток проводили при комнатной температуре 20 минут. Осаждали клетки центрифугированием и фиксировали в этанол–уксусном растворе при соотношении 3:1 (не перемешивая клетки). Через 10 минут клетки перемешивали и осаждали центрифугированием. Смену фиксатора проводили три раза. Хромосомные препараты делали воздушно-капельным методом и окрашивали 2%-м орсеином. Для анализа мета-фазных хромосом использовали микроскоп Imаger M1 (Zeiss, Германия) центра коллективного пользования «Биотехнология и генетическая инженерия» Биолого-почвенного института ДВО РАН.

Результаты

В кариотипе шести исследованных животных число аутосом равно 68: все акроцентрической морфологии убывающие в размерах, Х-хромосома – крупный субметацентрик, Y-хромосома – акроцен-трик, размеры которого не определены (рис. 2). Помимо основного набора, в кариотипе присутствовали добавочные или В-хромосомы, очень мелкие, без видимой морфологии. Числа добавочных хромосом варьировали от 3 до 8: В=3 (№№ 2082, 2099 и 001); В=5 (№ 2078); 7 В (№ 2080) и В=8 (№ 2079). Для каждой особи исследовано от 10 до 20 метафазных пластинок. Число В-хромосом в исследованных кариотипах было стабильно.

Рис. 2. Метафазные пластинки сибирской косули Capreolus pygargus Pallas Амурской области, западный берег р. Нора:

А) № 2082, самец, 3 В-хромосомы; Б) № 2078, самец, 5 В-хромосом; В-хромосомы в кружках. Стрелка указывает на Х-хромосому

Fig. 2. Metaphase plates of Capreolus pygargus Pallas from the Amur region, the Nora River western bank: A) № 2082, male; 3 В chromosomes. Б) № 2078, male, 5 B chromosomes; В chromosomes inside the circles

Нами впервые проведен анализ изменчивости числа В-хромосом у двух особей сибирской косули, исследованных ранее молекулярно-генетическим методом (№ 2078 и № 2079) [15]. Для этих особей в настоящей работе описаны числа В-хромосом – 5 и 8 соответственно. Особь с 5 добавочными хромосомами вошла в молекулярно-генетический кластер D, включающий особей Якутии, Северо-Восточного Китая и Денисовской пещеры (палеонтологический материал) на Алтае. Число В-хромосом в кариотипе косуль Якутии варьирует от 5 до 7, у исследованной нами косули (№ 2078) это число сходно с таковыми из якутской выборки. Данных о числе В-хромо-сом косуль Северо-Восточного Китая нет. Особь № 2079, с 8 добавочными хромосомами, вошла в кластер А, включающий косуль Северо-Восточного Китая. Этот кластер располагался в корне молекулярно-генетического дерева сибирской косули. В кластер Е, вошла особь № 2083, число В – хромосом которой мы не смогли определить, но интересно то, что она вошла в третий кластер Е, в который вошли косули Алтая, Тянь-Шаня и Денисовской пещеры.

Обсуждение

Для шести исследованных в настоящей работе косуль Норского заповедника, принадлежащих крупнейшей в мире мигрирующей селемжинской популяции косуль (численность до 5–7 тыс. голов) отмечено стабильное число добавочных хромосом, равное 3, 5, 7, 8. Ранее в кариотипе одной особи отловленной близ пос. Ново-Киевский Увал, расположенного в долине р. Селемжа, было отмечено восемь В-хромосом [8]. Небольшое расстояние между точками отлова, не более 100 км с севера на юг, можно предположить, что косули принадлежат единой популяции Амуро-Зейской равнины. Всего для этого региона исследовано 7 особей, что позволяет говорить о относительно большом размахе изменчивости чисел В-хромосом (3–8) в этом регионе.

Также, из региона юга ДВ России, исследовано по одной особи из популяций: Еврейской Автономной области (ЕАО), близ г. Биробиджан (В=6) и Приморского края, близ г. Дальнереченск (В=5–8) и пос. Пограничный (В=6–10) (табл.).

Косуля из ЕАО, так же как и косули из долины р. Селемжа имела стабильное число добавочных хромосом, в то время как обе косули из Приморского края имели мозаичный кариотип [8]. Так, самец, отловленный в долине реки Уссури, близ г. Дальне-реченск (юго-западный склон Сихотэ-Алиня) в кариотипе имел 6–10 добавочных хромосом. Самка, отловленная из пос. Пограничный (Приханкайская низменность) в кариотипе имела 6, 7, 8 и 10 добавочных хромосом. Обе исследованные косули были мозаичными. У самца обнаружено 5 клонов с В-хро-мосомами, преобладающим клоном были клетки с 6, 7 и 8 В-хромосомами (25% – каждый клон), 15% клонов с 5, 10% с 10 В-хромосомами. У самки число В-хромосом варьировало от 6 до 10. С четырьмя клонами. Преобладали клоны с 8 (40%) и 10 (30%) В-хромосомами. Клоны с 6 и 7 В-хромосомами были представлены по 15% каждый.

Между косулями Приморского края и Амурской области наблюдается сходство по размаху изменчивости числа В-хромосом (Таблица) и различие по наличию или отсутствию мозаицизма. Однако, небольшое число исследованных особей в Приморском крае и ЕАО, не позволяет делать окончательных выводов о сходстве или различии исследованных популяций.

Сходный размах изменчивости числа добавочных хромосом и у косули из северной Монголии (5–8) [8]. Наибольший размах изменчивости чисел В-хромосом, от 2 до 14, обнаружен у косуль Горного

Таблица

Распределение чисел В-хромосом сибирской косули Capreolus pygargus в исследованных географических районах

Table

The distribution of numbers of В chromosomes of the Siberian roe deer Capreolus pygargus in the studied geographical areas

Районы исследования

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Источник

[8]

[4]

[8]

*

[8]

n

?

2

?

15

2

1

?

?

1

1

6

1

1 Д

1 П

пол

?

?

?

1 m

7 m 7 f

2 f

?

?

1 m

2 f

1 f

4 m 2 f

1 m

1 m

1 f

B=1

есть

B=2

есть

есть

есть

B=3

есть

есть

B=4

есть

есть

есть

B=5

есть

есть

есть

есть

есть

B=6

есть

есть

есть

есть

есть

есть

есть

есть

есть

B=7

есть

есть

есть

есть

есть

есть

B=8

есть

есть

есть

есть

есть

есть

есть

есть

B=9

B=10

есть

есть

есть

есть

B=11

B=12

есть

B=13

есть

B=14

есть

Примечание: 1 – Предуралье, 2 – Южный Урал, 3 –Зауралье, 4 – Алтай, 5 – Восточная Монголия (Халкин-Гол), 6 – Сев. Монголия, 7 – Казах стан и Киргизия, 8 – Забайкалье, 9 – Якутия, 10 – А.О., 11 – ЕАО, 12 – Приморский край, Д – Дальнегорск, П – Пограничный, * – наши данные, f – самка, m – самец, ? – неизвестно

Алтая (числа с 9 и 12 не обнаружены).

Для животных Горного Алтая отмечен мозаицизм по числу добавочных хромосом, однако, подробно характер мозаицизма не исследован. Мозаичный кариотип описан для самки из Забайкалья [8] – три клона с 8, 10 и 12 В-хромосомами (процент клонов не указан) и самки из Якутии – три клона с 5 (12,5%) 6 (70,8%) и 7 (16,7%) В-хромосомами. Интересно, что в Якутии, еще одна самка с шестью В-хромосомами, была со стабильным кариотипом [1]. Возможно, мозаицизм по числу В хромосом C. p. tianschanicus широко распространен по ареалу, однако небольшое число исследованных особей, не позволяет провести сравнительный анализ по этой характеристике кариотипа.

Для многих регионов, за исключением Алтайского края и Амурской области исследовано от одной до двух особей (Таблица), что также не позволяет говорить о размахе изменчивости чисел В-хро-мосом ни внутри популяций, ни между популяциями различных географических регионов. Однако, если нанести на карту ареала сибирской косули числа В-хромосом (рис. 2), то можно видеть, что подвид C. p. tianschanicus, как правило, имеет большие числа В-хромосом (до 14) , чем C. p. pygargus (до 4). Обращает на себя внимание число В-хромосом (6–8) косуль C. p. pygargus из Якутии, которое сходно с числами В-хромосом C. p. tianschanicus, что может свидетельствовать о кариотипическом сходстве косуль Якутии, Амурской области и Приморского края. О генетическом сходстве косуль Якутии с косулями из Амурской обрасти говорят и данные анализа гена контрольного региона мтДНК [15], в то время как по данным исследования микросател-литных локусов ядерного ДНК косули якутской популяции из Якутии ближе к косулям популяций Сибири и Алтая [16]. Популяция косуль Якутии сформировалась в результате естественного расселения вида с Дальнего Востока и Южной Сибири под влиянием природно-климатических изменений [6]. Возможно, смешение популяций двух подвидов привело к формированию гетерогенной популяции имеющей собственные генетические характеристики, включающие числа В-хромосом, близкие таковым, описанные для косуль C. p. tianschanicus.

Интересно, что различия подвидов по числу и морфологии В-хромосом наблюдается у еще одного вида млекопитающих – восточноазиатской мыши Apodemus peninsulae Pall. При этом подвиды A. peninsulae имеют различия по числу микро и макро (хромосомы с видимой морфологией) В-хро-мосом: в Сибири и Забайкалье [12] – A. p. nigrita-lus Hollister, 1913 (В=0–10 макро + 0–20 микро); в Монголии – A. p. major Radde, 1862 non Pallas, 1779 (В=1–5 макро + 0–11 микро); Дальнем Востоке России – A. p. praetor Miller, 1914 (В=0–7 макро); Ко- рее – A. p. peninsulae Thomas, 1906 (В=1–6 макро); Японии – A. p. giliacus Thomas, 1907 (В=1–5 макро + 1–9 микро); Китае – A. p. sowerbyi Jones, 1956 (В=0–1макро + 0–13 микро).

Из выше сказанного можно сделать выводы: 1) по кариотипическим характеристикам подвид C. p. pygargus имеет меньший диапазон изменчивости чисел В-хромосом, чем C. p. tianschanicus ; 2) кариотипы шести сибирских косуль из Амурской области, в отличии от кариотипов косуль Приморского края стабильны, числа В-хромосом соответствуют таковым C. p. tianschanicus и варьируют от 3 до 8; 3) размах изменчивости чисел В-хромосом Якутии ближе к таковому C. p. tianschanicus , а не C. p. pygargus ; 4) кариотип сибирской косули нуждается в дальнейших исследованиях.