Клинико-эпидемиологическая и молекулярно-генетическая характеристика острых лейкозов во взрослой клинике Новосибирского городского гематологического центра

Острые лейкозы представляют собой не только наиболее злокачественные формы гемобластозов, но и нозологию, в отношении которой современной медициной сделан наиболее значительный рывок в плане прироста эффективности лечения. На основе глубокого изучения биохимизма опухолевых клеток, раскрытия патогенетических механизмов опухолевой прогрессии были разработаны технологии программной терапии злокачествен- ных бластных неоплазий, отработана терапия сопровождения. Эти действительно революционные перемены в лечебно-диагностических подходах не замедлили сказаться на результативности терапии, выживаемости и качестве жизни пациентов. Острые лейкозы стали индикаторной нозологией в отношении качества работы гематологических клиник во всем мире. На международных форумах были обсуждены и приняты новые положения ВОЗ-классификации, стандарты лечения и алгоритмы профилактики осложнений миелоаблативных химиотерапевтических программ. В последние годы определено место аллогенной трансплантации костного мозга и периферических стволовых клеток как основы консолидации ремиссии и средства борьбы с резидуальной опухолевой болезнью как способа биологического моделирования in vivo иммунной реакции трансплантат против лейкоза [4].

Дальнейшее продвижение в прогнозировании опухолевой прогрессии и эффективности терапии было связано с верификацией молекулярно-генетических аномалий в геноме опухолевой бластной клетки, что выявило чрезвычайную гетерогенность данной нозологии. Эта позиция отразилась в пересмотрах ВОЗ-классификации острых лейкозов, выделении особых вариантов, ассоциированных с комплексом иммунофенотипических, цитогенетических и молекулярно-генетических маркеров [6]. К настоящему времени доказана тесная ассоциация варианта опухоли с особенностями клинического течения, эффективностью стандартных протоколов лечения и прогнозом заболевания. Большое значение для развития гематологической службы регионов приобрело освоение диагностических технологий исследования иммунофенотипа и генома бластных клеток при острых лейкозах, в том числе, проточной иммуноцитофлюориметрии, флюоресцентной in situ гибридизации (FISH), геночиповых технологий и других молекулярно-биологических методов. Полноценность данных по эпидемиологии гемобластозов теперь связана не только с клинической и цитохимической характеристикой острых лейкозов, но и с распознаванием целого спектра иммунофенотипичес-ких, цитогенетических и молекулярно-генетических признаков. В литературе данные о структуре заболеваемости острыми лейкозами с подробной характеристикой указанных аспектов по большинству регионов, по субъектам Сибирского федерального округа (СФО), как и в целом по России, пока отсутствуют, что определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель: оценить заболеваемость различными вариантами острых миелоидных и лимфоидных лейкозов в соответствии с критериями ВОЗ-классфикации на территории г. Новосибирска и Новосибирской области за период 2006–2016 гг.

Задачи:

• 1.    Дать клинико-эпидемиологическую характеристику контингента больных острыми лейкозами г. Новосибирска и Новосибирской области за период 2006– 2016 гг.

• 2.    Изучить распространенность отдельных вариантов острых миелоидных и острых лимфоидных лейкозов в соответствии с устойчивыми генетическими анома-

  лиями, иммунофенотипическими характеристиками и критериями ВОЗ-классификации (пересмотр 2008 г.).

• 3.    Оценить прогностическое значение определения профиля экспрессии химерных генов на течение острого лейкоза и эффективность терапии.

Материал и методы

Проводилось ретроспективное исследование данных первичной документации (истории болезни, амбулаторные карты, заключения лаборатории цитогенетического, иммунофенотипического и молекулярно-генетического исследования гемобластозов) пациентов городской гематологической службы г. Новосибирска и НСО за период с 2006 по октябрь-ноябрь 2016 гг. Наряду с рутинными показателями, учитывались данные FISH-исследования (использовался микроскопно-компьютерный комплекс в составе микроскопа NICON (Япония) и программы распознавания и анализа FISH-изображений Luchia (Чехия), иммуноцитохимической диагностики, проточной иммуноцитофлюориметрии и результаты исследования ключевых генетических аберраций в опухолевых клетках с помощью геночиповых технологий.

Исследование поверхностных белков методом проточной цитометрии проводилось на проточном цитометре FC500 фирмы Beckman Coulter, по стандартному протоколу лизиса и окрашивания образцов крови и костного мозга. В работе использовались моноклональные антитела (производитель: Beckman Coulter). Исследование поверхностных и внутриклеточных белков методом им-ммуноцитохимии проводилось по стандартному протоколу окраски, прямым методом визуализации, с использованием Ultra Vision Quanto Detection System, и ready-to-use моноклональных антител, производитель Thermo Scientific.

Для геночипирования образцов РНК костного мозга и периферической крови использовались тест-системы (матричные молекулярные биочипы) “ЛК-БИОЧИП” разработанные в институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Москва). На поверхности биочипов были иммобилизированы олигонуклеотиды, комплементарные участкам последовательностей матричной РНК, экспрессирующих химерные гены AML/ETO, E2A/PBX, BCR/ABL, PML/RARA, CBFB/ MYH11, TEL/AML, MLL (общий), появляющиеся как результат хромосомных аберраций t (8;21), t (1;19), t (9;22), t (15;17), inv16, t (12;21).

В рамках достижения заявленной цели были проанализированы первичные материалы 410 пациентов с острыми лейкозами. При этом пациенты г. Новосибирска составили 288 человек (70,2%), жители НСО 122 человека (29,8%). Первичную заболеваемость определяли как средний показатель по годам и рассчитывали как среднее число выявленных острых лейкозов впервые за год х 100 тыс./численность восприимчивого населения.

Диагноз и вариант острого лейкоза устанавливали согласно критериям ВОЗ и FAB-классификации [6]. В соответствии с рекомендациями ВОЗ в качестве диагностически значимого порога принимали количество бластных клеток в костном мозге 20% и более [2, 3, 6].

Cтатистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета Statistica 6.0 и электронных таблиц Exсel 2007. Значимость различий между между группами оценивалась с помощью критерия хи-квадрат, при значениях менее 5 использовался точный тест Фишера, статистически значимыми считались различия при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Среди 410 пациентов острый миелобластный лейкоз (ОМЛ) составил 80,2% (n=328), острый лимфобластный лейкоз – 17,3% (n=82), недифференцированные и бифе-нотипические варианты встречены в 2,5% случаев (n=11).

Расчетная регистрируемая заболеваемость острыми лейкозами по г. Новосибирску составила 2,7 случая на 100 тыс. взрослого населения. Заболеваемость острым мие-лобластным лейкозом – 2,0:100 тыс. взрослого населения, острым лимфобластным (включая случаи недифференцируемого и бифенотипического ОЛ) – 0,7:100 тыс. взрослого населения в год. В анализируемую группу вошли только взрослые пациенты, возрастной диапазон составил от 16 до 72 лет. Средний возраст – 48,4 года. По гендерному различию: мужчины составили 36,3% (n=149), женщины 63,7% (n=261).

Структура ОМЛ по клинико-цитоморфологическим и цитохимическим признакам была разделена в соответствии с критериями FAB-классификации. Из 328 пациентов ОМЛ: M0-вариант имели 20 больных (6,2%); М1 – 65 пациентов (19,8%); М2 – 144 (44,2%); М3 – 13 (3,9%); М4 – 67 (20,3%); М5 – 6 (1,8%); М6 – 13 (3,8%).

Иммунофенотипирование с моноклональными антителами (методами проточной иммуноцитофлюоримет-рии и иммуноцитохимии по мазкам костного мозга) позволило выделить иммунофенотипические варианты ОЛЛ в соответствии с классификацией EGIL (1995–2012). Общее число пациентов с острым лимфобластным лейкозом в исследуемом контингенте составило 82 человека. В-линейные варианты ОЛЛ занимали сегмент в 52,1% (n=43) от общего числа пациентов этой группы. Т-ли-нейные – 26,3% (n=22). Бифенотипические, экспрессирующие лимфоидные и ряд миелоидных маркеров, составили 15,9% (n=13). Недифференцируемые с отсутствием экспрессии специфических молекулярных маркеров линейной дифференцировки – 5,7% (n=4).

Больные ОЛЛ, отнесенные в соответствии с иммунофенотипом к раннему В-линейному варианту (проВ), составили 11,3% от всех пациентов с ОЛЛ (n=9). ПрепреВ-вариант (common) имели 20,1% больных (n=17). Пре-ВОЛЛ был диагностирован у 11,3% случаев ОЛЛ (n=9). “Зрелый” В-клеточный иммунофенотип экспрессировало 9,4% пациентов (n=8).

В случае Т-клеточного иммунофенотипа бластных клеток, самый ранний – проТ-ОЛЛ встретился у 11,3% (n=9).Тимический (преТ)ОЛЛ – у 1,8% (n=2), “зрелый” Т-клеточный фенотип лимфобласты несли у 11 больных (13,2%) [4, 6].

Оценка результатов генетических и молекулярно-генетических исследований позволила выделить специфические варианты ОЛ в соответствии с классификацией ВОЗ [6].

При цитогенетическом и молекулярно-генетическом (методами in situ гибридизации и microarray геночиповыми технологиями) исследованиях опухолевых бластных клеток периферической крови и костного мозга у 277 пациентов (67,6%) были выделены различные генетические нарушения. Нормальный кариотип наблюдался у 96 пациентов (23,5%). Не удалось получить метафаз для цитогенетического анализа у 36 больных (8,8%).

Комплексные аномалии, представляющие собой сочетания цитогенетически верифицируемых грубых нарушений генома (инверсии, транслокации и др.) и наличие химерных генов, соответствующих критериям устойчивых вариантов ОМЛ и ОЛЛ, выделенных классификацией ВОЗ, были обнаружены у 102 больных (25% от всех случаев с генетическими нарушениями). В 42,6% (n=175) имели место другие аберрации, не связанные с ВОЗ-ва-риантами острых лейкозов. При этом в части случаев (n=21) имели место сочетанные генетические повреждения, включавшие несколько маркерных генов.

Из 102 пациентов с рекуррентными генетическими аберрациями в бластных клетках ОЛ, случаи ОМЛ составили 70,6% (n=72), ОЛЛ – 29,4% (n=43).

Среди всего контингента пациентов с ОМЛ вариант, ассоциированный с транслокацией t(8:21) (q22:q22) и возникновение химерного гена RUNX1-RUNX1T1 (AML/ ETO), был обнаружен у 14 пациентов (18,1%). Аберрация в виде инверсии inv(16)(p 13.1q22) или транслокации t(16:6)(p 13.1;q22) с возникновением аномального гена CBFB-MYH11 была выявлена у 5 больных ОМЛ (6,8%). Про-миелоцитарный вариант ОМЛ (M3 по FAB) с t(15:17) (q22:q 12) и аномальным PML-RARA отмечен у 6 больных (8,4%). ОМЛ с транслокацией t(9;11)(p22:q23) и геном MLLT3-MLL обнаружен у 3 больных (4,2%). Устойчивое сочетание онкогенетического события t(6:9)(p23:q34) с формированием DEK-NUP214 выявлено у 2 пациентов (2,8%). Миелобласты с inv(3)(q2 1q26.2) или t(3;3)(q2 1;q26.2) с FISH-признаками гена RPN1 ·EVI1 обнаруживались в 6 случаях ОМЛ (8,3%). Редкий мегакариобластный тип ОМЛ с t(1;22)(p13;q13) и RBM15-MKL 1 был выявлен у 3 пациентов (4,2%). Высокой частотой встречаемости, хотя и более редкой в сравнении с данными литературы [6], отличался вариант ОМЛ с мутациями NPM1, обнаруженный нами у 21 пациента (29,2%) чаще в комбинации с другими аберрациями. Вторая по частоте аномалия была связана с мутационными событиями в гене CEBPA опухолевых миелобластов (n=12, 16,7%).

У пациентов с ОЛЛ также были встречены устойчивые, с часто повторяющимися аберрациями варианты, соответствующие комплексным маркерам классификатора ВОЗ. Так, из 43 пациентов, попадающих под эти критерии, 18,6% больных (n=8) обнаруживали вариант ОЛЛ с Ph-хромосомой – t(9:22)(q34;q 11.2) с экспрессией химерного гена BCR-ABL. У одного больного ОЛЛ был выявлен довольно редкий, встречающийся в менее чем 1% случаев, вариант с t(v:11q23) и реаранжировкой гена MLL. У двух пациентов встретился вариант с t(12:21)(p13;q22) с экспрессией гена TEL-AMLl (ETV6-RUNX1). Гипердиплоидный вариант был отмечен у 14 больных (32,6%), гипо-диплоидный – у 12 (27,9%). ОЛЛ с транслокацией t(5; 14)(q31;q32) и химерным IL3-IGH был обнаружен у 4 боль- ных (10,2%). Минорный вариант ОЛЛ с t(1;19) (q23:P13.3) и геном E2A-PBX1(TCF3-PBXI) был диагностирован у 3 пациентов, что составило 6,9% от всего контингента ОЛЛ с экспрессией устойчиво повторяющихся молекулярногенетических маркеров.

По данным молекулярно-генетических исследований была проведена предварительная ретроспективная оценка влияния выявленных аберраций на эффективность программной полихимиотерапии и прогноз заболевания. По результатам терапии (глубине, продолжительности и качеству полученной ремиссии ОЛ и другим прогностическим критериям ВОЗ, по итогам трехлетнего мониторинга выживаемости) больные были разделены на две прогностические группы.

В группе благоприятного прогноза (n=33) в бластных клетках при первичной диагностике наиболее часто (у 52% (n=17) против 9,5% (n=7 – в группе неблагоприятного прогноза, p=0,002) встречались одиночные хромосомные аберрации, приводящие к повышенной экспрессии химерных генов – AML/ETO (у 8 пациентов с ОМЛ), NPM1 и MLL (у 1 пациента с ОЛЛ). В группе пациентов с неблагоприятным прогнозом заболевания (n=69), в отличие от предыдущей группы (22,5% (n=16) против 6% (n=5), соответственно (p=0,01)) отмечено наличие множественных комбинированных генетических аберраций с наиболее характерным профилем аномальных генов: MLL, AML/ETO, BCR/ABL и MLL, AML/ETO и TEL/AML (в 2 случаях наблюдалась одновременная экспрессия MLL, TEL/ AML , в 3-х случаях – CBFB/MYH11, AML/ETO , у 2 пациентов наблюдалась одновременная экспрессия 3-х химерных генов MLL, AML/ETO и BCR/ABL; MLL, AML/ETO и TEL/ AML, соответственно). Одиночные хромосомные аберрации (наиболее часто ген AML/ETO ) отмечены у 10 больных (34%) с ОМЛ.

Таким образом, проведенное исследование выявило, что заболеваемость острыми лейкозами в г. Новосибирске и НСО в целом соответствует показателям, определяемым в Европейской части страны. Иммунофенотипичес-кая и молекулярно-генетическая характеристика острых лейкозов дает возможность проводить дифференциальную диагностику этих опухолей и выделять варианты, различающиеся по прогнозу и эффективности проводимой терапии в соответствии с критериями ВОЗ [1]. Всю полноту генетических аномалий позволяет выявить комплекс диагностических методов, включающий, наряду с рутинными цитогенетическими исследованиями, проточную иммуноцитофлюориметрию, FISH-анализ, подкрепленный данными генобиочиповой диагностики. Определение генетического профиля несколькими методами позволяет одномоментно выявлять широкий спектр клинически значимых генетических аномалий для определения прогноза и тактики лечения пациентов с бластными формами гемобластозов [1, 3, 5].

Выводы

• 1.    Заболеваемость острыми лейкозами по г. Новосибирску составила 2,7 случая на 100 тыс. взрослого населения: острыми миелобластными лейкозами – 2,0 на 100 тыс. взрослого населения, острыми лимфобласт-

• ными (включая случаи недифференцируемого и би-фенотипического ОЛ) – 0,7 на 100 тыс. взрослого населения в год.

• 2.    По критериям FAB-классификации преобладал М1 (19,8%), М2 (44,2%) и М4 (20,3%) варианты ОМЛ.

• 3.    Иммунофенотипическая структура ОЛЛ взрослых показала преобладание В-линейные вариантов (52,1%) над Т-клеточными 26,3% (n=22). Бифенотипические подтипы острого лейкоза составили 15,9%, недифференцируемые – 5,7%. Среди В-клеточных ОЛЛ преобладает препреВ-вариант (common)-вариант (20,1%), среди Т-клеточных – вариант со “зрелым” Т-клеточ-ным фенотипом лимфобластов (13,2%).

• 4.    Рекуррентные генетические аберрации встречаются в 25% случаев острых лейкозов: при ОМЛ в 70,6%, при ОЛЛ – в 29,4% случаев. Среди пациентов с ОМЛ наиболее высока встречаемость вариантов с мутациями NPM1 (29,2%) и гена CEBPA (16,7%). При ОЛЛ чаще обнаруживался вариант с Ph-хромосомой – t (9:22) (q 34;q 11.2) с экспрессией химерного гена BCR-ABL 1 (18,6%), гипердиплоидный (32,6%), и гиподиплоидный (27,9%) варианты.

• 5.    У больных острыми лейкозами с неблагоприятным течением заболевания и рефрактерностью к проводимой терапии статистически значимо чаще встречаются множественные генетические аберрации с профилем аномальных генов: MLL , AML / ETO , BCR / ABL и MLL , AML / ETO и TEL / AML , в отличие от пациентов группы с благоприятным прогнозом заболевания, у которых преимущественно отмечаются одиночные генетические аберрации (22,5% против 6%, соответственно (p=0,01)).