Клиническое испытание ассоциированной вакцины против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, рота- и коронавирусной инфекций крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной

Респираторно-кишечные инфекции молодняка крупного рогатого скота являются острой проблемой современного скотоводства во многих странах мира, в том числе и Российской Федерации. Наиболее распространенными и экономически значимыми инфекциями среди них являются инфекционный ринотрахеит, вызываемый герпесвирусом типа 1, вирусная диарея – болезнь слизистых оболочек (ВД-БС), парагрипп-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальная, рота- и коронавирусная инфекции [1]. Заболевания, вызванные этими возбудителями, протекают очень часто в крупных молочных комплексах в виде смешанной инфекции, поражая до 80 % молодняка и вызывая их гибель до 35-50 %.

В настоящее время для специфической профилактики респираторно-кишечных инфекций молодняка крупного рогатого скота используются инактивированные и живые ассоциированные вакцины отечественного и зарубежного производства [2]. Широко используется, особенно на небольших молочно-товарных фермах, для иммунизации телят, нетелей и коров вакцина, инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота- и коронавирусной инфекций телят

(КОМБОВАК), созданная на основе инактивированных формалином 6 видов вирусных антигенов и гидроокиси алюминия, сапонина в качестве адъювантов.

Существуют другие разновидности вакцины из серии КОМБОВАК. Эта вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, ВД-БС и пастереллеза телят (КОМБОВАК-Р). Она предназначена для профилактики 3 основных вирусных инфекций и 1 бактериальной болезни – пастереллеза крупного рогатого скота, вызывающих респираторным синдромом. Для профилактики 3 основных вирусных инфекций и 1 бактериальной болезни, вызывающих у молодняка крупного рогатого скота желудочно-кишечный синдромом, применяется вакцина инактивированная комбинированная против ВД-БС, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза телят (КОМБОВАК-К). Вакцины КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К применяются для иммунизации стельных коров и телят в неблагополучных хозяйствах.

Широко используется в скотоводческих хозяйствах РФ живая вакцина «Тривак» (ВИЭВ) для профилактики инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3 и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота. Вакцина разработана на основе аттенуированных штаммов вирусов инфекционного ринотрахеита (штамм «ТКА-ВИЭВ-В2»), ВД-БС (штамм «ВК-1»), парагриппа-3 (штамм «ПТК-45/86»).

Из зарубежных биопрепаратов для профилактики инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, парагриппа-3, респираторно-сентициальной инфекции и лептоспироза крупного рогатого скота в РФ применяется вакцина «Бови-шилд Голд FPS L5» (организация-производитель «Pfizer Animal Health», США). Вакцина состоит из двух компонентов. Первый содержит живые аттенуированные производственные штаммы возбудителей инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (IBR), вирусной диареи (BVD тип 1 и 2), парагриппа-3 (PI3), респираторно-сентициальной инфекции (BRSV), а второй – инактивированные штаммы лептоспир 5 серогрупп.

Несмотря на широкий ассортимент применяемых вакцинных препаратов заболеваемость и гибель молодняка от респираторно-кишечных инфекций остается довольно высокой [4]. В связи с этим проблема создания ассоциированной вакцины против вирусных инфекций, обладающей повышенной антигенной и иммуногенной активностью, продолжает оставаться актуальной.

Цель наших исследований – клиническое испытание ассоциированной эмульсионной вакцины против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, рота- и коронавирусной инфекций крупного рогатого скота в производственных условиях.

Прототипом – исходным образцом при создании новой вакцины являлась инактивированная комбинированная вакцина против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота- и коронавирусной болезней телят (КОМБОВАК). Вакцина – прототип имеет существенные недостатки:

• -    она изготовлена из

инактивированных вирусных суспензий без концентрирования, поэтому применение вакцины в рекомендуемых дозах не обеспечивает создание иммунитета достаточной напряженности у вакцинированных животных;

• -    вакцина содержит антиген вируса респираторно-синцитиальной инфекции и применение ее в хозяйствах, где эта инфекция не наблюдается, не всегда оправдана. Антиген вируса респираторносинцитиальной инфекции в таких случаях создает лишь антигенную перегрузку организма, оказывая иммунодепрессирующее действие, снижая при этом выработку иммунитета достаточной напряженности к другим компонентам вакцины;

• -    использование гидроокиси алюминия в качестве адъюванта не обеспечивает длительное освобождение антигена из места введения вакцины. Применение для этих целей масляного адъюванта способствует освобождению антигенов в течение более длительного времени, что создает более активную стимуляцию иммунитета у животных уже после первого введения эмульсионной вакцины.

Материал и методы исследований. При изготовлении ассоциированной вакцины использовали биологически активные вещества в виде инактивированных, очищенных и концентрированных антигенов следующих штаммов вирусов: «ПТК-45/86» вируса парагриппа-3, «ТК-А (ВИЭВ)-В2» вируса инфекционного ринотрахеита, «ВК-1» вируса вирусной диареи – болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, «РМ» ротавируса и 2-«КЛ-2» коронавируса крупного рогатого скота, полученных в перевиваемых культурах клеток.

Основные биологические свойства производственных штаммов вирусов:

• -    штамм «ПТК-45/86» вируса парагриппа-3 – РНК-содержащий вирус из семейства Paramyxoviridae полиморфный, размеры варьируют от 150 до 300 нм, внутренняя структура вириона представлена рибонуклеопротеидом. Вирус

высокочувствителен к действию УФ-лучей. Эфир повышает гемагглютинационный титр и способствует потере инфекционности вируса. Вирус термолабилен, прогревание при 56 0С в течение 30 мин инактивирует его. В щелочной среде вирус сохраняется лучше, чем в кислой. Вирус обладает гемадсорбирующими свойствами, агглютинирует эритроциты морской свинки, кролика, свиньи, коровы, мыши, овцы, козы и голубя. Инфекционный титр штамма вируса составляет не ниже 6,0 lg ТЦД50/см3;

• -    штамм «ТК-А (ВИЭВ)-В2» вируса инфекционного ринотрахеита – герпесвирус типа 1 относится к семейству Herpesviridae, ДНК – содержащий, вирионы заключены в липидосодержащую оболочку, диаметром 150-250 нм. Вирус обладает относительно слабой устойчивостью к физико-химическим воздействиям: при 100 ⁰С погибает моментально; при 56 ⁰С – в течение 20 мин; 22 ⁰С – в течение 50 дней. Ацетон, эфир, хлороформ и этиловый спирт инактивируют вирус моментально. Инфекционный титр герпесвируса типа 1 составляет не ниже 6,0 lg ТЦД50/см³. При заражении вирус индуцирует у животных образование вируснейтрализующих, комплементсвязывающих и преципитирующих антител;

• -    штамм «ВК-1» вируса вирусной диареи – болезни слизистых (ВД-БС) – РНК-содержащий вирус. Является представителем рода Pestivirus семейства Flaviviridae, относятся к 1-ой подгруппе цитопатогенных штаммов. Величина вирионов колеблется от 30 до 50 нм. Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу, трипсину и дезоксихолату. Быстро инактивируется при рН 3,0. Продуктивно репродуцируется в перевиваемых линиях культуры клеток МDBK, ЛЭК, TR и BHK-21. При этом инфекционный титр составляет 6,0 lg ТЦД50/см³;

• -    штамм «РМ» ротавируса крупного рогатого скота является производственным, получен из ВИЭВ в 2009 г. Репродуцируется в перевиваемых линиях клеток МDBК, ЛЭК на среде Игла

МЕМ с 10 % содержанием фетальной сыворотки телят. Непатогенен для новорожденных телят, безвреден для морских свинок и кроликов. Инфекционная активность вируса составляет 5,2 lg ТЦД50/см3;

• -    штамм 2-«КЛ-2» коронавируса крупного рогатого скота является производственным, получен из ВИЭВ в 2009 г. Репродуцируется в перевиваемых линиях клеток МDBК, Т-1, ЛЭК на среде Игла МЕМ с 10 % содержанием фетальной сыворотки телят. Непатогенен для новорожденных телят, безвреден для белых мышей, морских свинок и кроликов. Инфекционная активность вируса составляет 5,2 lg ТЦД50/см³, гемагглютинизирующая активность – 1:64.

Изготовили 8 серий ассоциированной вакцины против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, рота- и коронавирусной инфекций крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной при следующем соотношении компонентов, мас. %:

• -    концентрированный антиген штамма «ПТК-45/86» вируса парагриппа-3 на фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4, полученный на перевиваемой культуре клеток трахеи эмбриона коровы TR с инфекционным титром не ниже 8,5 lg ТЦД50/см³ – 9,5-10,5;

• -    концентрированный антиген штамма «ТК-А (ВИЭВ)-В2» вируса инфекционного ринотрахеита на фосфатносолевом буфере рН 7,2-7,4, полученный на перевиваемой культуре клеток эмбриона коровы MDBK с инфекционным титром не ниже 8,5 lg ТЦД50/см³ – 9,5-10,5;

• -    концентрированный антиген штамма «ВК-1» вируса вирусной диареи -болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота на фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4, полученный на перевиваемой культуре клеток эмбриона коровы MDBK с инфекционным титром не ниже 8,5 lg ТЦД50/см³ – 9,5-10,5;

• -    концентрированный антиген штамма «РМ» ротавируса на фосфатносолевом буфере рН 7,2-7,4, полученный на перевиваемой культуре клеток эмбриона

коровы MDBK с инфекционным титром не ниже 8,2 lg ТЦД50/см3 – 9,5-10,5;

• -    концентрированный антиген штамма 2-«КЛ-2» коронавируса крупного рогатого скота на фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4, полученный на перевиваемой культуре клеток эмбриона коровы MDBK с инфекционным титром не ниже 8,2 lg ТЦД50/см³, гемагглютинизирующей активностью не ниже 1:128 – 9,5-10,5;

• -    целевая добавка – масляный адъювант – до 100,0 мас. %.

Результаты доклинического испытания вакцины на лабораторных животных и молодняке крупного рогатого скота, опубликованные нами ранее [5], показали, что биопрепарат безвреден для животных, обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью.

Клиническое испытание экспериментальных серий вакцины проводили в 3 хозяйствах Республики Татарстан, неблагополучных по респираторно-кишечным инфекциям: ООО «Аксу-Агро» Аксубаевского, Агрофирма «Южный» и КФХ Сулейманов А.И. Нурлатского районов. Вакцинацию начали со стельных коров, которым вакцину вводили внутримышечно за 1,5-2 месяца до отела двукратно в дозе 2 см3. Телят, полученных от вакцинированных коров, вакцинировали в 10-12-дневном возрасте двукратно в дозе 1 см3. Телок случного возраста вакцинировали однократно за 1,52 месяца до осеменения в дозе 2 см3, затем за 1,5-2 месяца до отела двукратно в дозе 2 см3. Об эффективности вакцины судили по показателям заболеваемости и сохранности телят до и после начала применения вакцины, а также по титрам специфических антител в сыворотке крови и молозиве у вакцинированных животных.

Результат исследований. Уровень специфических антител в сыворотке крови и молозиве вакцинированных животных приведены в таблицах 1 и 2. Представленные в таблицах результаты свидетельствуют о высокой антигенной активности эмульсионной вакцины. При двукратном ее введении у коров на последнем месяце стельности повышаются титры специфических антител в сыворотке крови и молозиве к возбудителям респираторно-кишечных инфекций многократно, что способствует получению колострального иммунитета новорожденным телятам.

Таблица 1 – Уровень антител в сыворотке крови крупного рогатого скота после иммунизации ассоциированной вакциной (M±m, n=20, р<0,05)

Антиген / метод определения	Глубокостельные коровы и нетели		Телята 25-30 – дневного возраста
	титры специфических антител
	до вакцинации	после 2-ой вакцинации	до вакцинации	после 2-ой вакцинации
ПГ-3 / РТГА	134,00±19,74	615,00±64,12	82,00±31,60	166,00±67,15
ИРТ / ИФА	420,00±80,50	2850,00±274,62	120,00±44,36	1440,00±135,17
ВД-БС / РН	2,80±0,74	62,80±10,36	1,4±0,66	58,40±5,71
Коронавирус / РТГА	38,4±7,15	307,2±57,24	38,4±7,15	358,4±70,1
Ротавирус / ИФА	51,2±8,76	819,2±140,21	89,6±17,52	870,4±171,73

Таблица 2 – Уровень специфических антител в молозиве крупного рогатого скота после иммунизации ассоциированной вакциной против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи-болезни слизистых оболочек, рота- и коронавирусной инфекций крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной (M±m, n=10, р<0,05)

Антиген / метод определения	Вакцинированные коровы и нетели	Невакцинированные коровы и нетели
	титры специфических антител
ПГ-3 / РТГА	268,00±55,47	43,00±20,64
ИРТ / ИФА	2840,00±710,76	220,00±79,68
ВД-БС / РН	58,20±9,44	3,60±1,15
Коронавирус / РТГА	409,6±70,1	44,8±8,76
Ротавирус / ИФА	921,6±114,48	64,0±19,60

Таблица 3 – Показатели эффективности применения ассоциированной вакцины против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи-болезни слизистых оболочек, рота- и коронавирусной инфекций крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной

Наименование хозяйства	Получено телят	Заболело		Пало		Сохранность, %
		кол-во	%	кол-во	%
До применения ассоциированной вакцины
Агрофирма «Южный»	982	782	79,6	195	19,9	80,1
КФХ Сулейманов А.И.	1849	1584	85,7	471	25,2	74,8
ООО «Аксу-Агро»	1235	1017	82,4	257	20,8	79,2
Всего	4066	3383	83,2	923	22,7	77,3
После применения ассоциированной вакцины
Агрофирма «Южный»	1140	188	16,5	43	3,8	96,2
КФХ Сулейманов А.И.	1814	212	11,6	52	2,9	97,1
ООО «Аксу-Агро»	1457	224	15,4	48	3,3	96,7
Всего	4411	624	14,1	143	3,2	96,8

Показатели эффективности применения инактивированной эмульсионной вакцины в крупных животноводческих комплексах по получению молока приведены в таблице 3.

Всего было получено от вакцинированных коров и нетелей 4411 телят. Из них заболело респираторнокишечными инфекциями 624, что составляет 14,1 %. Из числа заболевших 143 теленка пало, что составляет 3,2 %. При этом сохранность молодняка крупного рогатого скота составила 96,8 %, против 77,3 % до ее применения. Таким образом, иммунизация коров и нетелей на последних месяцах стельности способствовало повышению сохранности телят на 19,5 %, т.е. с 77,3 до 96,8 %.

Установили, что при использовании вакцины в соответствии с временной инструкцией по ее применению побочных явлений, как правило, не отмечается. У отдельных животных через сутки после вакцинации возможно незначительное повышение температуры и формирование припухлости в месте инъекции, самопроизвольно исчезающей через 10-15 суток.

Запрещается применение вакцины с другими иммунобиологическими препаратами, а также с антигельминтиками и инсектоакарицидами в течение 14 суток до и после очередной иммунизации.

На вакцину разработаны нормативные документы на ее изготовление, контроль и применение, а также получен патент РФ [3].

Заключение. Разработана ассоциированная эмульсионная вакцина для специфической профилактики респираторно-кишечных инфекций молодняка крупного рогатого скота на основе концентрированных инактивированных антигенов вирусов парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи – болезни слизистых оболочек, рота-, коронавирусов крупного рогатого скота. Клинические испытания вакцины в крупных молочных комплексах Республики Татарстан подтвердили ее эффективность.

Резюме

В работе представлены результаты изучения эффективности ассоциированной эмульсионной вакцины против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, рота- и коронавирусной инфекций крупного рогатого скота в производственных условиях. При изготовлении ассоциированной вакцины использовали биологически активные вещества в виде инактивированных, очищенных и концентрированных антигенов следующих штаммов вирусов: «ПТК-45/86» вируса парагриппа-3, «ТК-А (ВИЭВ)-В2» вируса инфекционного ринотрахеита, «ВК-1» вируса вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, «РМ» ротавируса и 2-«КЛ-2» коронавируса крупного рогатого скота, полученных в перевиваемых культурах клеток. Изготовили 8 серий ассоциированной вакцины. Клиническое испытание эффективности вакцины проводили в 3 скотоводческих хозяйствах Республики Татарстан, неблагополучных по респираторно-кишечным инфекциям молодняка крупного рогатого скота по показателям заболеваемости и сохранности телят, полученных от вакцинированных и невакцинированных коров, а также по титрам специфических антител в сыворотке крови и молозиве.

CLINICAL TRIAL OF THE ASSOCIATED VACCINE AGAINST PARAINFLUENZA-3, INFECTIOUS RHINOTRACHEITIS, VIRAL DIARRHEA, ROTA- AND CORONAVIRUS INFECTIONS OF CATTLE INACTIVATED EMULSION