Колонизирующая активность коллекционных штаммов антагонистов возбудителя фомоза рапса озимого во влажной камере

Бесплатный доступ

С целью проведения вторичного скрининга коллекционных штаммов антагонистов к одной из наиболее опасных и вредоносных болезней рапса озимого – фомозу, нами был модифицирован метод искусственного заражения проростков во влажной камере «Перфорированные чашки Петри». Подобран оптимальный срок выдержки кончиков корней проростков на колонии патогена (2 часа), а также разработана пятибалльная шкала учета степени поражения корней проростков рапса озимого фомозом. Во вторичном скрининге на среднем фоне искусственного заражения проростков рапса озимого возбудителем фомоза (60 %) выделено 23 перспективных грибных и 24 бактериальных штамма с биологической эффективностью 50,0–100 %. Максимальный защитный эффект проявили: 14 грибных штаммов (Pv-3 Penicillium verrucosum,Pf-1 P. funiculosum, Pbc-1 P. brevi–compactum, Pp-1 P. purpurescens, Т-1, Т-3 и T-4 Trichoderma sp., Tk-1 Trichoderma koningii, T-5 Trichoderma asperellum,M-24 Talaromyces flavus, M-1 Metarhizium sp., SM-1 Sordaria macrospora, Tt-1 Talarоmyces trachispermus, Xk-2 Chaetomium olivaceum) с эффективностью 100 %; три бактериальных штамма из рода Bacillus (D 1-1, 11-3 и 5-3 Bacillus sp.) с эффективностью 100 % и два бактериальных штамма из рода Pseudomonas (12-2 и Sgc-1 Pseudomonas sp.) с эффективностью 66,7 %.

Еще

Колонизирующая активность, фомоз рапса, штаммы антагонисты, Phoma lingam, биологическая защита

Короткий адрес: https://sciup.org/142247792

IDR: 142247792   |   УДК: 633.853.494:632.937   |   DOI: 10.25230/2412-608X-2026-1-205-100-106

Colonization activity of the collected antagonist strains of the Phoma black stem pathogen of winter rapeseed in a humidity chamber

In order to conduct secondary screening of a collection of antagonist strains against Phoma black stem – one of the most dangerous and destructive diseases affecting winter rapeseed – we modified the method of artificial infection of seedlings in a humidity chamber using “perforated Petri dishes”. We established that the optimal exposure time for the root tips of the seedlings to the pathogen colony was two hours, and we developed a fivepoint scale to assess the degree of Phoma black stem affection of the winter rapeseed seedlings' roots. Secondary screening against a background of moderate artificial infection of winter rapeseed seedlings with the Phoma black stem pathogen (60%) identified 23 promising fungal strains and 24 bacterial strains with biological efficiencies of 50.0–100%. The maximum protective effect was demonstrated by: 14 fungal strains (Pv3 Penicillium verrucosum, Pf1 P. funiculosum, Pbc1 P. brevicompactum, Pp1 P. purpurescens, T1, T3 and T4 Trichoderma sp., Tk1 Trichoderma koningii, T5 Trichoderma asperellum, M24 Talaromyces flavus, M1 Metarhizium sp., SM1 Sordaria macrospora, Tt1 Talaromyces trachispermus and Xk2 Chaetomium olivaceum), which were 100% efficient; three bacterial strains belonging to the genus Bacillus (D 11, 113 and 53 Bacillus sp.), which were also 100% efficient; and two other bacterial strains belonging to the genus Pseudomonas (122 and Sgc1 Pseudomonas sp.), which were 66.7% efficient.

Еще

Текст научной статьи Колонизирующая активность коллекционных штаммов антагонистов возбудителя фомоза рапса озимого во влажной камере

Научная статья УДК 633.853.494

Введение. Одна из наиболее опасных и вредоносных в настоящее время болезней рапса (Brassica napus L.) – фомоз (рак стебля, или сухая гниль, капустных). В центральной зоне Краснодарского края возбудителем болезни является Leptospha- eria maculans (Desm.) Ces. et de Not, анаморфная стадия Phoma lingam (Tode) Desm. [1]. Болезнь поражает как всходы, так и взрослые растения. При инфицировании проростков рапса патоген может вызывать их гибель, а при поражении взрослых растений снижаются качественные и количественные характеристики урожая, при этом потери урожая могут достигать 40 % [2–4].

Эффективная борьба с болезнями растений предполагает комплексный подход, включающий: использование устойчивых сортов, своевременную уборку растительных остатков, соблюдение севооборота (рапс можно возвращать на прежнее место не раньше чем через 3–4 года), выбор оптимальных сроков посева, инкрустацию семян и опрыскивание растений фунгицидами в период вегетации [5]. В последние годы набирает оборот применение экологически безопасных микробиопрепаратов на основе штаммов микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности. Так, в 2025 г. против возбудителя фомоза рапса в РФ было зарегистрировано два микробиологических препарата: Системика М, Ж на основе Bacillus mojavensis и Баксис, Ж на основе Bacillus subtilis . Целесообразно расширение списка эффективных зарегистрированных микробиопрепаратов для снижения вредоносности фомоза рапса озимого.

В лаборатории биометода агротехноло-гического отдела ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК разработана концепция целенаправленного создания микробиопрепаратов для защиты масличных и других сельскохозяйственных культур от болезней. Она базируется на поиске безопасных для человека и нефитотоксичных штаммов антагонистов, подавляющих комплекс патогенов в различных погодных условиях и обладающих полифункциональным действием [6]. С 2024 г. ведется поиск эффективных штаммов антагонистов к возбудителю фо-моза рапса озимого в анаморфной стации Phoma lingam (Tode) Desm. В результате первичного скрининга было выделено: 26 перспективных грибных штаммов, 21 бактериальный – из рода Bacillus и девять – из рода Pseudomonas, проявивших антифунгальную активность in vitro [7; 8]. При отборе антагонистов принципиальное значение имеет не только их способность проявлять защитные свойства, но и способность штаммов обеспечивать колонизацию растущего корня проростка.

Данная работа посвящена второму этапу вторичного скрининга – определению колонизирующей активности штаммов антагонистов, выделенных в результате первичного скрининга, на фоне искусственного заражения рапса возбудителем фомоза во влажной камере.

Материалы и методы. Для определения колонизирующей активности перспективных штаммов антагонистов модифицировали метод искусственного заражения проростков подсолнечника возбудителем фузариоза «Перфорированные чашки Петри » (Антонова, Саукова, 2005) [9]. Для этого подбирали оптимальный срок (один, два и три часа) выдержки кончиков корней проростков рапса озимого на колонии заранее выращенного патогена. Для оценки степени поражения проростков рапса возбудителем фомоза разрабатывали шкалу.

Возбудителя фомоза и антагонистов выращивали на агаризированных питательных средах: патоген – на карто-фельно-сахарозном агаре (КСА) [10], антагонистов – на специализированных средах: для бактерий рода Bacillus – Тайлона-3 [11], из рода Pseudomonas – Кинга В [12], а для грибов – Рудакова [13]. Выращенные культуры антагонистов пересевали на жидкие специализированные среды и выращивали на качалке при оборотах двигателя 180–200 об/мин при 25 °С, грибы – в течение 72 часов и бактерии – 48 часов. Определение титра жидкой культуры (ЖК) проводили методом серийных разведений [14]. Обработку семян рапса озимого сорта Лорис лабораторными образцами микробиопрепаратов проводили вручную в круглодонных колбах с нормой расхода препарата 3,0 л/т (за исключением грибов рода Tricho-derma – 1,0 л/т и штамма Pv-3 Penicillium verrucosum – 2,0 л/т) и рабочей жидкости 10 л/т. Обработанные семена рапса озимого проращивали во влажной камере в чашках Петри в течение двух суток. Кончики корней двухдневных проростков выдерживали на 10-суточном газоне патогена со 100 % зарастанием среды с оптимальным сроком выдержки – два часа. Контроль – необработанные биопрепаратом проростки, кончики корней которых также соприкасались с колонией патогена. Инфицированные проростки выдерживали в чашках Петри в условиях влажной камеры. Учет степени поражения проростков возбудителем фо-моза проводили на третьи сутки по разработанной нами шкале. Повторность опыта трехкратная.

Биологическую эффективность лабораторных образцов микробиопрепаратов определяли по формуле Аббота [14]:

С = 100 (a – b) / a, где С – биологическая эффективность, %;

a – количество больных растений в контроле, шт.;

b – количество больных растений в варианте, шт.

Результаты и обсуждение. Для определения колонизирующей активности выделенных в первичном скрининге перспективных штаммов антагонистов возбудителя фомоза рапса, первоначально модифицировали метод искусственного заражения «Перфорированные чашки Петри».

Для оценки степени поражения проростков рапса озимого возбудителем фо-моза нами была разработана шкала учета на третьи сутки после заражения (рис. 1): 0 баллов – здоровые проростки; 1 балл – потемнение между гипокотилем и корнем или кончика корня с обильным образованием боковых корней; 2 балла – потемнение корня на 1/3, хорошее развитие боковых корней; 3 балла – потемнение корня на 2/3, слабое развитие или отсутствие боковых корней; 4 балла – полное отгнивание корня; 0–2 – жизнеспособные проростки; 3–4 – нежизнеспособные проростки.

Рисунок 1 – Шкала оценки степени поражения проростков рапса озимого возбудителем фомоза на фоне искусственного заражения во влажной камере, 2024 г. (ориг.)

Fig. 1 – Scale for assessing the affection degree of winter rapeseed seedlings by the Phoma rot pathogen following artificial infection in a humidity chamber, 2024 (orig.)

Испытывали время выдержки проростков на колонии патогена в течение одного, двух и трех часов. При сроке выдержки кончиков корней проростков рапса озимого на колонии патогена в течение одного часа через трое суток сформировался средний фон поражения фомозом 50,0 % (в сильной степени по сумме третьего и четвертого балла нежизнеспособных проростков). При сроке выдержки кончиков корней проростков в течение двух часов поражение проростков фомозом в сильной степени составило 70,0 %. Увеличение срока выдержки до трех часов позволило сформировать жесткий фон поражения рапса озимого фомозом – 90,0 % (табл. 1).

Таблица 1 Степень поражения корней проростков рапса озимого сорта Лорис возбудителем фомоза в зависимости от срока выдержки кончиков корней на колонии па- тогена

ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, 2024 г.

Table 1

The degree of root affection in seedlings of the winter rapeseed variety Loris caused by the Phoma rot pathogen, depending on the duration of exposure of the root tips to the pathogen colony

V.S. Pustovoit All-Russian Research

Institute of Oil Crops, 2024

Срок выдержки кончиков корней на колонии патогена, час

Поражено корней проростков рапса озимого фомозом, %

степень поражения корня, баллы

всего (по 3 + 4 баллу)

0

1

2

3

4

1

20,0

30,0

0

50,0

0

50,0

2

0

20,0

10,0

50,0

20,0

70,0

3

0

0

10,0

70,0

20,0

90,0

Таким образом, для оценки колонизирующей активности лабораторных образцов микробиопрепаратов целесообразно использовать срок выдержки кончиков корней проростков рапса на колонии возбудителя фомоза в течение двух часов, при котором через трое суток сформировался фон заражения патогеном выше среднего – 70,0 %.

Следующим этапом изучали колонизирующую активность лабораторных образцов микробиопрепаратов на фоне искус- ственного заражения патогеном во влажной камере.

В контроле фон поражения корней проростков рапса озимого фомозом составил 60,0 %. На этом фоне все 23 испытанных коллекционных грибных штамма проявили высокую биологическую эффективность – 66,7–100 %. Максимальную колонизирующую активность проявили 14 штаммов (Pv-3 Penicillium verrucosum , Pf-1 P. funicu-losum , Pbc-1 P. brevi-compactum , Pp-1 P. purpurescens , Т-1, Т-3 и T-4 Trichoderma sp., Tk-1 Trichoderma koningii , T-5 Trichoderma asperellum , M-24 Talaromyces flavus , M-1 Metarhizium sp., SM-1 Sordaria macrospora , Tt-1 Talarоmyces trachispermus , Xk-2 Chae-tomium olivaceum ) – 100 %. У других штаммов (Хк-4 Chaetomium sp., Xk-3 Ch. glo-bosum , Хк-1 Ch. olivaceum , Pr-1 Penicillium rugulosum , Pk-1 P. vermiculatum , И-3 Basid-iomycota , Tr-1 Trichothecium roseum , A-1 Basidiomycota и T-2 Trichoderma sp.) установлена биологическая эффективность несколько ниже – 66,7 – 83,3 % (табл. 2).

Таблица 2

Влияние обработки семян рапса озимого сорта Лорис лабораторными образцами микробиопрепаратов на степень поражения корней проростков возбудителем фомоза Phoma lingam на фоне искусственного заражения методом «Перфорированные чашки Петри»

ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, 2024 г.

Table 2

The effect of treating seeds of the winter rapeseed variety Loris with laboratory samples of microbiopreparations on the degree of root affection in seedlings by the Phoma lingam pathogen following artificial infection using the “perforated Petri dish” method

V.S. Pustovoit All-Russian Research Institute of Oil Crops, 2024

Вариант

Титр, КОЕ/мл

Поражено корней проростков рапса озимого фомозом, %

Биологическая эффективность, %

степень поражения корня, баллы

всего (по 3 + 4 баллу)

0

1

2

3

4

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Контроль без обработки, с заражением

-

10,0

30,0

0

60,0

0

60,0*

-

Грибные штаммы антагонисты

Pv-3 Penicillium verrucosum   \

8,5 × 109J

30,0 1

50,0 1

20,0 1

0 1

0 1

0 1

100

Окончание таблицы 2

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Pf-1 Penicillium funiculosum

1,0 x 10 9

50,0

50,0

0

0

0

0

100

Pbc-1 Penicillium brevi-com-pactum

5,6 x 10 9

40,0

50,0

10,0

0

0

0

100

Pp-1 Penicillium purpurescens

2,0 x 10 9

20,0

50,0

30,0

0

0

0

100

T-1 Trichoderma sp.

2,8 x 10 9

50,0

50,0

0

0

0

0

100

T-3 Trichoderma sp.

3,8 x 10 9

40,0

50,0

10,0

0

0

0

100

T-4 Trichoderma sp.

3,5 x 10 9

30,0

40,0

30,0

0

0

0

100

Tk-1 Trichoderma koningii

9,5 x 10 8

20,0

70,0

10,0

0

0

0

100

T-5 Trichoderma asperellum

3,0 x 10 9

30,0

40,0

40,0

0

0

0

100

M-24 Talaromyces flavus

6,8 x 10 9

30,0

30,0

40,0

0

0

0

100

M-1 Metarhizium sp.

1,0 x 10 9

20,0

60,0

20,0

0

0

0

100

SM-1 Sordaria macrospora

7,8 x 10 7

30,0

30,0

40,0

0

0

0

100

Tt-1 Talarоmyces trachispermus

1,0 x 10 7

20,0

70,0

10,0

0

0

0

100

Xk-2 Chaetomium olivaceum

4,5 x 10 7

30,0

40,0

30,0

0

0

0

100

T-2 Trichoderma sp.

3,6 x 10 9

10,0

50,0

30,0

10,0

0

10,0

83,3

A-1 Basidiomycota

3,5 x 10 7

10,0

40,0

40,0

10,0

0

10,0

83,3

Tr-1 Trichothecium roseum

1,0 x 10 8

10,0

30,0

50,0

10,0

0

10,0

83,3

И-3 Basidiomycota

2,0 x 10 8

10,0

60,0

20,0

10,0

0

10,0

83,3

Pk-1 Penicillium vermiculatum

5,5 x 10 9

10,0

50,0

30,0

10,0

0

10,0

83,3

Pr-1 Penicillium rugulosum

3,0 x 10 9

50,0

40,0

0

10,0

0

10,0

83,3

Хк-1 Chaetomium olivaceum

7,0 x 10 8

20,0

70,0

0

10,0

0

10,0

83,3

Xk-3 Chaetomium globosum

5,0 x 10 7

0

80,0

10,0

10,0

0

10,0

83,3

Хк-4 Chaetomium sp.

2,0 x 10 8

0

60,0

20,0

20,0

0

20,0

66,7

Бактериальные штаммы антагонисты рода Bacillus

D 1-1 Bacillus sp.

1,5 x 1011

70,0

30,0

0

0

0

0

100

11-3 Bacillus sp.

7,0 x 1011

70,0

30,0

0

0

0

0

100

5-3 Bacillus sp.

5,0 x 1011

60,0

20,0

20,0

0

0

0

100

K 1-2 Bacillus sp.

3,3 x 1011

50,0

30,0

10,0

10,0

0

10,0

83,3

Fa 4-2 Bacillus sp.

1,0 x 1012

50,0

40,0

0

10,0

0

10,0

83,3

11-1 Bacillus sp.

5,2 x 1011

30,0

60,0

0

10,0

0

10,0

83,3

Fz-9 Bacillus sp.

1,8 x 1012

40,0

50,0

0

10,0

0

10,0

83,3

3-2 Bacillus sp.

6,0 x 1011

20,0

60,0

10,0

10,0

0

10,0

83,3

K 1-1 Bacillus subtilis

4,2 x 1011

40,0

30,0

20,0

10,0

0

10,0

83,3

P-9 Bacillus polymyxa

9,1 x 1011

40,0

30,0

20,0

10,0

0

10,0

83,3

ВВ(С) Bacillus subtilis

8,3 x 1011

40,0

40,0

0

20,0

0

20,0

66,7

Fa4-1 Bacillus subtilis

8,0 x 1011

50,0

20,0

10,0

20,0

0

20,0

66,7

D 7-1 Bacillus subtilis

8,8 x 1011

40,0

20,0

20,0

20,0

0

20,0

66,7

01 Kopf Bacillus sp.

6,0 x 1011

40,0

40,0

0

20,0

0

20,0

66,7

D-10 Bacillus sp.

3,9 x 1011

50,0

30,0

0

20,0

0

20,0

66,7

D 1-3 Bacillus sp.

9,0 x 1011

30,0

50,0

0

20,0

0

20,0

66,7

Б-5 Bacillus licheniformis

7,0 x 1011

30,0

30,0

20,0

20,0

0

20,0

66,7

Б-2 Bacillus circulans

4,0 x 1011

60,0

10,0

10,0

20,0

0

20,0

66,7

Бактериальные штаммы антагонисты рода Pseudomonas

12-2 Pseudomonas sp.

4,0 x 1011

20,0

40,0

20,0

20,0

0

20,0

66,7

Sgc-1 Pseudomonas sp.

1,3 x 1012

20,0

40,0

20,0

20,0

0

20,0

66,7

Oif 2-1 Pseudomonas sp.

6,0 x 1011

20,0

40,0

10,0

30,0

0

30,0

50,0

15-1 Pseudomonas sp.

5,2 x 1011

10,0

50,0

10,0

30,0

0

30,0

50,0

14-3 P. chlororaphis

8,9 x 1011

10,0

50,0

10,0

20,0

10,0

30,0

50,0

13-2 Pseudomonas sp.

4,5 x 1012

0

50,0

20,0

30,0

0

30,0

50,0

Из 27 испытанных коллекционных бактериальных штаммов рода Bacillus 18 штаммов показали колонизирующую активность с биологической эффективностью, превышающей 66,7 %. При этом максимальная колонизирующая активность (100 %) выявлена у трех штаммов – D1-1, 11-3 и 5-3 Bacillus sp. У семи штаммов: K 1-2, Fa 4-2, 11-1, Fz-9 и 3-2 Bacillus sp., K 1-1 B. subtilis , P-9 B. polymyxa , эффективность была незначительно ниже – 83,3 % . У восьми бактериальных штаммов (ВВ(С), Fa 4-1 и D 7-1 B. subtilis , 01 корf, D-10, D 1-3 Bacillus sp., Б-5 B. licheniformis и Б-2 B. circulans ) биологическая эффективность составила 66,7 %.

Из девяти коллекционных бактериальных штаммов из рода Pseudomonas у четырех штаммов (Oif 2-1, 15-1, 13-2 Pseudomonas sp. и 14-3 P. chlororaphis ) биологическая эффективность составила 50,0 %. Максимальная эффективность (66,7 %) установлена у двух штаммов: 12-2 и Sgc-1 Pseudomonas sp.

Таким образом, на фоне искусственного заражения проростков рапса озимого возбудителем фомоза выделено 23 грибных и 24 бактериальных перспективных штамма, показавших биологическую эффективность от 50,0 до 100 %. Выделенные штаммы в дальнейшем будут оценены на фоне искусственного заражения патогеном в лабораторных условиях в грунте.

Заключение. Для определения колонизирующей активности штаммов антагонистов модифицировали метод искусственного заражения патогеном «Перфорированные чашки Петри»:

– подобрали оптимальный срок выдержки кончиков корней проростков рапса на колонии агрессивного изолята возбудителя фомоза – два часа, при котором через трое суток формировался фон заражения патогеном выше среднего – 70,0 %;

– разработали шкалу учета степени поражения корней проростков рапса озимого фомозом: 0 баллов – здоровые проростки; 1 балл – потемнение между гипокотилем и корнем или кончика корня с обильным образованием боковых корней; 2 балла – потемнение корня на 1/3, хорошее развитие боковых корней; 3 балла – потемнение корня на 2/3, слабое развитие или отсутствие боковых корней; 4 балла – полное отгнивание корня. При поражении проростков 0–2 баллами формировались жизнеспособные проростки; 3–4 баллами – нежизнеспособные проростки.

Во вторичном скрининге на среднем фоне искусственного заражения проростков рапса озимого возбудителем фомоза (60 %) с использованием метода «Перфорированные чашки Петри» выделено 23 перспективных грибных штамма, биологическая эффективность которых варьировала от 66,7 до 100 %. Максимальный защитный эффект (100 %) проявили 14 штаммов – Pv-3 Penicillium verrucosum , Pf-1 P. funicu-losum , Pbc-1 P. brevi-compactum , Pp-1 P. purpurescens , Т-1, Т-3 и T-4 Trichoderma sp., Tk-1 Trichoderma koningii , T-5 Tricho-derma asperellum , M-24 Talaromyces flavus , M-1 Metarhizium sp., SM-1 Sordaria macro-spora , Tt-1 Talarоmyces trachispermus , Xk-2 Chaetomium olivaceum.

Из 27 коллекционных штаммов бактерий рода Bacillus у 18 штаммов колонизирующая активность превысила 66,7 %. Максимальную эффективность (100 %) проявили три штамма – D 1-1, 11-3 и 5-3 Bacillus sp. У семи штаммов (K 1-2, Fa 4-2, 11-1, Fz-9 и 3-2 Bacillus sp., K 1-1 B. sub-tilis , P-9 B. polymyxa ) эффективность была незначительно ниже – 83,3 % .

Из девяти коллекционных бактериальных штаммов из рода Pseudomonas у четырех штаммов биологическая эффективность составила 50,0 %. Максимальная колонизирующая активность (66,7 %) установлена у двух штаммов: 12-2 и Sgc-1 Pseudomonas sp.