Количественная масс-спектрометрия в диагностике гриппа и контроле действия лекарственного препарата "Триазавирин"

Грипп в различных его формах в виде сезонных вспышек или пандемий остается серьезной проблемой общественного здравоохранения. Инфекция гриппа у человека может протекать по-разному: от бессимптомной инфекции до осложненных форм, включая тяжелую вирусную пневмонию и обострение имеющихся хронических заболеваний. Сезонные эпидемии гриппа ежегодно могут поражать до 15 % населения. Это указывает на важность создания новых и улучшения существующих вакцин и лекарств.

Вирус гриппа заражает в основном эпителиальные клетки верхних дыхательных путей, распространяясь затем и на клетки нижних дыхательных путей. Значительное число пораженных клеток, возникающее при недостаточном иммунном ответе организма, собственно, и приводит к нарушению функции органов и систем органов, в первую очередь нервной и сердечно-сосудистой систем. Эти нарушения проявляются в общих и локальных изменениях в регуляции кровоснабжения органов и тканей.

В регуляции кровяного давления и водно-солевого баланса принимает участие ренин-ангио-тензиновая система, которая является наиболее важной и достаточно хорошо изученной. Участником этой системы является ангиотензин II — конечный продукт каскада протеолитических процессов. Свое влияние ангиотензин II оказывает через ангиотензиновые рецепторы, являющиеся медиаторами основного сосудосуживающего эф- фекта, включающего вазоконстрикцию, синтез и секрецию альдостерона, секрецию вазопрессина, запуск норадренергической активности и регуляцию синтеза ренина в почках. Рецепторы ангиотензина II обнаружены в сердце, кровеносных сосудах, почках, надпочечниках, легких и головном мозге. Ангиотензин II образуется из ангиотензина I в результате отщепления двух C-концевых аминокислот ангиотензинпревращающим ферментом (АПФ).

Помимо ангиотензина I, АПФ гидролизует и другие пептиды плазмы крови, а также инактивирует пептид, обладающий сосудорасширяющим действием, — брадикинин [1]. Брадикинин играет важную роль в регуляции кровообращения в условиях острых воспалительных реакций различного патогенеза [2]. Он является одним из самых сильных сосудорасширяющих средств в организме, повышает проницаемость капилляров и способствует выходу жидкости из кровеносного сосуда (вызывает отек). С этой точки зрения брадикинин вместе с гистамином и простагландинами относят к медиаторам воспаления.

В метаболизме брадикинина, помимо АПФ, участвуют еще по крайней мере две протеиназы — аминопептидаза P и неприлизин (карбоксипептидаза N), которые отличаются продуктами гидролиза. АПФ расщепляет связь (7–8), а аминопептидаза и карбоксипептидаза отщепляют соответственно N и C концевые аминокислоты.

Таким образом, активность протеиназ, участвующих в метаболизме ангиотензина I и брадикинина в тканях дыхательных путей, будет отражать развитие патологического процесса при гриппе, что и являлось предметом изучения в настоящей работе.

Оптимальным материалом для исследования можно считать бронхиальный смыв — лаваж. Традиционно активность пептидаз измеряют с использованием хромогенных или флюорогенных субстратов, а также в условиях сложных смесей в присутствии ингибиторов. Однако выбор и синтез специальных субстратов и ингибиторов сам по себе является сложной задачей [3]. Кроме того, упомянутые протеиназы относятся к металлопротеиназам, что указывает на то, что можно ожидать перекрестного действия ингибиторов. Поэтому в данной работе использовались нативные субстраты, активность во времени которых измерялась методом количественной масс-спектрометрии, ранее разработанным и опробованным авторами [4, 5].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Тестируемые препараты

Исследуемый препарат "Триазавирин", предоставлен ООО "Завод Медсинтез".

Экспериментальные животные

Белые беспородные мыши предоставлены питомником Рапполово, Ленинградская область. Вес животных 16–18 г.

Животных содержали в стандартных условиях в соответствии с методическими документами, используемыми при работе. Все процедуры с животными в исследовании были рассмотрены и утверждены Комиссией по биоэтике ФГБУ "НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева" Минздрава России на предмет соответствия регулирующим актам.

Вирусы гриппа

Для работы был использован штамм вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2), адаптированный к мышам, полученный из рабочей коллекции вирусов ФГБУ "НИИ гриппа им. А.А. Смородинце-ва" Минздрава России.

Введение препарата животным

Препарат "Триазавирин" был использован в дозировке 200 мг/кг, вводился перорально в объеме 0.2 мл один раз в сутки по лечебно-профилактической схеме (за 24, за 1 ч и через 24, 48 и 72 ч после заражения).

Заражение животных и забор проб

Мышей заражали интраназально под легким эфирным наркозом вирусом в дозе 1 МЛД50 на мышь в объеме 50 мкл (МЛД — мышиная летальная доза). На 3-й день после заражения, через 2 ч после введения препарата животных подвергали эвтаназии, забирали кровь и бронхиальный смыв (лаваж).

Получение стандарта из ангиотензина II и брадикинина

Стандарты подготавливались из ангиотензина II и брадикинина ("Sigma-Aldrich"). Навеску 2.1 мг пептида растворяли в 20 мкл 10 % трифторуксусной кислоты (ТФУ, "Sigma-Aldrich") в H 2 ¹⁸O (97 %   ¹⁸O, "Cambridge Isotope Laboratories

Andover", MA, USA) и инкубировали в твердотельном термостате при 70 °С в течение 90 мин для протекания изотопного обмена, после чего высушивали в вакуумном испарителе SpeedVac ("Eppendorf"). Содержимое пробирки растворяли в воде и использовали в качестве стандарта для определения концентрации пептидов.

MALDI-TOF масс-спектрометрия

Исследуемые образцы смешивали с матрицей HCCA ("Bruker", Германия), наносили на мишень GroundSteel ("Bruker", Германия) и анализировали на масс-спектрометре MALDI-TOF / TOF ultrafleXtreme ("Bruker", Германия) в режиме обнаружения положительных ионов. Для каждого спектра было суммировано 5000 лазерных импульсов. Идентификация белков проводилась с использованием MASCOT ( для доступа к базе данных NCBI (Национальный центр биотехнологической информации, , в параметрах в качестве переменных модификаций было указано окисление метионинов. Ошибка определения массы была ограничена до 50 ppm.

Условия гидролиза пептидазами

Растворы пептидов ангиотензина I и брадикинина смешивались с сывороткой (разбавление в 25 раз) и лаважем (без разбавления). Смеси инкубировались при 37 °С в течение 15, 40 и 60 мин. Реакция останавливалась добавлением аликвот в 2 % ТФУ. В анализируемые пробы вносился стандарт ожидаемого продукта гидролиза 18О-ангиотен-зин II для ангиотензина I или 18О-брадикинина для брадикинина.

Р ЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТА И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Общая характеристика

В настоящей работе исследовались образцы сыворотки крови и бронхиальных смывов здоровых и больных мышей. Выбор этих двух биологических сред для сравнительных исследований обусловлен тем, что они позволяют выявить изменения как в составе крови, так и в легких. В результате экспериментов на животных анализировались изменения активности протеаз, которые характеризуют состояние животных при развитии инфекции и в процессе лечения гриппа препаратом "Триазавирин".

В данной работе для нормировки активности ферментов в бронхиальных смывах использовался альбумин, количество которого было определено по указанной методике [4, 5], а для измерения активности карбокспептидаз использовались природные субстраты — ангиотензин I и брадикинин.

Масс-спектрометрический контроль за гидролизом ангиотензина I ангиотензинконвертирующим ферментом в сыворотке и лаваже

На рис. 1 представлены масс-спектры начального гидролиза ангиотензина I в бронхиальных смывах. Показано образование ангиотензина II ( m / z = 1046.6) из внесенного в сыворотку ангиотензина I ( m / z = 1296.8) под действием АПФ. Видно, что при этом в образце отсутствуют продукты гидролиза, не характерные для АПФ.

Рис. 1. MALDI-MS ангиотензина I ( m / z = 1296.8) через 40 мин гидролиза пептидазами в лаваже мыши при 37 °С в присутствии стандарта ( m / z = = 1052.7) к ангиотензину II ( m / z = 1046.6)

Рис. 2. Фрагменты масс-спектров для ангиотензина II и его стандарта в биологических средах.

а — в сыворотках, б — в бронхиальных смывах

Рис. 3. Активность АПФ в сыворотках (а) и бронхиальных смывах (б) мышей. За 100 % взята активность АПФ у здоровых мышей

На рис. 2 представлены фрагменты масс-спектров гидролизатов для сыворотки (а) и лаважа (б), из которых было рассчитано количество образующегося ангиотензина II, согласно описанной в работе [5] методике.

Полученные данные использовались для вычисления относительной активности АПФ. Результаты этих вычислений представлены на рис. 3. Из рисунка видно, что разница в активности АПФ в сыворотке не столь существенна (разница между здоровой и зараженной особью не превысила 20 %) в отличие от результатов, наблюдаемых на бронхиальных смывах (увеличение активности АПФ в 8 раз у инфицированных мышей и существенное снижение при приеме препарата практически до нормальных значений).

Масс-спектрометрический контроль за гидролизом брадикинина в сыворотке и лаваже

Количественный масс-спектрометрический контроль за концентрацией брадикинина, привнесенного в сыворотку крови и в лаваж, позволил оценить изменение протеолитической активности при вирусной инфекции по сравнению с контролем.

Аналогично описанному выше исследованию по ангиотензину I проведены исследования активности пептидаз в отношении брадикинина. На рис. 4 и 5 представлены результаты исследований гидролиза брадикинина (продукты гидролиза представлены в таблице) в сыворотке и в лаваже.

Рис. 4. MALDI-MS брадикинина через 15 мин гидролиза пептидазами в сыворотке крови при 37 °С

1067.4

m / z

Рис. 5. Фрагменты масс-спектров для брадикинина и его стандарта в биологических средах.

а — в сыворотках, б — в бронхиальных смывах

Аминокислотные последовательности продуктов гидролиза брадикинина

Пептид	Аминокислотная последовательность
Br(1–9) — брадикинин Br(1–8) Br(1–7) Br(1–5)	Apг-Про-Про-Гли-Фен-Сер-Про-Фен-Apг Apг-Про-Про-Гли-Фен-Сер-Про-Фен Apг-Про-Про-Гли-Фен-Сер-Про Apг-Про-Про-Гли-Фен

Рис. 6. Активность пептидаз в сыворотках (а) и бронхиальных смывах (б). За 100 % взята активность пептидаз у здоровых мышей

Из данных экспериментов прежде всего следует, что при гидролизе брадикинина (Br(1–9)) образуется несколько продуктов. Пептид Br(1–8) может быть образован исключительно под воздействием карбоксипептидазы N. В то же время пептиды Br(1–7) и Br(1–5) могут быть продуктами гид- ролиза брадикинина ангиотензинпревращающим ферментом.

Относительная активность пептидаз по отношению к брадикинину представлена на рис. 6. Концентрация брадикинина оценивалась с использованием в качестве стандарта 18О-брадикинина.

ВЫВОДЫ

Наиболее значимые изменения активности пептидаз происходят в бронхиальных смывах, нежели в сыворотках крови больных животных.

Введение препарата здоровому животному приводит к увеличению активности АПФ, но в значительно меньшей степени по сравнению с инфицированными животными.

При введении препарата больным животным происходит заметное снижение активности АПФ до уровня, соответствующего здоровым животным. Это говорит об избирательности воздействия препарата на ренин-ангиотензиновую систему.

По результатам работы можно сделать общий вывод о том, что подобный скрининг может быть с успехом использован при сравнительной оценке эффективности и других антигриппозных препаратов, а также для понимания направления их воздействия на инфицированный организм.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов, в том числе и финансовых.

Данная работа частично выполнена в рамках НИР 0074-2019-0009, входящей в состав гос. задания № 07500780-19-02 Министерства науки и высшего образования Российской Федерации для ИАП РАН.