Компьютерная морфометрия лимфоцитов периферической крови у больных пневмонией различного возраста

В настоящее время неблагоприятные экологические факторы оказывают существенное влияние на функционирование важнейших систем жизнеобеспечения человека, в частности, на систему крови.

Цель работы: выявить изменения в периферической крови людей различного возраста при таком распространенном заболевании воспалительного характера как пневмония, определить возможные причины патоморфоза заболевания в условиях крупного промышленного региона.

Несмотря на достигнутые успехи в лечении внебольничной пневмонии, по-прежнему ее роль в структуре заболеваемости и смертности остается значимой. В старших возрастных группах частота и смертность вследствие пневмонии существенно возрастают [1, 2]. Все это диктует необходимость совершенствования методов диагностики оценки тяжести воспалительного процесса этой формы патологии.

В первую очередь это касается изменений клеток периферической крови. Сведения об изменениях морфологии клеток крови у больных пневмонией различного возраста не только немногочисленны, но в ходе выполнения этих наблюдений не использованы многие из предложенных в последние годы новых методов исследования количественных и качественных свойств форменных элементов крови. В частности, для объективизации морфологической диагностики предпринимаются попытки использовать методы морфометрии, проточной и сканирующей цитометрии [3, 4]. Стремление получить принципиально новые данные об объекте заставляет переходить от визуального наблюдения к измерению характеристик объекта по его изображению, переходить от микроскопии к морфометрии. Морфометрические исследования гемоизображений распространены в практике лабораторного анализа. Так, в работах [5, 6] авторы проводили «диагностическую морфометрию» бластных клеток костного мозга больных острым миелоидным лейкозом. В работе [7] выполняли компьютерную морфометрию лимфоцитов периферической крови при апластической анемии. Компьютерная морфометрия не только позволяет получить математические характеристики клеточной популяции, но и дает возможность судить об активности внутриклеточных процессов. Очевидно, что при активации процессов метаболизма в клетке увеличивается ее площадь, ядро становится более рыхлым и увеличивается в размере [8]. Морфофункциональное состояние лимфоцитов отражают качественные и особенно количественные характеристики клеток.

В [9] осуществляли компьютерную фазовую морфометрию иммунокомпетентных клеток периферической крови и указывали, что увеличение диаметра, периметра и площади клеток соответствует уровню активации лимфоцитов, а фазовая высота и объём характеризуют состояние ядерных структур: чем меньше высота и объём, тем выше пролиферативный потенциал клетки. Проведенные исследования показали, что Т- и В-лимфоциты имеют определенные морфометрические различия. Является неопровержимым фактом, что одним из проявлений реактивности лимфоцитов служит изменение их топографии и, соответственно, их морфометрических параметров. В связи с этим динамика размерных показателей Т- и В-клеток объективно отражает особенности состояния иммунной системы. У соматически здоровых лиц субпопуляции малых и средних лимфоцитов включают 95% от всего количества циркулирующих Т-хелперов и около 50% от общего числа цитотоксических Т-лимфоцитов. Большие лимфоциты представлены оставшейся половиной цитотоксических Т-клеток и натуральными киллерами. Следовательно, анализ распределения лимфоцитов по величине их диаметра помогает с большой долей вероятности характеризовать особенности внутрипопу-ляционного состава иммунокомпетентных клеток. В работе [10] авторы, проводя витальную компьютерную фазовую морфометрию клеток периферической крови, показали, что морфометрические показатели (диаметр, периметр, площадь и объём) отражают морфологические особенности и функциональную полноценность клеток, в частности, уровень пролиферации и дифференцировки лимфоцитов.

Нами предпринята попытка исследовать морфологические особенности клеток периферической крови у больных в активной фазе пневмонии. Эти исследования представляют не только научный, но и практический интерес.

Материалы и методы. Обследованы 116 больных внебольничной бактериальной пневмонией разного возраста (деление на возрастные группы произведено согласно рекомендациям семинара геронтологов и ВОЗ (Киев, 1963): 1-я группа – больные молодого возраста (18-44 года), 2-я – больные среднего возраста (45-59 лет) и 3-ая – больные пожилого возраста (60-74 года). Все больные не имели сопутствующих аутоиммунных заболеваний и были разделены на группы по полу и возрасту. Больных пневмонией 1-й возрастной группы было 49 (34 мужчины и 15 женщин), 2-й группы – 32 (22 мужчины и 10 женщин), 3-й группы – 35 (24 мужчины и 11 женщин). Контрольную группу составили 30 практически здоровых человека (16 мужчин и 14 женщин) 18-44 лет, то есть люди молодого возраста. Мы согласны с мнением В.М. Дильмана [11], который, рассматривая одну из моделей развития болезней – онтогенетическую, предлагает отказаться от критерия «возрастной нормы». Он считает, что норма едина, поэтому необходимо основываться на критериях «идее-альной нормы» (то есть соотнесения возрастных сдвигов для каждого индивидуума к его показателям в возрасте 20-25 лет) или «оптимальной нормы», при которой минимальна частота главных неинфекционных болезней и, соответственно, минимальны нарушения, формирующие эти болезни.

Всем обследованным при поступлении в стационар проведены общий анализ крови и компьютерная морфометрия лимфоцитов периферической крови в стандартно приготовленных мазках периферической крови, окрашенных по Паппенгейму. Поскольку показатели морфометрии клеток периферической крови существенно отличаются у мужчин и женщин, анализ их проведен раздельно. С помощью системы анализа изображения, состоящей из микроскопа проходящего света «AxioStar+» фирмы «Carl Zeiss» (объектив 100×МИ), видеокамеры «JVC 1/2», персонального компьютера и программы анализа изображений «Image Tool», была проведена морфометрия клеток крови. Проводили выделение границ клеток, их ядер и измерение диаметров клеток. В каждом наблюдении определяли площадь клеток и ядер 50 лимфоцитов, по два перпендикулярных диаметра 50 лимфоцитов. Всего измерено 7300 лимфоцитов (701 и 800 в контрольных группах женщин и мужчин, и по 745 и 1705, 500 и 1097, 549 и 1203 в группах больных пневмонией женщин и мужчин молодого, среднего и пожилого возраста соответственно). С помощью объект-микрометра была проведена калибровка системы анализа изображения, при которой было найдено соответствие микрометров к пикселям на экране монитора.

Первичные морфометрические показатели – площадь клетки ( S к ) и площадь ядра ( S я ) в дальнейшем применяли в расчетах цитоплазменно-ядерного отношения (ЦЯО). Его определяли по формуле:

ЦЯО = ^Sk - ^Sя .

Вычисляли средний диаметр лимфоцита. Полученные результаты обрабатывали после проверки нормальности распределения методом вариационной статистики с применением t- критерия Стьюдента, статистически достоверными считали различия при р< 0,05.

Результаты и обсуждение. Анализ полученных результатов показал, что уровень лейкоцитов периферической крови у больных пневмонией 3 групп (7,2±0,35-109/л, 8,2± 0,77-109/л, 6,8±0,49-109/л, соответственно), значимо выше, чем у здоровых (5,8± 0,18-10 /л). Только у пожилых больных абсолютное число лимфоцитов (1,450±0,116-10 /л) уменьшено относительно контрольной группы (2,028± 0,123-109/л) и молодых больных (1,835± 0,107-10 9/л). Относительное число лимфоцитов крови у больных пневмонией существенно уменьшено во всех возрастных группах (26,0±1,54%,   25,3±2,30% и 24,3±2,18%, соответственно) по сравнению с контрольной группой (34,7±1,57%). Относительное и абсолютное число плазмоцитов увеличено у молодых больных пневмонией (0,14±0,05%, 9

0,0085±0,0032 - 10 /л, соответственно) относительно контроля (0).

Таблица 1. Морфометрические показатели лимфоцитов крови женщин больных пневмонией

Примечание: здесь и в табл. 2:* - достоверность различий между показателями у здоровых и больных p<0,05; # - достоверность различий между показателями у больных 1 и 3 групп p<0,05; + - достоверность различий между показателями у больных 2 и 3 групп p<0,05; ^ - достоверность различий между показателями у больных 1 и 2 групп p<0,05; n – число измеренных клеток в наблюдаемых группах.

Таблица 2. Морфометрические показатели лимфоцитов крови мужчин больных пневмонией

У пожилых больных пневмонией морфометрические параметры лимфоцитов не изменены по сравнению с контрольной групп-пой (табл. 1 и 2). Площадь клетки, ядра и цитоплазмы лимфоцитов у больных пневмонией женщин молодого (106,5 мкм², 63,0 мкм², 43,5 мкм², соответственно) и среднего возраста (114,0 мкм², 64,5 мкм², 49,5 мкм², соответственно) уменьшается по сравнению с показателями контрольной группы (122,7 мкм², 69,6

мкм², 53,2 мкм² соответственно) и пожилыми больными (122,0 мкм², 68,4 мкм², 53,6 мкм², соответственно). Значимы различия площади клетки и цитоплазмы лимфоцитов между 1-й и 2-й группами больных пневмонией женщин (см. табл. 1). У больных пневмонией мужчин молодого (53,4 мкм²) и среднего возраста (55,8 мкм²) цитоплазма лимфоцитов увеличивается по сравнению со здоровыми добровольцами (50,1 мкм²) и пожилыми больными (49,7 мкм²).

У больных пневмонией мужчин среднего возраста по сравнению с контрольной группой (70,0 мкм², 0,68) и пожилыми (68,8 мкм², 0,70) уменьшается площадь ядра лимфоцитов (67,7 мкм²) и увеличивается ЦЯО (0,81). Есть различия у больных пневмонией мужчин между 1-й и 3-й, 2-й и 3-й группами по размерам площади клетки, ядра, цитоплазмы, диаметру лимфоцитов, а также между 1-й и 2-й групп-пами по площади ядра и цитоплазмы (см. табл. 2).

Таким образом, у пожилых больных пневмонией размеры лимфоцитов не изменяя-ются относительно здоровых, что свидетельствует о нарушении иммунного ответа на воспаление в этой группе. В группах больных пневмонией молодого и среднего возраста выявлена различная реакция лимфоцитов у мужчин и женщин. Характер изменений морфометрических показателей лимфоцитов (уменьшение площади лимфоцитов, их ядра, цитоплазмы, отсутствие увеличения ЦЯО) может свидетельствовать о снижении метаболизма в лимфоцитах при развитии воспаления легких у женщин в молодом и среднем возрасте [8], а вследствие этого – и о снижении уровня активации лимфоцитов у них. В доступной нам литературе мы не нашли указаний о сущее-ственных различиях в функционировании клеточного звена иммунной системы у взрослых женщин и мужчин. А.М. Королюк [12] отмечает половое различие в характере сдвигов в функции иммунной системы у подростков. Можно предположить разную реакцию лимфоцитов на фоне различного гормонального фона в группах людей молодого и среднего возраста.

Популяция лимфоцитов неоднородна и представляет собой сложную мозаику клеточных форм, отличающихся друг от друга, как по функции, так и по микроструктуре. Лимфоциты имеют разные размеры: так, незрелые тимоциты (cytCD3+TdT+) являются крупными бластами и клетками среднего размера. CD45RO+ Т-клетки (Т-клетки памяти) по размеру несколько больше CD45RА+ клеток (наивных), но мельче активированных Т-кле-ток. Первичные фолликулы лимфоцитов и зона мантии вторичных фолликулов состоят из мАлых лимфоцитов [13]. Кроме того, известно, что естественные киллерные клетки имеют морфологию больших гранулярных лимфоцитов, причем их количество увеличивается в старших возрастных группах [14]. Возможно, изменение соотношений субпопуляций лимфоцитов, циркулирующих в периферической крови, а вследствие этого – размеров клеток у мужчин и женщин молодого и среднего возраста происходит по-разному, поэтому по-разному изменяются морфометрические параметры лимфоцитов.

Выводы: реакция лимфоцитов на воспаление легких у мужчин и женщин молодого и среднего возраста различная: у мужчин площадь цитоплазмы лимфоцитов увеличивается, а площадь клетки не изменяется, у женщин уменьшается площадь ядра, цитоплазмы и лимфоцита в целом, что косвенно указывает на снижение уровня активации лимфоцитов у женщин в молодом и среднем возрасте при развитии пневмонии. У пожилых больных пневмонией размеры лимфоцитов не изменяя-ются относительно контрольной группы, что свидетельствует о нарушении иммунного ответа на воспаление и что следует учитывать при лечении больных с данной патологией.