Количественное содержание суммы фенольных соединений в траве володушки двустебельной (Bupleurum bicaule helm)

Введение. Растения природной флоры остаются одними из основных источников биологически активных веществ (БАВ), используемых во всем мире в целях профилактики и лечения различных заболеваний. В составе природной флоры важным и широко известным источником БАВ являются растения рода Bupleurum L., с давних времен используемые в традиционной медицине как средства, обладающие гепатопротекторной, желчегонной, противовоспалительной, иммунорегуляционной, антибактериальной и противовирусной активностями [1] . Однако представители этого рода до сих пор остаются практически не изученными с ботанической, химической и фармакологической точек зрения. Особенно это касается видов ( B. longifolium, B. sibiricum, B. bicaule и B. scorzonerifolium ) и их популяций из относительно малоосвоенных семиаридных и аридных районов, к каковым относятся значительные территории регионов Внутренней Азии (Бурятия, Забайкальский край, Монголия). Соединения фенольной природы, в частности флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты, являются действующими веществами надземной части растений рода Bupleurum L. Именно они обусловливают спектр фармакологической активности травы воло-душки, такой как желчегонная, противовоспалительная и др.

Ранее Д. Н. Оленниковым определено содержание и состав флавоноидов и фенилпропаноидов в надземных частях B. bicaule, B. longifolium, B. multinerve, B. scorzonerifolium и B. triradiatum [2] . Также для надземных частей B. scorzonerifolium и B. longifolium разработаны и предложены методики количественного определения фенольных соединений и показатели доброкачественности сырья [3; 4] . Не менее перспективным видом для внедрения в медицинскую практику является володушка двустебельная ( Bupleurum bicaule Helm.), широко используемая в восточной традиционной медицине. Это многолетнее поликар-пическое растение 15‒35 см высотой с разветвленными каудексами [5] . В надземной части, корнях и плодах B. bicaule обнаружены кверцетин, изорам-нетин, рутин; в надземной части и плодах — изокверцитрин, нарциссин; в корнях — кемпферол [6] . Таким образом, разработка методик количественного определения суммы флавоноидов и суммы фенолкарбоновых кислот является важным этапом стандартизации нового вида лекарственного растительного сырья с целью его внедрения в отечественную фармакопею.

В настоящей работе представлены результаты разработки методик количественного определения суммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот и их содержание в траве B. Bicaule .

Материалы и методы

Объектами исследования служили образцы володушки двустебельной травы, собранные в ходе экспедиционных работ в 2018–2019 гг. на территории России (Республики Бурятия) в период массового цветения.

Качественные реакции проводили на спиртовом извлечении общепринятыми методами [7] , а также с использованием высокоэффективного жидкостного хроматографа «Милихром А-02» (ЗАО «ЭКОНОВА»). Разделение осуществляли с помощью колонки «ProntoSil-120-C18 AQ» (2*75 мм, 5 мкм). Подвижная фаза: элюент А — 0,1; раствор трифторуксусной кислоты; элюент Б — ацетонитрил. Скорость потока: 100 мкл/мин. Детектирование проводили с помощью УФ-детектора при длине волны 210–300 нм. Температура колонки — 35 °С.

Измерение оптической плотности исследуемых растворов проводили на спектрофотометре «СФ-46» в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см. Количественное определение дубильных веществ проводили методом окислительно-восстановительного титрования по методу 1 ОФС.1.5.3.0008.15 «Определение содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах» Государственной фармакопеи Российской Федерации XIV издания.

Результаты и обсуждение

Качественное обнаружение соединений фенольной природы

В результате проведенных общепринятых качественных реакций в надземной части володушки двустебельной обнаружены флавоноиды и дубильные вещества. Методом ВЭЖХ подтверждено наличие хлорогеновой кислоты и рутина. Идентификацию хлорогеновой кислоты и рутина осуществляли при сравнении с растворами СО по спектрам поглощения и времени удерживания (рис. 1–4).

—•— Пик

• • Компонент

1,3

1,2

1,1

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

330     350

190     210     230     250     270     290     310

Длина волны, нм

Рисунок 1. УФ-спектры хлорогеновой кислоты растворов СО и спиртового извлечения надземной части B. bicaule

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

-—*— Пик

— ♦ — Компонент

190     210     230     250     270     290     310     330     350

Длина волны, нм

Рисунок 2. УФ-спектры рутина растворов СО и спиртового извлечения надземной части B. bicaule

Время, мин

Рисунок 3. Фрагмент хроматограммы смеси растворов СО хлорогеновой кислоты и рутина

Рисунок 4. Фрагмент хроматограммы спиртового извлечения надземной части B. bicaule (Хоринский район, Бурятия)

Разработка методик количественного определения суммы флавоноидов и суммы фенолкарбоновых кислот

При изучении спектров поглощения спиртового извлечения из володушки двустебельной травы и комплекса алюминия хлорида с спиртовым извлечением из володушки двустебельной травы установлено наличие максимумов поглощения при 325 нм и 410 нм соответственно, что, в свою очередь, совпадает с максимумами поглощения раствора стандартного образца хлорогеновой кислоты и комплекса стандартного образца рутина с алюминием хлоридом.

Подбор условий при разработке методик количественного определения фенольных соединений проводили в зависимости от типа экстрагента, степени измельчения сырья, соотношения сырье — экстрагент, времени экстракции. При подборе наилучшего экстрагента использовали сырье, проходящее сквозь сито с отверстиями размером 1 мм. В качестве экстрагента брали спирт этиловый разной концентрации. Соотношение сырье — экстрагент — 1:100. Полученные данные представлены в таблице 1.

Таблица 1

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и суммы фенолкарбоновых кислот в B. bicaule herba в зависимости от типа экстрагента

№	Экстрагент	Сумма флавоноидов в пересчете на рутин, %	Сумма фенолкарбоновых кислот
1	Вода очищенная	0,98±0,04	1,73±0,08
2	Спирт этиловый 10%	2,26±0,09	2,28±0,05
3	Спирт этиловый 20%	2,69±0,05	2,62±0,10
4	Спирт этиловый 30%	3,38±0,10	2,85±0,13
5	Спирт этиловый 40%	3,31±0,15	3,40±0,10
6	Спирт этиловый 50%	3,22±0,07	3,56±0,10
7	Спирт этиловый 60%	3,47±0,17	3,76±0,10
8	Спирт этиловый 70%	3,49±0,06	4,02±0,17
9	Спирт этиловый 80%	3,45±0,09	3,73±0,14
10	Спирт этиловый 90%	3,07±0,04	3,72±0,17
11	Спирт этиловый 95%	2,90±0,07	3,41±0,12

Оптимальным экстрагентом, позволяющим извлечь наибольший выход суммы флавоноидов: 3,47, 3,49 и 3,45%, является спирт этиловый в концентрации 60, 70 и 80% соответственно. Наибольший выход суммы фенолкарбоновых кислот наблюдается при экстракции 70%-ным спиртом этиловым — 4,02%. Таким образом, нами предложено использовать спирт этиловый 70%, при котором наблюдается наибольший выход как флавоноидов, так и фенолкарбоновых кислот.

Было использовано сырье, проходящее сквозь сито с диаметром отверстий 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0 мм для выбора оптимальной степени измельчения (табл. 2). В качестве экстрагента использовали спирт этиловый 70%. Соотношение сы-рье:экстрагент — 1:100. Наибольший выход суммы фенольных соединений наблюдался для сырья, проходящего сквозь сито с диаметром отверстий 1,0 мм: сумма флавоноидов —3,50%; сумма фенолкарбоновых кислот — 4,02%.

Таблица 2

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и суммы фенолкарбоновых кислот в B. bicaule herba в зависимости от степени измельчения сырья

№	Сырье, проходящее сквозь сито с отверстиями размером, мм	Сумма флавоноидов в пересчете на рутин, %	Сумма   фенолкарбоновых кислот
1	0,5 мм	3,21±0,06	3,74±0,05
2	1,0 мм	3,50±0,09	4,02±0,06
3	2,0 мм	3,23±0,14	3,71±0,06
4	3,0 мм	3,18±0,08	3,63±0,10
5	5,0 мм	2,91±0,10	3,14±0,11

Для выявления оптимального времени экстракции сырье экстрагировали в течение 30, 60, 90 и 120 мин. В качестве экстрагента использовали спирт этиловый 70%. Соотношение сырье — экстрагент — 1:100 (табл. 3).

Таблица 3

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и суммы фенолкарбоновых кислот в B. bicaule herba в зависимости от времени экстракции

№	Время экстракции, мин	Сумма флавоноидов в пересчете на рутин, %	Сумма фенолкарбоновых кислот
1	30	3,30±0,16	3,62±0,07
2	60	3,49±0,12	4,02±0,12
3	90	3,49±0,15	4,00±0,10
4	120	3,48±0,10	3,99±0,13

Наибольший выход суммы флавоноидов и суммы фенолкарбоновых кислот наблюдается при экстракции в течение 60 мин. Дальнейшая экстракция до 120 мин не приводит к увеличению выхода фенольных соединений.

Следующим этапом мы подобрали оптимальные условия выхода основных биологически активных веществ при разных соотношениях сырье — экстрагент (табл. 4).

Таблица 4

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и суммы фенолкарбоновых кислот в B. bicauli herba в зависимости от соотношения сырье — экстрагент

№	Соотношение сырье — экстрагент	Сумма флавоноидов в пересчете на рутин, %	Сумма фенолкарбоновых кислот
1	1:25	2,54±0,09	3,04±0,14
2	1:50	3,12±0,10	3,54±0,15
3	1:75	3,36±0,08	3,87±0,13
4	1:100	3,49±0,09	4,02±0,11
5	1:150	3,49±0,14	4,01±0,12
6	Вариант экстракции (трехкратная экстракция при соотношении сырье ‒ экстрагент ‒ 1:30 и времени экстракции: 60, 30, 30)	3,46±0,17	4,00±0,08

Полученные данные свидетельствуют о том, что оптимальным соотношением сырья и экстрагента является 1:100. Использование данного соотношения является оптимальным и соответствует исчерпывающей экстракции (№ 6, табл. 4; в шроте после исчерпывающей экстракции пробой Синода флавоноиды методом ТСХ и фенолкарбоновые кислоты не были обнаружены).

Для разрабатываемой методики количественного определения суммы флавоноидов нами подобраны оптимальные условия комплексообразования со спиртовым раствором алюминия хлорида (табл. 5).

Таблица 5

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в B. bicauli herba в зависимости от объема и концентрации AlCl 3

Объем
№	Объем AlCl 3 , мл	Сумма флавоноидов в пересчете на рутин, %
1	1	3,38±0,02
2	2	3,49±0,09
3	3	3,49±0,11
4	4	3,39±0,08
5	5	3,43±0,14
Концентрация
№	Концентрация AlCl 3 , %	Сумма флавоноидов в пересчете на рутин, %
1	1	3,38±0,04
2	2	3,49±0,09
3	3	3,48±0,11
4	4	3,23±0,10
5	5	3,34±0,12

Показано, что для полной реакции комплексообразования достаточно использовать 2%-ной спиртовой раствор алюминия хлорида в количестве 2 мл. Таким образом, разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов и суммы фенолкарбоновых кислот в B. bicauli herba .

Методика определения суммы флавоноидов:

Приготовление растворов. Раствор стандартного образца (СО) рутина: около 0,05 г (точная навеска) рутина, предварительно высушенного при температуре 130–135 °С в течение 3 ч, растворяют в 40 мл 96%-го спирта этилового в мерной колбе вместимостью 100 мл. В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл полученного раствора и доводят его объем до метки 50%-ным этиловым спиртом и перемешивают.

2%-ный спиртовой раствор алюминия хлорида: 2 г алюминия хлорида растворяют в 50 мл 95%-го спирта этилового в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

Пробы сырья измельчают до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в плоскодонную колбу с притертой пробкой вместимостью 250 мл и прибавляют 100 мл 70%-го этилового спирта. Колбу с содержимым присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин. После охлаждения извлечение фильтровали через бумажный фильтр, отбрасывая первые 10 мл фильтрата (раствор А).

В мерную колбу объемом 25 мл вносят 1,0 мл раствора А, прибавляют 2 мл спиртового раствора алюминия хлорида 2% (раствор Б) и доводят 95%-ным этиловым спиртом до метки. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм через 40 мин после добавления реактива. В качестве сравнения используют раствор, состоящий из 1,0 мл раствора А, капли уксусной кислоты 10%, помещенный в мерную колбу вместимостью 25 мл и доведенный 95%-ным этиловым спиртом до метки. Парал- лельно измеряют оптическую плотность раствора СО рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в % вычисляют по формуле:

D X т₀ X 100 X 100

X Do x m x (100 - WZ)J где D — значение оптической плотности испытуемого образца (раствор Б); D0 — значение оптической плотности рутина; m — масса сырья, г; m0 — масса рутина, г; W — потеря в массе при высушивании сырья в %.

Методика определения суммы фенолкарбоновых кислот:

Пробы сырья измельчают до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в плоскодонную колбу с притертой пробкой вместимостью 250 мл и прибавляют 100 мл этилового спирта 70%. Колбу с содержимым присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 минут. После охлаждения извлечение фильтровали через бумажный фильтр, отбрасывая первые 10 мл фильтрата (раствор А).

В мерную колбу объемом 50 мл вносят 0,5 мл раствора А и доводят 95%-ным этиловым спиртом до метки (раствор Б). Оптическую плотность полученного раствора измеряют в кюветах с толщиной слоя 10 мм на спектрофотометре при длине волны 325 нм. Раствором сравнения служит спирт этиловый 95%.

Содержание суммы фенолкарбоновых кислот в пересчете на абсолютно-сухое сырье в % вычисляют по формуле:

D X 100 X 50 X 100 у ₌______________________ m x 504,425 x 0,5 x (100 - W)'

где D — значение оптической плотности испытуемого раствора (раствор Б); m — масса сырья; W — потеря в массе при высушивании сырья, %; 504,425 — удельный показатель поглощения 3-О-кофелхинной (хлорогеновой) кислоты (при 325 нм).

Метрологическая характеристика результатов количественного определения представлена в таблице 6.

Таблица 6

Метрологическая характеристика результатов количественного определения суммы флавоноидов и суммы фенолкарбоновых кислот в B. bicauli herba

f                  \	̅х̅, %	S                 1	Sх̅                 1	P, %	t(P, f)	Δx	E, %
сумма флавоноидов
8 \	3,49	0,06954	0,02318	95          1	2,3         1	0,05	±1,53
сумма фенолкарбоновых кислот
8 \	4,02	0,13812	0,04604	95          1	2,3         1	0,11	±2,64

Ошибка методики количественного определения суммы флавоноидов составила ±1,53% при 9 независимых определениях; суммы фенолкарбоновых кислот, — ±2,64% при 9 независимых определениях.

Разработанными методиками проведено количественное определение суммы флавоноидов и суммы фенолкарбоновых кислот в пяти сериях полупромышленных партий сырья. Рекомендуемая норма содержания суммы флавоноидов в траве володушки двустебельной составляет не менее 2%; суммы фенолкарбоновых кисло — не менее 2,5%.

Данные методики валидны и соответствуют параметрам: специфичность, прецизионность, правильность и линейность. Они рекомендуются для включения в проект фармакопейной статьи «Володушки двустебельной трава — Bupleuri bicauli herba ».

Количественное определение суммы фенольных соединений

Впервые с использованием разработанных нами методик установлено содержание суммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в траве B. bicaule из разных мест произрастания, а также содержание суммы дубильных веществ стандартной методикой (табл. 8).

Характеристика объектов исследования, суммарное содержание фенольных соединений в B. Bicaule

Таблица 8

Места сбора образцов	Сумма флавоноидов, %	Сумма фенолкарбоновых кислот, %	Сумма дубильных веществ, %
B. bicaule
РФ, РБ, Хоринский район, окр. с. Удинск	3,49±0,09	4,02±0,11	11,22±0,32
РФ, РБ, Еравнинский район, окр. с. Можайка	3,54±0,12	4,13±0,15	11,28±0,38
РФ, РБ, Мухоршибирский район, окр. с. Хошун-Узур	3,53±0,07	4,07±0,08	10,27±0,36

Содержание суммы флавоноидов составило от 3,49±0,09% до 3,54±0,12%. Содержание суммы фенолкарбоновых кислот в траве B. bicaule составило от 4,02±0,11 до 4,13±0,15%; дубильных веществ — от 10,27±0,36% до 11,28±0,38%.

Согласно полученным данным не выявлено принципиального различия в содержании фенольных соединений надземной части володушки двустебельной, собранной в разных местах произрастания. Однако относительно высокое содержание данных БАВ было обнаружено в сырье, собранном в Еравнинском районе Республики Бурятия, что, вероятно, связано с условиями произрастания вида.

Выводы. В результате проведенных исследований показано, что трава воло-душки двустебельной является богатым источником флавоноидов, фенолкарбоновых кислот и дубильных веществ и может быть использована как дополнительное сырье к траве володушки козельцелистной, володушки золотистой и во-лодушки многожильчатой, используемых в традиционной медицине в качестве гепатопротекторных и желчегонных средств.