Клинические особенности течения колоректального рака у пациентов с мутациями генов EGFR-сигнального пути

Введение. Колоректальный рак (КРР) является одной из наиболее распространенных злокачественных опухолей в России, а показатели заболеваемости им в мире и в России ежегодно увеличиваются. По данным за 2017 г., в Ульяновской области КРР выявляют с частотой 142,9 случая на 100 тыс. населения [1]. Продолжительность жизни больных КРР связана со степенью распространенности опухоли, наличием метастазов. При выявлении КРР на I стадии уровень пятилетней выживаемости составляет 93 %, а при прогрессировании заболевания наблюдается явное снижение выживаемости. При II стадии заболевания уровень пятилетней выживаемости снижается до 72 %, при III стадии выживаемость не превышает 45 %, при IV – 8 % [2].

Колоректальный рак представляет собой гетерогенную группу опухолей. Они отлича- ются по механизмам канцерогенеза, агрессивности течения опухолевого процесса, молекулярным изменениям, а следовательно, по чувствительности к противоопухолевому лечению и прогнозу течения болезни. Поэтому для выбора тактики лечения в настоящее время необходимо учитывать молекулярный профиль опухоли.

Ключевые изменения в процессе канцерогенеза КРР происходят в сигнальных каскадах клетки. Гены участников сигнальных каскадов являются протоонкогенами (KRAS, NRAS, BRAF, EGFR, HER2/neo, VEGFR) и антионкогенами (р53, BRCA1/2, ER, PR) [3]. Каскад, стимулируемый EGFR, является одним из основных. Он вовлечен в регуляцию роста, дифференцировки, пролиферации и апоптоза клетки. Постоянная активация EGFR-сигнального пути возникает чаще все- го в результате мутаций в генах нижележащих каскадов. Таким образом, происходит активация сигнального пути без участия EGFR.

Персонифицированная адъювантная химиотерапия (АХТ), основанная на результатах изучения мутационного статуса опухоли, была предложена в начале XXI в. Связано это с появлением препаратов, избирательно блокирующих EGFR-сигнальные пути на различных уровнях (цетуксимаб, бевацизумаб) [4]. Однако результаты ряда рандомизированных исследований не выявили значимого увеличения общей и безрецидивной выживаемости при добавлении к основной полихимиотерапии ингибиторов EGFR-сигнального пути [5, 6].

В исследовании CRYSTAL было показано, что у пациентов с «диким типом» KRAS добавление к стандартной АХТ цетуксимаба было значимо эффективнее по сравнению с группой пациентов с мутацией генов KRAS [7]. В настоящее время Ассоциация онкологов России рекомендует назначение двухкомпонентной АХТ пациентам с III стадией заболевания, а также со II стадией заболевания при сочетании с неблагоприятными факторами риска (менее 12 исследованных лимфоузлов, сосудистая и/или периневральная инвазия, низкая степень дифференцировки, кишечная непроходимость, рT4 стадия).

KRAS – это протоонкоген с собственной активностью фермента, гидролизирующего гуанозинтрифосфат (ГТФаза). Мутации в гене KRAS приводят к активации сигнального пути рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Активация EGFR запускает сигнальный каскад через RAS-RAF-MEK-MAPK- и PI3K-AKT-путь, тем самым приводя к стимуляции ангиогенеза и метастазирования, повышению в опухолевых клетках пролиферации [8]. Мутации в гене KRAS – это наиболее частые генетические изменения, возникающие на ранних этапах канцерогенеза КРР. Чаще всего они происходят в 12-м, 13-м кодонах гена KRAS и являются одним из возможных факторов химиорезистентности [9].

Мутации NRAS встречаются гораздо реже, примерно в 1–6 % случаев КРР. Наличие «дикого типа» NRAS вместе с «диким ти- пом» KRAS связано с хорошим ответом на анти-EGFR-терапию [10]. В работе А.В. Беляевой (2012) установлено, что риск метастазирования у больных с мутацией в гене KRAS выше, чем у больных с «диким типом». Чаще мутации в гене KRAS встречаются у пациентов с III стадией заболевания, реже – при II стадии [11].

BRAF – протоонкоген, являющийся членом семейства киназ RAF. Он, как и KRAS, участвует в сигнальном пути RAS-RAF-MEK-MAPK. Генетические повреждения BRAF приводят к его постоянной стимуляции, и BRAF начинает непрерывно передавать стимулы по RAF-MEK-MAPK-пути, запуская процессы клеточного деления [12]. Мутационный статус генов BRAF и KRAS находится в реципрокных взаимоотношениях. Таким образом, если при КРР обнаруживается активация KRAS, то нарушение в кодоне 600 гена BRAF практически исключено; если в опухоли наблюдается мутация KRAS, то статус BRAF почти всегда остаётся нормальным [13, 14]. В рамках исследований NSABP C07 и C08 при анализе результатов АХТ при КРР наихудший прогноз и низкая выживаемость были ассоциированы с мутацией в гене BRAF [15]. В настоящее время рекомендуется выполнять молекулярно-генетическое тестирование на мутации RAS и BRAF, если выявлены отдаленные метастазы аденокарциномы толстой кишки, так как это может повлиять на выбор таргетных препаратов в лечении метастатического процесса [16].

Цель исследования. Изучить мутации EGFR-сигнального пути в первичной опухоли и их влияние на клинические особенности течения колоректального рака.

Материалы и методы. В исследование включено 37 пациентов с верифицированным диагнозом «колоректальный рак» (характеристика больных представлена в табл. 1). Все они проходили лечение в Ульяновском областном клиническом онкологическом диспансере в период с 2014 по 2018 г. Критериями включения явились впервые диагностированный и верифицированный КРР IIA–IIIB стадии, гистологический тип – аденокарцинома толстой кишки, общее состояние больных по шкале Easten Cooperative Oncology Group –

0±1 балл, ожидаемая продолжительность жизни – более 12 мес. Исследование выполняли в соответствии с Хельсинкской декларацией 1964 г. (модифицированной в 1975 и 1983 гг.). Получено разрешение локального этического комитета ИМЭиФК ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный университет» (протокол № 9 от 15.09.2017). Все пациенты подписали информированное согласие. После радикального оперативного вмешательства оптимальный объем адъювантной химиотерапии при II–III стадиях включал в себя комбинацию оксалиплатина с фторпиримидинами в течение 6 мес. – режимы FOLFOX или XELOX. Оценка клинико-морфологических параметров включала в себя определение уровня онкомаркеров РЭА и СА-19/9 в динамике лечения, степени дифференцировки, периода безрецидивной выживаемости (от последнего курса полихимиотерапии).

Таблица 1

Характеристика больных КРР, включенных в экспериментальную группу

Показатель	Количество больных, чел.
Пол:
мужской	18
женский	19
Возраст, лет:
25–44	5
45–59	20
60–75	12
Стадия заболевания:
II	11
III	26
Локализация опухоли:
слепая кишка	2
сигмовидная кишка	9
ободочная кишка	17
прямая кишка	9
Степень дифференцировки:
низкодифференцированная	3
умереннодифференцированная	21
высокодифференцированная	13

В качестве исследуемого материала использованы парафиновые блоки первичной опухоли КРР. Для последующего выделения ДНК были получены срезы опухоли участков, содержащих минимум 70–80 % опухолевых клеток, толщиной 10–15 мкм. Для выделения геномной ДНК, пригодной для дальнейшей ПЦР в реальном времени, использован набор ExtractDNA FFPE (ООО «Евроген», Россия). Качество и количество выделенной ДНК оценивали при помощи набора Quantum DNA: в 90 % образцов не выявлялись ингибиторы ПЦР, эффективная концентрация фрагментов ДНК находилась в диапазоне 1,5–23,5 нг/мкл. Для определения наиболее часто встречаю- щихся мутаций при КРР использованы наборы «Инсайдер KRAS-2», «Инсайдер NRAS-3» («НОМОТЕК», г. Москва, РФ) (ген KRAS – экзон 2, район кодонов 12–13, ген NRAS – экзон 3, район кодона 61) и наборы производства ЗАО «Синтол», (г. Москва) (V600E гена BRAF). Принцип метода – мутационноспецифическая ПЦР-РВ с использованием модифицированного зонда-блокатора, подавляющего амплификацию фрагментов ДНК без мутаций в области «горячих точек».

Во время и после прохождения АХТ пациенты с КРР находились под динамическим наблюдением (онкомаркеры РЭА и СА-19/9, УЗИ органов брюшной полости, забрюшин- ного пространства, рентгенография органов грудной клетки в двух проекциях, ФКС).

Различия между экспериментальными группами оценивали с применением непараметрического критерия Манна–Уитни (Stata 6.0).

Результаты и обсуждение. Изучение мутационного статуса первичной опухоли КРР показало, что в данной выборке пациентов в 51,4 % случаев (n=19) были выявлены мутации KRAS, NRAS, BRAF: в 8,2 % случаев – BRAF, в 5,4 % – NRAS, в 37,8 % – KRAS (рис. 1). Наши данные согласуются с данными экспериментальных работ по изучению конкордантности мутации генов между первичной опухолью и метастазами рака толстой кишки, свидетельствующими о том, что частота встречаемости мутаций при КРР для генов KRAS, NRAS составляет 35–50 %, для гена BRAF – 5–10 % [17].

■ КРР с мутациями BRAF, nRAS, kRAS КРР без мутаций

Рис. 1. Частота встречаемости мутаций KRAS, NRAS, BRAF у больных КРР

Зависимости распределения мутаций от пола пациента с КРР не выявлено. Возраст на момент постановки диагноза у пациентов с мутациями и без них также значимо не отличался и составлял 57,1±2,1 и 52,3±3,3 года соответственно.

При наличии любой из исследованных мутаций чаще всего встречалась высокодифференцированная (57,9 %) или умереннодифференцированная (42,1 %) аденокарцинома (рис. 2). В группе пациентов, в опухоли которых не выявлены исследованные мутации KRAS, NRAS, BRAF, чаще отмечалась умеренная степень дифференцировки (57,9 %).

Нами установлено, что наличие мутаций KRAS в опухоли не коррелировало со стадией заболевания. Мутация гена BRAF была выявлена на II стадии заболевания в 75 % случаев и на III стадии – в 25 %. Во всех случаях выявления мутаций в гене NRAS была диагностирована III стадия заболевания. При наличии любой из исследованных мутаций чаще всего возникали метастазы в легкие

(66,7 %), печень и забрюшинные лимфоузлы (33,3 %). У большинства пациентов при рецидиве с метастазами в легкие выявлена мутация гена KRAS, что соотносится с литературными данными [17].

Течение КРР при отсутствии мутаций EGFR-сигнального пути (wild type) характеризуется более длительным периодом безре-цидивной выживаемости. Метастазы в печени встречались в 50 % случаев, в забрюшинных лимфоузлах, лимфоузлах средостения – в 33,5 %, в легких – в 16,5 %.

В стандартах ведения пациентов с КРР указано, что во время АХТ необходим контроль процесса при помощи оценки уровня онкомаркеров – РЭА и СА-19/9. Установлено, что при наличии мутации KRAS, NRAS, BRAF изменения РЭА и СА-19/9 в динамике лечения минимальны (рис. 3). У пациентов с КРР без выявленных мутаций в процессе лечения наблюдалось значительное снижение уровня СА-19/9, уровень РЭА в середине ХТ выра-женно снижался, к концу лечения – возрастал.

Рис. 2. Степень дифференцировки первичной опухоли при КРР в зависимости от наличия или отсутствия мутаций генов EGFR-сигнального пути

Рис. 3. Уровень онкомаркеров РЭА и СА-19/9 в сыворотке крови больных КРР при динамическом наблюдении в зависимости от наличия мутаций KRAS, NRAS, BRAF

Выявление мутаций KRAS, NRAS, BRAF при КРР связывают с неблагоприятным прогнозом, а также с устойчивостью к антителам против EGFR [18]. Нами показано, что безре-цидивный период после АХТ по схеме FOLFOX в группе пациентов с КРР с выявленными мутациями в генах KRAS, NRAS,

BRAF значительно меньше, чем при их отсутствии, – 11,5±3,2 против 20,4±11,1 мес.

Высокая частота мутаций генов EGFR-сигнального пути в опухолях толстой кишки говорит о потенциально низкой чувствительности и даже резистентности к стандартным схемам ПХТ (FOLFOX, XELOX). Таким об- разом, эмпирический подход к выбору противоопухолевого лечения, используемый в настоящее время, сводит пользу от АХТ к минимуму. Изучение мутационного статуса опухоли сможет индивидуализировать адъювантную терапию больных КРР и даст возможность использовать специфическую терапию на основе молекулярных маркеров для достижения максимального лечебного эффекта.

Заключение. Наличие мутаций EGFR-сигнального пути является неблагоприятным прогностическим фактором. Целесообразно раннее определение мутационного статуса опухоли до момента прогрессирования заболевания. Это позволит врачу-химиотерапевту сформировать группы риска пациентов, резистентных к ХТ по схемам FOLFOХ и XELOX.