Клеточная селекция зерновых растений на устойчивость к микотоксинам грибов рода Fusarium

Введение. Фитопатогенные грибы рода Fusarium наносят значительный ущерб урожаю зерновых культур, в том числе яровой мягкой пшеницы, а также загрязняют зерно фузариотоксинами, опасными для человека и животных. Одним из наиболее экологичных способов борьбы с этой инфекцией является создание иммунных сортов с использованием культуры in vitro [2–4]. Все сибирские штаммы грибов рода Fusarium , выделенные из различного материала на территории агроценозов Красноярского края, обладают фитопато-генными свойствами и вызывают некротические поражения растений злаковых культур различной степени выраженности [1]. В то же время эти грибы представляют практический интерес для современной биотехнологии как продуценты биологически активных веществ - селективных факторов отбора устойчивых сортов в клеточной селекции зерновых культур [2–4].

Во многих странах мира ведется работа по созданию фузариозоустойчивых сортов злаковых растений, однако основным ограничивающим фактором применения на практике форм, выведенных зарубежными селекционерами, является их неприспособленность к смене климатических условий [4–5].

Цель работы . Создание фузариозоустойчивых сортов яровой мягкой пшеницы с использованием биотехнологических методов и форм злаковых растений сибирской селекции.

Материалы и методы исследования . Для клеточной селекции в качестве продуцента биологически активных веществ использовали штаммы Z 12-2 Fusarium verticillioides и Z 3-06 Fusarium sporotrichioides из коллекции чистых культур кафедры химической технологии древесины и биотехнологии Сибирского государственного технологического университета. Эти штаммы выделены из семян пшеницы и, согласно ранее проведенным исследованиям, характеризуются выраженной фитотоксической активностью в отношении зерновых культур [6].

Для получения раствора биологически активных веществ использовали жидкую токсигенную среду Myro , на которой практически полностью подавляется споруляция и идет интенсивный биосинтез токсинов. Поверхностное культивирование проводили в течение 42 суток при температуре 23±1 ^оС в темноте, после чего культуральную жидкость (КЖ) фильтровал и (Puradisc 30К , Whatman), удаляя живые клетки гриба. Для исключения заражения каллусных культур стерильность фильтрата контролировали путем его высева на агаризованную среду Чапека.

Отбор форм пшеницы, устойчивых к микотоксинам, проводили в культуре изолированных тканей растений среди сортов Таежная Нива, Минуса, Новосибирская 15, Кантегирская 89 и линии КС-1607, выращенных в условиях светокультуры.

Для индукции каллусов изолированные незрелые зародыши пшеницы высевали на питательную среду с основой по прописи Мурасиге-Скуга, содержащую 2,4Д – 1мг/л и ИУК – 2 мг/л, а пролиферацию каллу-сных культур проводили на среде той же основы с 2,4Д – 0,5 мг/л и различной концентрацией КЖ в среде: 0 (контроль), 20 и 40 %, – добавление которой проводили после стерилизации питательных сред. Каллусы культивировали при 12-часовом фотопериоде в течение 30 суток, отмечали уровень пролиферации, а затем каллусы переносили на среду регенерации с кинетином (1 мг/л), не содержащую токсины, и культивировали их на свету в течение 30 суток. Жизнеспособные регенеранты высаживали в керамзит для получения семенного потомства [1–3].

Результаты. Оценка возможности получения растений-регенерантов, устойчивых к действию метаболитов грибов рода Fusarium, выявила, что биологически активные вещества, содержащиеся в культуральной жидкости, оказывают ингибирующее действие на уровень пролиферации каллусов и образования регенерантов у всех исследуемых образцов. При введении в среду Мурасиге-Скуга метаболитов в концентрации 20 % пролиферация каллусов снижалась в среднем в 1,5 раза по сравнению с контролем; при использовании концентрации 40 % происходило полное угнетение пролиферации каллусов у большинства изученных сортов, за исключением линии КС-1607 и сорта Таежная Нива, которые были отобраны для дальнейшего исследования (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика регенерационных процессов на средах с метаболитами штамма Z 12-2 F. verticillioides в культуре незрелых зародышей пшеницы

Сорт, линия	Введено зародышей, шт.	Индукция каллусогенеза, %	Пролиферация, % Концентрация КЖ
			-	20 %	40 %
КС 1607	51	78,9	67,8	47,7	30,2
Минуса	20	75,0	80,0	60,0	0
Новосибирская 15	12	83,3	89,1	75,0	0
Кантегирская 89	15	86,6	97,0	40,4	0
Таежная Нива	35	85,5	98,8	72,4	29,1
Среднее	∑=133	81,9	86,5	59,1	11,9
Среднее, % от контроля			100	68	14
НСР 0,05			56,7

Образцы (Таежная Нива и линия КС-1607), каллусы которых проявили устойчивость к метаболитам штамма Z 12-2 F. verticillioides, использованы для проведения исследований со штаммом Z 3-06 F. sporotrichioides, обладающим выраженной фитотоксичностью и являющимся представителем широко распространенного вида в Сибирском регионе [6].

На втором этапе оценивали выживаемость каллусных культур и возможность получения регенерантов на средах с различной концентрацией метаболитов штамма Z 3-06 грибов рода F. sporotrichioides. Использование метаболитов в концентрации 20 % приводило к ограничению пролиферации каллусов у линии КС-1607 и сорта Таежная Нива в среднем на 37 % по сравнению с контролем; метаболиты в концентрации 30 % ингибировали каллусогенез на 45 %; а в концентрации 40 % - на 77 % (табл. 2, рис. 1). При этом значительных отличий между реакцией образцов на токсины не отмечалось. Из результатов пролиферации этих двух образцов на средах с КЖ (табл. 1 и 2) можно отметить, что штамм Z 3-06 более агрессивен, чем Z 12-2.

В

А

Рис. 1. Влияние присутствия метаболитов штамма Z 3-06 F. sporotrichioides в питательной среде на рост каллусных культур пшеницы: А – контроль (без метаболитов); Б – содержание метаболитов в среде 20 %; В – 30 %; Г – 40 %

Таблица 2

Пролиферация каллусов в культуре незрелых зародышей пшеницы на средах с метаболитами грибов рода Fusarium

Сорт, линия	Введено зародышей, шт.	Индукция каллусогенеза, %	Пролиферация каллусов, %
			Контр.	Концентрация КЖ штамма Z°3-06
				20%	30%	40%
КС 1607	51	55	65,7	43,2	38,5	18,1
Таежная Нива	193	87	95,3	65,8	56,3	21,7
Среднее	∑244	71	86,5	54,5	47,4	19,9
Среднее, % от контроля			100	63	55	23
НСР 0,05			46,7

Получение регенерантов после пролиферации каллусов проводили на среде регенерации без добавления метаболитов гриба. Образование регенерантов для линии КС-1607 и сорта Таежная Нива в контроле составило 56,7 и 72,2 %; в опытном варианте (при пролиферации каллусов на среде с 20 % метаболитов) - 5,7 и 1,2 % соответственно. От показателей регенерации в контрольных условиях это составило всего 10 и 1,7%. Таким образом, регенерационные процессы ингибировались токсинами десятикратно и больше угнетались на каллусах, полученных от линии КС-1607.

При микроскопировании каллусных клеток существенных морфологических различий в опытных и контрольных вариантах не выявлено (рис. 2). Однако большая доля (по сравнению с контролем) сильно про- крашенных фрагментов на каллусах, прокультивированных с метаболитами, может означать присутствие в них поврежденных нежизнеспособных клеток.

контроль                         40 % метаболитов

Рис. 2. Каллусные клетки (окрашенные метиленовым синим) после роста на среде с метаболитами штамма Z 3-06 (40 %) и в контроле

З аключение . Исследование влияния культуральной жидкости штаммов грибов рода Fusarium на кал-лусные культуры, индуцированные на незрелых зародышах сортов мягкой яровой пшеницы, выявило, что внесение в питательную среду метаболитов в концентрации 20 % вызывает снижение пролиферации жизнеспособных каллусных культур. Увеличение концентрации КЖ до 40 % сопровождается более яркой дифференциацией сортов по устойчивости к метаболитам. Однако если в первом случае регенерация растений сохраняется, хотя и на низком уровне, то получение регенерантов во втором случае практически отсутствует. Каллусные культуры и регенеранты, полученные от линии КС-1607 и сорта Таежная Нива, по сравнению с остальными образцами более устойчивы к действию биологически активных веществ обоих исследованных штаммов грибов рода F. sporotrichioides в культуре in vitro . Эти формы, с предпочтением сорта Таежная Нива, можно использовать в клеточной селекции как источник для получения регенерантов пшеницы, устойчивых к фузариозу.