Кинетическая схема процесса биодеструкции парацетамола с истекшим сроком годности

В настоящее время остро стоит проблема утилизации лекарственных средств с истекшим сроком годности. Данные лекарственные средства признаются фармацевтическими отходами и подлежат обязательному уничтожению [1]. Рекомендуемые методы их уничтожения (слив в канализацию, сжигание и захоронение на свалках) не являются экологически безопасными и требуют существенной доработки. Сегодня приоритет по показателям эффективности, безопасности и экономичности признается за биотехнологическими способами утилизации опасных отходов.

В основу многих лекарственных препаратов входят соединения, содержащие в молекуле фенольную гидроксильную группу. Как было показано авторами ранее [2, 3], для окислительной биодеструкции парацетамола перспективно использование актинобактерий рода Rhodococcus . Среди культур актинобактерий, поддерживаемых в Уральской региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, http://www.iegm.ru/iegmcol ), отобраны штаммы R. erythropolis ИЭГМ 199, ИЭГМ 201, ИЭГМ 202, ИЭГМ 767; R. ruber ИЭГМ 77, ИЭГМ 231, ИЭГМ 235, ИЭГМ 325, ИЭГМ 759 – наиболее активные биокатализаторы процесса конверсии парацетамола. Разработана технологическая схема процесса биодеструкции парацетамола в виде фармацевтической субстанции и целых таблеток с использованием свободных и иммобилизованных клеток родококков с предварительно

индуцированным алканотрофным обменом. Определены условия интенсификации процесса биоконверсии парацетамола, предусматривающие использование иммобилизованных в криогеле поливинилового спирта клеток родококков. Исследовано влияние вспомогательных веществ (крахмала, талька, стеариновой кислоты, поливинилпирролидона), входящих в состав готовой лекарственной формы (целых таблеток), на процесс биоконверсии парацетамола иммобилизованными клетками родококков.

Для адекватного описания процесса с целью его интенсификации необходима разработка кинетической схемы биокаталитического окисления парацетамола. Цель настоящего исследования – теоретическая оценка основных параметров процесса окислительной биодеструкции парацетамола с истекшим сроком годности.

Разработка кинетических уравнений, определение значений констант скорости и порядка реакции окисления парацетамола

Считая, что скорость убывания парацетамола из среды культивирования бактерий пропорциональна его концентрации х (реакция первого порядка), получаем следующее дифференциальное уравнение, описывающее процесс биодеструкции парацетамола свободными клетками родококков dx

--— — kX .

dt

Интегрируя, получаем зависимость концентрации парацетамола от времени в виде соотношения ln x — — ki t + In Xo,

где x ₀ – начальная концентрация парацетамола, k ₁ – константа скорости реакции, определяемая экспериментально. В явном виде относительно x уравнение (2) можно записать следующим образом:

x — x ₀e ^— k¹ t .                                          (3)

На рис. 1 приведена зависимость логарифма концентрации парацетамола от времени, которая практически аппроксимируется прямой, что соответствует уравнению (2). Из этого графика следует, что ln x ₀ —- 6,21. Тогда константа скорости реакции биокаталитического окисления парацетамола с использованием свободных клеток родококков принимает значение

, —6,21 — (—7,18)               —i ki —---------------— 0,194 сутки .

Уравнение (3) с учетом полученного значения константы скорости реакции и начальной концентрации xo — 2 • 10—3 г/мл принимает вид x — 0,002 e—0,194t,                                    (4)

где x в г/мл, t в сутках.

График зависимости (4) с экспериментальными точками приведен на рис. 2.

Рис. 1. Логарифмическая зависимость концентрации парацетамола от времени биодеструкции свободными клетками родококков, ♦ - данные, полученные в результате проведенных экспериментов

Рис. 2. Зависимость концентрации парацетамола от продолжительности процесса биодеструкции свободными клетками родококков, ♦ - данные, полученные в результате проведенных экспериментов

Как видно из рис. 2, погрешность кинетического уравнения (4) по отношению к экспериментальным данным является удовлетворительной.

Далее рассматривается другой вариант математической модели процесса биодеструкции парацетамола.

Согласно полученной экспериментальным путем схеме биодеструкции парацетамола (рис. 3), его первичным метаболитом является п -аминофенол ( п -АФ).

Как видно из рис. 4, содержание п -АФ увеличивается в первые - третьи сутки эксперимента, а затем резко падает по мере активного разложения п -АФ в результате каталитического воздействия родококков.

При этом можно предположить, что скорость распада парацетамола прямо пропорциональна его концентрации и обратно пропорциональна концентрации п-АФ и других метаболитов. Тогда кинетическое уравнение процесса биодеструкции парацетамола примет вид dx x        x

— = — к 2 — = — к2-----, dt y      xo — x

OH

NHCOCH3

OH

NH 2

OH

OH

O

O

OH

COOH

COOH

Рис. 3. Схема биодеструкции парацетамола: парацетамол (1), п -аминофенол (2), гидрохинон (3), бензохинон (4), пирокатехин (5), муконовая кислота (6)

Рис. 4. Содержание п-аминофенола в процессе биодеградации парацетамола в виде субстанции (2, 4) и таблеток (1, 3) R. ruber ИЭГМ 77 (3, 4) и R. erythropolis ИЭГМ 767 (1, 2)

где y = x о - x - концентрация п -АФ и других метаболитов, равная разности значений начальной и текущей концентрации парацетамола (согласно закону сохранения массы).

При этом можно предположить, что скорость распада парацетамола прямо пропорциональна его концентрации и обратно пропорциональна концентрации п-АФ и других метаболитов. Тогда кинетическое уравнение процесса биодеструкции парацетамола примет вид dx x        x

— = — к2 — = — к2-----, dt y      xо — x где y = xо — x - концентрация п-АФ и других метаболитов, равная разности значений начальной и текущей концентрации парацетамола (согласно закону сохранения массы).

Разделив переменные и интегрируя уравнение (5), получим зависимость xо Inx + xо — — к21.                                 (6)

x ₀

Явную зависимость x ( t ) из (6) получить не представляется возможным, поэтому для построения кинетических кривых процесса биодеструкции парацетамола выразим k ² t :

x ₀

kt     xx

— — In— +--1.(7)

x0

Коэффициент k ₂ определяется экспериментально. В табл. 1 приведены данные по изучению динамики биокаталитического окисления парацетамола свободными клетками родококков.

С помощью уравнения (7) по данным, приведенным в табл. 1, находим значение k ₂ для каждой экспериментальной точки (табл. 1). В качестве k ₂ предполагается взять среднее арифметическое значение: к 2 — 0,000105 г / (мл - сутки).

График зависимости (7) с экспериментальными точками представлен на рис. 5. Как видно из рис. 5, кинетическое уравнение (7) достаточно адекватно описывает процесс биодеструкции парацетамола с учетом остаточного содержания первичного метаболита п -АФ и других метаболитов.

Рис. 5. Зависимость концентрации парацетамола от продолжительности процесса биодеструкции свободными клетками родококков с учетом остаточного содержания п -АФ и других метаболитов, ♦ - данные, полученные в результате проведенных экспериментов

Таблица 1

Динамика процесса биодеструкции парацетамола и значения коэффициента k ₂

t , сутки	х , г/мл	к 2 , г/(мл-сутки)
0	0,00200	–
1	0,00140	0,000113
3	0,00126	0,000061
5	0,00076	0,000139

Рис. 6. Влияние коэффициента k₂ на зависимость относительного содержания парацетамола от продолжительности процесса биодеструкции

Рис. 7. Динамика убыли парацетамола с помощью иммобилизованных клеток R. erythropolis ИЭГМ 767: 1 – адаптированными к фенолу; 2 – адаптированными к н -гексадекану (согласно эксперименту)

Время, час

Рис. 8. Динамика изменения содержания n -аминофенола в процессе биодеструкции парацетамола в виде субстанции (1) и таблеток (2) с помощью иммобилизованных клеток

R. erythropolis ИЭГМ 767

Представляет интерес изучить также влияние коэффициента k2 на вид графиков зависимости (7). Для этого запишем уравнение (7) в следующем виде t = Xo k2

x x0

( y^

1 + In —

I      x o )

— e (0;1]. x ₀

При x o = 0,002 г/мл варьирование коэффициента k 2 e [0,002; 0,1] приводит к зависимостям (8), показанным на рис. 6.

Как видно из рис. 6, при малых значениях k ₂ кривая деструкции парацетамола является пологой (см. также рис. 5), напоминающей экспоненту. Увеличение коэффициента k ₂ приводит к быстрому уменьшению относительной концентрации ^x . x ₀

Кривые практически «упираются» в ось 0 t , особенно с увеличением коэффициента k ₂ , что позволяет описать с помощью кинетического уравнения (7) интенсивные процессы деструкции, протекающие до полного разложения вещества за более короткий промежуток времени. Как следует из рис. 7 и 8, полученных экспериментально, процесс биодеструкции парацетамола может быть интенсифицирован существенно (с 5 суток до 12 ч) за счет использования иммобилизованных клеток родококков.

После определения зависимости коэффициентов скорости реакции от технологических параметров (скорости перемешивания культуральной жидкости, температуры и пр.) полученные кинетические уравнения (4) и (7) можно непосредственно использовать для конструирования оборудования и оптимизации процесса биодеструкции парацетамола.

Заключение

Разработана кинетическая схема процесса биодеструкции парацетамола с истекшим сроком годности на основе использования клеток родококков . Даны кинетические уравнения и значения констант скорости реакции биокаталитического окисления парацетамола. Проведена теоретическая оценка основных кинетических параметров и продолжительности процесса биодеструкции парацетамола, совпадающая с данными экспериментальных исследований.

Благодарности

Исследования поддержаны грантом РФФИ № 04-04-96057.