Количественное определение гликопротеина Е в стандартном образце предприятия вакцины клещевого энцефалита ЭнцеВир

Известно, что главным структурным и иммуногенным белком вируса клещевого энцефалита (КЭ) является гликопротеин Е (gpE, белок Е), входящий в состав оболочки вириона. Антитела, вырабатываемые к нему, обладают способностью нейтрализовать вирус КЭ in vitro, а также защищать человека и подопытных животных от летальной вирусной инфекции [1, 4, 7]. Белок Е является также основным иммуногенным белком цельновирионных вакцин для профилактики клещевого энцефалита, которые в настоящее время производятся и широко применяются в разных странах [1, 8, 9]. Количественное содержание специфичного вирусного белка в современных вакцинах клещевого энцефалита является важным показателем, определяющим не только их эффективность, но и, как предполагают, некоторые побочные реакции [5, 6].

Существующие высокоочищенные вакцины клещевого энцефалита обеспечивают высокий уровень сероконверсии при относительно малом содержании специфичного белка, причем оптимальные количества, необходимые для вакцинации и не вызывающие при этом побочных эффектов со стороны иммунной системы (например, лихорадочных реакций), зависят от технологии и состава, а также предназначения препарата (возраста вакцинируемых) [6, 9], поэтому производители вакцин должны устанавливать и регламентировать в них оптимальное содержание специфичного вирусного белка. На территории России зарегистрированы и применяются для профилактики клещевого энцефалита вакцины четырех производителей [9]. У двух зарубежных производителей декларируется количественное содержание активного компонента в 1 дозе препарата. Например, в дозе вакци- ны FSME-IMMUN®, содержащей стабилизатор альбумин человека, количество инактивированного формальдегидом антигена вируса КЭ составляет 2,38 мкг для взрослых и 1,19 мкг для детей, в вакцине Encepur®, не содержащей такого стабилизатора, в дозе для взрослых – 1,5 мкг, в дозе для детей – 0,75 мкг [8, 9]. У отечественных производителей такая оптимальная норма не установлена. В вакцине ЭнцеВир® (производитель ФГУП “НПО “Микроген” Минздравсоцразвития России, филиал в г. Томск “НПО “Вирион”) активный компонент определяется регламентированными тестами по иммуногенной и антигенной активности с нижним порогом ограничения этих показателей [2, 3].

Для разработки метода количественного определения вирусного белка в вакцине ЭнцеВир производителем в 2010 г. был изготовлен стандартный образец предприятия (СОП) “вакцинного” антигена в виде полуфабриката этого препарата на определенной стадии технологии серийного производства по рекомендации экспертов ФГБУ “ГИСК им. Л.А. Тарасевича Минздравсоцразвития России” – национального органа контроля медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП). Целью данной работы была аттестация СОП по содержанию вирусного белка Е.

Материал и методы

СОП “вакцинного” антигена серия №010810 был приготовлен из производственной партии очищенного концентрата культурального антигена вируса КЭ. Он представляет собой очищенную концентрированную суспензию инактивированного формальдегидом вируса КЭ (штамм “205”, восточный антигенный вариант), репро- дуцированного во взвешенной культуре клеток куриных эмбрионов, в которую добавлен стабилизатор сахароза (из расчета 50 мг на 1 мл). Материал разлит в ампулы по 0,5 мл и лиофилизирован в соответствии с требованиями, предъявляемыми к стандартным образцам. Аттестация СОП по физико-химическим параметрам проведена в отделе контроля качества производителя (НПО “Вирион”) и в биохимической лаборатории контролирующей организации (ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Установленные значения физико-химических показателей и методы их определения представлены в таблице 1.

Определение специфической антигенной активности СОП и количественную оценку вирусного белка в нем проводили методом твердофазного иммуноферментно-го анализа (ИФА) с применением двух коммерческих наборов реагентов: “ИФА ТС АГ ВКЭ” по ТУ 9388-08514237183-09 на основе поликлональных антител к вирусу клещевого энцефалита производитель и “ВектоВКЭ-антиген” по ТУ 9398-087-23548172-2007 на основе моноклональных антител к белку Е этого вируса. Постановку анализа осуществляли в соответствии с инструкциями по применению наборов. Титр антигенной активности и расчетную концентрацию вирусного белка в СОП с каждым из диагностических наборов определяли в опытах параллельного титрования в ИФА аттестуемого СОП и референс-препарата в нескольких независимых испытаниях. В каждом опыте сравниваемые образцы референспрепарата и СОП анализировали в двух повторах одновременно (на одном и том же планшете), приготовив ряды последовательных двукратных разведений.

В качестве референс-препарата (стандарта) для количественного определения вирусного белка был взят препарат высокоочищенного концентрированного белка Е вируса КЭ (партия № 41) в Трис-буферном растворе с добавлением натрия хлорида и ЭДТА с установленным содержанием общего белка (160 мкг/мл), поступивший из ЗАО “Вектор-Бест”, предоставленный нам ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Препарат в замороженном виде посту-

Таблица 1

Физико-химические характеристики СОП №010810 “вакцинного” антигена вируса КЭ

Наименование показателя	Метод определения	Фактические аналитические данные
		НПО “Вирион”	ГИСК им. Л.А. Тарасевича
Описание	Визуальный	Пористая масса	Пористая масса
		белого цвета	белого цвета
Средняя масса содержимого ампулы Точность разлива в лиофи-	ГФ XI, вып.2, с.142	35,18 мг	34,8 мг
лизированном препарате (коэффициент вариации) Потеря в массе при	МУК 4.1/4.2.588-96, с.117	2,0%	1,35 %
высушивании	ГФ XI, вып.1, с.176	2,2%	2,3%
рН	Потенциометрический метод, ГФ XII, ч.1, с.89	7,42	7,40
Содержание общего белка	Метод Лоури, ГФ XII, ч.1, с.108	16,4 мкг/ампула	13,3 мкг/ампула
Содержание сахарозы	Колориметрический метод с антроновым реактивом, МУК 4.1/4.2.588-96, с.75	26,4 мг/ампула	25,0 мг/ампула

пил в октябре 2010 г. Условия хранения – при температуре минус 70 °С.

Количественную статистическую обработку результатов иммуноферментного анализа методом параллельных линий и расчет концентрации вирусного белка в СОП проводили с санкционированным использованием компьютерной программы “Паралайн”, разработанной в ГИСК им. Л.А. Тарасевича (автор – Петухов В.Г.) в соответствии с рекомендациями ВОЗ. Математической основой программы является дисперсионный анализ. Программа по данным ИФА (значениям оптических плотностей в зависимости от дозы титруемых препаратов) в автоматическом режиме вычисляет активность испытуемого препарата относительно стандарта, доверительные интервалы этой активности для вероятности (Р) 95%, критерии линейность и параллелизм для графиков зависимости логарифма оптической плотности от логарифма дозы у сравниваемых препаратов. Концентрацию специфичного вирусного белка в СОП и дисперсию этого показателя для Р=95% в каждом испытании, отвечающем условиям линейности и параллелизма графиков, рассчитывали по формуле:

С (С_min, С_max) = А (А_min, А_max) ⋅ 160 мкг/мл, где

С – расчетная концентрация вирусного белка в СОП (мкг/мл), установленная в опыте, а Сmin и Сmax – соответственно нижняя и верхняя границы дисперсии этого показателя;

• А, А_min, А_max – вычисленные программой для данного опыта значения относительной активности СОП и ее дисперсия;

• 160 мкг/мл – установленное значение (паспортные данные) концентрации белка в референс-препарате;

Средние арифметические значения концентрации специфичного вирусного белка в СОП и значения дисперсии по результатам всех анализов (отдельно для каждого диагностического набора) вычисляли с использованием компьютерной программы Microsoft Office Excel 2003.

Результаты и обсуждение

Для достоверных расчетов концентрации вирусного белка в СОП серии №010810 относительно выбранного стандарта белка Е (партии №41) статистической обработке методом параллельных линий подвергали данные их совместного титрования в ИФА, отвечающие критериям “линейность” и “параллелизм”. Поэтому сначала для каждого применяемого диагностического набора установили разведения сравниваемых образцов, позволяющие получать в результате анализа линейную зависимость регистрируемой оптической плотности от концентрации (дозы) соответствующего образца, а также параллельные кривые регрессии этой зависимости для стандарта и испытуемого препарата. Исходные и анализируемые разведения препаратов готовили на буферном растворе для разведения образцов из используемого диагностического набора. Содержимое ампул с СОП сначала растворяли до первоначального объема (0,5 мл) в воде очищенной.

При анализах с использованием набора “ВектоВКЭ-антиген” выше указанным требованиям соответствова-

Таблица 2

Специфические характеристики СОП №010810 «вакцинного» антигена вируса КЭ при аттестации в ИФА с диагностическим набором «ИФА ТС АГ ВКЭ»

Номер исследования	Титр стандарта белка Е ВКЭ (партия № 41)	Титр СОП №010810	Расчетная концентрация (С) вирусного белка в СОП относительно стандарта
			Сmin, мкг/мл	С, мкг/мл	Сmax, мкг/мл
1	1:10240	1:1024	7,88	12,43	20,46
2	1:20480	1:1024	7,76	9,24	11,04
3	1:10240	1:1024	6,96	8,54	10,34
4	1:10240	1:1024	9,07	10,00	11,00
5	1:10240	1:512	9,05	10,45	11,92
6	1:20480	1:512	7,21	9,22	12,06
7	1:20480	1:512	6,28	7,42	8,85
8	1:10240	1:1024	10,63	11,30	12,00
9	1:10240	1:1024	9,91	11,14	12,48
10	1:10240	1:1024	10,98	11,50	12,04
11	1:10240	1:1024	10,62	11,32	12,05
12	1:10240	1:1024	8,65	9,87	11,21
Среднее значение			8,75	10,20	12,12

ли концентрации стандарта белка Е в диапазоне разведений от 1:8000 до 1:128000 и аттестуемого СОП – от 1:2000 до 1:16000 с двукратным шагом. Для набора “ИФА ТС АГ ВКЭ” с закономерно меньшей чувствительностью анализа – белка Е от 1:1280 до 1:20480 и СОП от 1:64 до 1:1024 с двукратным шагом. Соотношение разведений стандарта белка Е и аттестуемого СОП учитывали при внесении данных (обозначении доз) для статистической обработки результатов ИФА в программе “Паралайн”.

Для аттестации СОП “вакцинного” антигена в период с 08.11.10 г. по 10.12.10 г. в разных лабораториях, разными сотрудниками “НПО “Вирион” было проведено 12 постановок определения вируса КЭ с диагностическим набором “ИФА ТС АГ ВКЭ” и 13 постановок определения белка Е вируса КЭ методом ИФА с диагностическим набором “ВектоВКЭ-антиген”. В этих исследованиях при параллельном титровании образцов референс-препарата и СОП (из разных ампул) определяли титр специфического антигена в них (предельное разведение, дающее положительную иммуноферментную реакцию) и расчетную концентрацию вирусного белка в аттестуемом СОП.

В настоящее время при изготовлении вакцины Энце-Вир действующей нормативной документацией предусмотрен анализ и установлены лимиты специфической антигенной активности ее полуфабрикатов на разных технологических стадиях с использованием набора “ИФА ТС АГ ВКЭ”. Применение в этих анализах СОП “вакцинного” антигена, аттестованного по содержанию вирусного белка, могло бы способствовать повышению достоверности их результатов и стандартизации изготавливаемых серий по специфической антигенной активности, а в конечном итоге оптимизировать количественное содержание вирусного белка в готовой вакцине. С этой целью одной из наших задач являлась аттестация СОП по содержанию специфичного вирусного белка, определяемого этой методикой. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Диагностический набор “ИФА ТС АГ ВКЭ” на основе очищенных поликлональных антител к вирусу КЭ и ат- тестованная методика его применения позволяет специфично и с хорошей чувствительностью определять вирусные белки в полуфабрикатах вакцины ЭнцеВир, основное количество которых представлено белком Е (gpE) в составе оболочки вирионов. Одновременно этой методикой определяются неструктурные вирусные белки, которые присутствуют в полуфабрикатах вакцины, особенно на ранних стадиях технологии, и могут в некотором количестве попадать в готовый препарат. С использованием данной методики мы получали адекватные результаты определения антигенной активности в полуфабрикатах серий ЭнцеВир на протяжении всего периода ее производства. Приемлемые результаты были получены при апробации методики для количественного определения вирусного белка в заключительном полуфабрикате вакцины (до сорбции на гидроокиси алюминия), но не в готовом сорбированном препарате. С использованием набора “ИФА ТС АГ ВКЭ” и аттестованного СОП серии № 010810 (табл. 2) расчетные значения концентрации вирусного белка в исследованных сериях готовой вакцины оказались значительно ниже, чем следовало ожидать из полученных результатов аналогичного параллельного определения в полуфабрикатах этих же серий до сорбции.

По рекомендации экспертов ГИСК им. Л.А. Тарасевича в нормативную документацию на ЭнцеВир необходимо внести показатель количественного содержания вирусного белка в готовом сорбированном препарате, методику его определения и значение показателя на оптимальном уровне, обеспечивающем достаточную эффективность применения вакцины при отсутствии побочных эффектов. В предварительно проведенных экспериментах было установлено, что диагностический набор “Век-тоВКЭ-антиген” на основе моноклональных антител к gpЕ вируса КЭ позволяет с высокой чувствительностью определять вирусный белок как в заключительном полуфабрикате, так и в сорбированной вакцине ЭнцеВир в сопоставимых значениях. То есть этой методикой возможно адекватное количественное определение основного им-

Таблица 3

Специфические характеристики СОП № 010810 “вакцинного” антигена вируса КЭ при аттестации в ИФА с диагностическим набором “ВектоВКЭ-антиген”

Номер исследования	Титр стандарта белка Е ВКЭ (партия №41)	Титр СОП №010810	Расчетная концентрация (С) вирусного белка в СОП относительно стандарта
			Сmin, мкг/мл	С, мкг/мл	Сmax, мкг/мл
1	1:128000	1:8000	9,60	13,55	18,24
2	1:128000	1:8000	12,83	15,59	18,58
3	1:128000	1:8000	15,52	16,72	17,96
4	1:64000	1:8000	16,47	18,31	20,28
5	1:64000	1:8000	16,60	18,30	20,12
6	1:128000	1:8000	12,99	13,74	14,51
7	1:128000	1:8000	9,75	11,49	13,31
8	1:128000	1:8000	9,45	12,41	15,93
9	1:128000	1:8000	15,03	16,34	17,70
10	1:128000	1:8000	13,58	17,65	22,43
11	1:64000	1:8000	17,67	21,69	26,28
12	1:64000	1:8000	18,55	19,78	21,06
13	1:64000	1:8000	15,83	20,13	24,54
Среднее значение			14,14	16,59	19,30

татам трех независимых испытаний среднее значение содержания вирусного белка Е в образцах СОП составило 17,78 мкг/мл с отклонениями min=15,24 мкг/мл, max=20,80 мкг/мл. Сведения получены из отчета по теме научно-исследовательских работ “Разработка метода определения количественного содержания вакцинного антигена в вакцине клещевого энцефалита Энце-Вир”, утвержденного директором ФГБУ ГИСК им. Л.А. Тарасевича Минздравсоцразвития России И.В. Борисевичем 30.12.2010 г. (ответственный исполнитель –

муногенного белка вакцины (gp Е) при анализе образцов готового препарата ЭнцеВир, при выпуске. С целью дальнейшего изучения и внедрения методики в технологию вакцины и ее предреализационный контроль мы провели аттестацию изготовленного СОП “вакцинного” антигена серии № 010810 с применением диагностического набора “ВектоВКЭ-антиген”. Результаты этих исследований даны в таблице 3.

Из материалов исследований по аттестации СОП “вакцинного” антигена серии №010810 с использованием двух методик определения вируса клещевого энцефалита, представленных в таблицах 2, 3, можно сделать вывод о стандартности повторяемых многократно (в разное время и в разных условиях) постановок ИФА с каждым из диагностических наборов. Так, в аналогичных постановках регистрировались одинаковые или различающиеся на 1 шаг значения титра для каждого из сравниваемых препаратов: стандарта белка Е и СОП. Концентрация вирусного белка в испытуемом СОП, установленная в испытаниях с набором “ИФА ТС АГ ВКЭ” составила: 10,20 мкг/мл среднее значение, с отклонениями min=8,75 мкг/мл, max=12,12 мкг/мл (т.е в интервале от 85,8 до 118,8% от среднего значения). Концентрация гликопротеина Е в испытуемом СОП, установленная в испытаниях с набором “ВектоВКЭ-антиген” составила: 16,59 мкг/мл среднее значение, с отклонениями min=14,14 мкг/мл, max=19,30 мкг/мл (т.е в интервале от 85,2 до 116,3% от среднего значения). Эти статистические показатели, на наш взгляд, свидетельствуют о хорошей воспроизводимости результатов иммуноферментно-го анализа, и полученные значения содержания вирусного белка в СОП можно считать приемлемыми.

Аттестация СОП серии 010810 по количественному содержанию белка Е, выполненная по сходной методике (методом ИФА с использованием наборов “ВектоВКЭ-ан-тиген”, расчетов относительно стандарта белка Е партии №41 и статистической обработкой результатов в компьютерной программе “Паралайн”) сотрудниками ГИСК им. Л.А. Тарасевича дала сопоставимые значения. По резуль- д.м.н. М.С. Воробьева, заведующая лабораторией арбови-русных инфекций, риккетсиозов и СПИДа).

Заключение

Проведена аттестация СОП “вакцинного” антигена, предназначенного для внедрения метода количественного определения протективного вирусного белка (гликопротеина Е) в технологию и контроль вакцины клещевого энцефалита ЭнцеВир. Среднее значение содержания белка Е в образцах СОП, установленное методом ИФА с использованием моноклональных антител к этому белку (набором “ВектоВКЭ-антиген”) и статистической обработкой результатов методом параллельных линий (компьютерной программой “Паралайн”), составило 8,30 мкг/ампула.

Использование аттестованного СОП “вакцинного” антигена в дальнейших исследованиях, направленных на аттестацию методики количественного определения вирусного белка в готовой вакцине ЭнцеВир, разработку приемлемого норматива значений этого показателя, изучение его стабильности, позволит в будущем стандартизовать выпускаемые серии этого препарата по содержанию активного компонента на эффективном и безопасном уровне.