Комплексная оценка результата имплантации внутрикостных конструкций с медьсодержащим покрытием в условиях эксперимента у животных при глубокой грамм-отрицательной инфекции бедра

Для современной травматологии и ортопедии характерно увеличение числа случаев имплантат-ассоциированной инфекции [1, 2]. Важной причиной стойкого течения послеоперационной инфекции и неудачного лечения является процесс формирования биопленки на поверхности имплантата [3]. Грам-отрицательные бактерии являются причиной острой и полимикробной инфекции в 10–23 % случаев оперативного лечения, связанного с выполнением эндопротезирования или внутреннего остеосинтеза, чаще всего вызывая осложнения [4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10]. При этом лечение характеризуется длительной госпитализацией, хронизацией воспалительного процесса, значительными материально-техническими затратами, в том числе и по причине наличия у пациентов сопутствующего иммуносупрессивного синдрома [11, 12, 13].

• P. aeruginosa считается одним из самых трудноизлечимых возбудителей из-за способности вырабатывать биопленки, устойчивые к воздействию большинства известных антибактериальных препаратов [14, 15, 16]. Профилактика

инфекционного воспаления связана с предупреждением адгезии микроба к поверхности имплантата. В этом случае антибактериальный агент действует на возбудителя, когда он присутствует в планктонной форме. В реализации данного механизма важную роль играют матрицы, представленные различными материалами в виде титановых нанотрубок, мезопористых структур, гидроксиапатита, хитозана, поли-электролитных мультислоев [17, 18, 19, 20, 21].

Доступной отечественной технологией является иммерсионно-плазменное напыление на поверхность титановых имплантов ионов Ag+ или Cu2+. Исследованиями доказано, что легирование титановых сплавов частицами меди или серебра усиливает их антимикробную активность [22, 23, 24]. Достоинство медьсодержащих препаратов заключается в меньшем потенциале токсичности из-за возможности выведения вещества из организма естественным путем [25]. В целях обоснованного применения в клинической практике имплантатов с медьсодержащим антибактериальным агентом необходимость проведения экспериментальных работ на модели остеомиелита у животных не вызывает сомнений. Недостатком известных моделей экспериментального остеомиелита является несоответствие их реальным условиям клинической практики, где процесс лечения проходит на фоне относительно длительной микробной контаминации кости и окружающих тканей [26, 27].

Анализ результатов, полученных в ходе экспериментальных исследований у животных с моделью патологического процесса, требует комплексной количественной оценки, которая включает параметры клинико-функционального состояния животных и данные патоморфологических и лучевых методов исследований. К сожалению, существующие методы оценки результата эксперимента нельзя признать комплексными и релевантными по отношению к клинической практике [28, 29].

Цель исследования. Осуществить комплексную оценку клинических и параклинических показателей у животных с моделированной грам-отрицательной периимплант-ной инфекцией бедренной кости при использовании интрамедуллярных титановых стержней без покрытия и с медьсодержащим покрытием на основе аморфного наноуглерода.

Материалы и методы

Исследование проводилось у 32 половозрелых крыс породы Wistar (самки). Общая выборка включила две группы животных (основную и контрольную) по 16 особей в каждой группе. Всем животным проведена однотипная операция по имплантации двух типов титанового штифта. Первый тип конструкции (контрольная группа) представлял собой штифт из сплава ВТ-6 длиной 10 мм и диаметром 1 мм. Второй тип конструкции с такими же геометрическими параметрами отличался тем, что поверхность штифта имела покрытие на основе аморфного наноуглерода с микрочастицами меди (основная группа). Нанесение покрытия производилось в условиях лаборатории нейтронно-синхротронных исследований наноструктур ИФМ УрО РАН (г. Екатеринбург).

В предлагаемом способе экспериментального моделирования периимплантной инфекции трубчатых костей, включающем выполнение вертикального разреза кожи и подкожной клетчатки в области большого вертела бедренной кости у лабораторных крыс под общей анестезией, затем в области большого вертела производилась трепанация бедренной кости с доступом в костномозговой канал.

Методика предусматривала несколько отличий от существующих ранее. Первое отличие заключалось в том, что в полость костномозгового канала через трепанационное отверстие в области большого вертела вводили имплантат в дистальном направлении на 2,5 см. Второй отличительный признак техники эксперимента состоял в том, что на поверхности штифта предварительно формировали микробные биопленки путем его погружения в питательную среду с культурой P. aeruginosa в концентрации 10⁶ микробных тел в 1 мл в течение 24 часов при температуре 37°C. Операционную рану наглухо и послойно ушивали.

Основой данной модели имплантат-ассоциированной инфекции и остеомиелита явился патент РФ № 2824017 от 31.07.2024 (авторы: Сергеев Г.К., Сергеев К.С., Мальчевский В.А.). Выведение животных из опыта производилось на 3, 7, 14, 28 сутки. В каждый срок учитывался результат у 4 животных каждой группы.

Авторами предлагается оригинальный «Способ комплексной оценки результатов лечения остеомиелита бедренной кости у лабораторных крыс» (патент РФ 2814076 от 21.02.2024, авторы: Сергеев Г.К, Сергеев К.С., Мальчевский В.А.). Комплексная оценка результатов лечения остеомиелита бедренной кости у лабораторных крыс проводится в баллах от 0 до 4 по следующим критериям:

• 1.    Выраженность нарушений стато-динамической функции:

• •    Отсутствие хромоты – 0 баллов

• •    Наличие хромоты, не мешающей мобильности – 1 балл

• •    Наличие хромоты, умеренно ограничивающей мобильность – 2 балла

• •    Наличие хромоты, сильно ограничивающей мобильность – 3 балла

• •    Полное или практически полное отсутствие опорной функции оперированной конечности – 4 балла

• 2.    Выраженность локальных признаков воспаления:

• •    Отсутствие локальных воспалительных признаков – 0 баллов

• •    Локальная гиперемия области швов, отсутствие экс-удации из раны – 1 балл

• •    Локальная гиперемия и субфебрильная температура, отек с отсутствием эксудации из раны – 2 балла

• •    Локальная гиперемия, локальная температура, отек бедра и экссудация гнойного и серозно-гнойного отделяемого из раны – 3 балла

• •    Появление свища – 4 балла

• 3.    Динамика массы тела:

• •    Набор массы тела – 0 баллов

• •    Стабильная масса тела – 1 балл

• •    Снижение не более 8 % от массы тела – 2 балла

• •    Потеря в весе более 8–10 % от массы тела – 3 балла

• •    Потеря в весе более 10 % от массы тела – 4 балла

• 4.    Патоморфологические проявления заболевания:

• •    Нет явлений остеомиелита на гистоморфологических препаратах – 0 баллов

• •    Наличие зоны костной резорбции в костномозговом канале – 1 балл

• •    Начальные явления остеонекроза костной ткани – 2 балла

• •    Признаки лизиса обширных участков костной ткани и остеонекроз (интрамедуллярная фаза) – 3 балла

• •    Остеонекроз с некрозом мягких тканей – формирование свища (экстрамедуллярная фаза) – 4 балла

Полученные результаты комплексной оценки имплантат-ассоциированной инфекции (остеомиелита) расцениваются по следующей шкале:

• •    0–4 баллов – хорошая оценка

• •    5–8 баллов – удовлетворительная оценка

• •    9–12 баллов – неудовлетворительная оценка

• •    13–16 баллов – крайне неудовлетворительная оценка

Статистический расчет проводился с целью определения достоверности различия между сравниваемыми показателями с учетом количества животных (n=16) в каждой группе на основе t-критерия.

Результаты

При обследовании животных двух сравниваемых групп в сроки 3, 7, 14, 28 сутки установлено, что наиболее выраженные стато-динамические нарушения наблюдались в контрольной группе в сроки позднее 7 дней после операции.

Нарушения стато-динамической функции. В контрольной группе дисфункция оперированной конечности достигала 2 баллов у всех 4 животных на 14-е и 28-е сутки. В основной группе оценка нарушения двигательной функции конечности составляла 1 балл у 3 из 4 животных на 7-е сутки и у всех 4 животных на 14-е и 28-е сутки.

Локальные воспалительные изменения . Картина локальных воспалительных изменений имела определенные различия между группами. Наличие отека послеоперационной раны в обеих группах отмечено на 7-е и 14-е сутки (2 балла у 4 из 4 животных в каждой группе). Эксудативная реакция отсутствовала. Появление гипертермии до субфебрильной температуры зарегистрировано только в контрольной группе на 7-е и 14-е сутки у 3 из 4 животных. В остальные сроки температура у всех животных была в пределах нормы.

Динамика массы тела. Снижение массы тела, оцениваемое в 2 балла, наблюдалось в срок 7 и 14 дней у всех 4 животных контрольной группы. У животных основной группы масса тела была стабильной во все сроки наблюдения (1 балл у всех животных).

Патоморфологические изменения. При патоморфологиче-ском исследовании отмечено наличие признаков выраженного остеолизиса с признаками начального некроза в костной ткани в контрольной группе на 14-й день эксперимента (2 балла у всех 4 животных). На 28-й день зона периимплант-ного остеолизиса была более выраженной, отмечено формирование обширного некроза костной ткани (3 балла у всех 4 животных). В основной группе на 14-й день зоны остеолизиса были локальными (1 балл у всех 4 животных). Формирование локальных областей костной деструкции в сочетании с реакцией остеолиза в периимплантной зоне к 28-му дню эксперимента позволило количественно интегрально оценить данную ситуацию у животных основной группы в 2 балла у всех 4 животных.

Для получения интегрального показателя по каждому критерию суммировались баллы всех животных группы во все сроки наблюдения, затем рассчитывалось среднее значение на одно животное. Распределение количественных показателей изучаемых признаков представлено в таблице 1.

Таблица 1

Распределение изучаемых показателей в различные сроки послеоперационного периода у животных основной и контрольной групп

Показатель	Основная группа, сутки				Контрольная группа, сутки
	3	7	14	28	3	7	14	28
Дисфункция оперированной конечности, балл (количество животных)	0 (4)	1 (3)	2 (4)	2 (4)	0 (4)	1 (4)	2 (4)	2 (4)
Среднее значение на группу	1,3				2,3
Локальная воспалительная реакция, балл (количество животных)	0 (4)	1 (4)	2 (4)	2 (4)	1 (4)	2 (4)	2 (4)	2 (4)
Среднее значение на группу	1,3				2,8
Снижение массы тела, балл (количество животных)	0 (4)	1 (4)	1 (4)	1 (4)	1 (4)	2 (4)	2 (4)	2 (4)
Среднее значение на группу	0,8				2,8
Патоморфологиче-ские изменения, балл (количество животных)	0 (4)	1 (4)	2 (4)	2 (4)	0 (4)	1 (4)	2 (4)	3 (4)
Среднее значение на группу	1,3				3,8
Общая сумма баллов по группе	4,7				11,7

Таким образом, суммарная оценка результата у животных контрольной группы составила 11,7 балла, что соответствует неудовлетворительному исходу имплантат-ассоциирован-ного остеомиелита. В основной группе исход лечения оценивался в 4,7 балла, что соответствует диапазону хорошего результата. Статистический расчет различия в сравниваемых группах интегральной количественной оценки (4,7 балла в основной и 11,7 балла в контрольной группах) с использованием t-критерия Стьюдента определил их существенную достоверную разницу (t=11,32; df=30, p=0,01).

Обсуждение

Полученные результаты демонстрируют значительные преимущества медьсодержащих имплантатов в профилактике и лечении грам-отрицательной периимплантной инфекции. Интегральная оценка показала 2,5-кратное снижение тяжести патологического процесса в основной группе по сравнению с контрольной (4,7 балла против 11,7 балла соответственно, p=0,01). Наиболее выраженные различия между группами наблюдались по критерию динамики массы тела (снижение показателя в 3,5 раза: 0,8 балла в основной группе против 2,8 балла в контрольной) и патоморфологическим изменениям (снижение в 2,9 раза: 1,3 балла против 3,8 балла соответственно). Это свидетельствует о том, что медьсодержащее покрытие не только предотвращает развитие локальных воспалительных изменений, но и оказывает протективное действие на общее состояние организма.

P. aeruginosa, выбранная в качестве возбудителя в данном исследовании, характеризуется высокой устойчивостью к большинству антибиотиков и способностью формировать устойчивые биопленки [14, 15, 16]. Согласно литературным данным, грам-отрицательные бактерии вызывают 10–23 % случаев имплантат-ассоциированных инфекций [4, 5, 6, 7, 8, 9, 10], что делает поиск эффективных методов борьбы с ними особенно актуальным.

Механизм антибактериального действия меди реализуется через несколько путей: прямое повреждение клеточной стенки бактерий ионами Cu2+, генерация активных форм кислорода, нарушение работы ферментных систем микроорганизмов [22, 23, 24]. Важным преимуществом медьсодержащих покрытий является их низкая токсичность для организма хозяина благодаря естественным механизмам метаболизма меди [25].

Разработанная нами модель периимплантной инфекции с предварительным формированием биопленки на поверхности имплантата в течение 24 часов максимально приближена к клинической ситуации, где инфекционный процесс развивается на фоне уже сформированной микробной биопленки. Это принципиально отличает данную модель от существующих методик, где контаминация происходит в момент имплантации [26, 27].

Предложенная система балльной оценки позволяет объективно количественно оценить течение экспериментального остеомиелита, что особенно важно для сравнительной оценки эффективности различных методов лечения. Статистически значимое различие между группами (t=11,32; p=0,01) подтверждает высокую чувствительность разработанной методики оценки.

Полученные данные согласуются с результатами других исследователей, показавших эффективность медьсодержащих покрытий против грам-отрицательных бактерий [22, 23, 24]. Однако наше исследование является первым, где проведена комплексная количественная оценка эффективности медьсодержащих имплантатов на модели периимплантной инфекции, вызванной P. aeruginosa с предварительно сформированной биопленкой.

Заключение

Экспериментальное исследование на 32 половозрелых крысах породы Wistar с моделью имплантат-ассоцииро-ванного остеомиелита, вызванного P. aeruginosa, убедительно доказало эффективность медьсодержащих покрытий на основе аморфного наноуглерода. Применение инновационных имплантатов с медьсодержащим покрытием обеспечило достижение хорошего результата лечения (4,7 балла по разработанной шкале оценки) против неудовлетворительного результата в контрольной группе (11,7 балла), что соответствует улучшению показателей в 2,5 раза (p=0,01).

Наиболее выраженный эффект медьсодержащего покрытия проявился в предотвращении системных нарушений: снижение массы тела животных основной группы составило всего 0,8 балла против 2,8 балла в контрольной группе (улучшение в 3,5 раза). Патоморфологические изменения в основной группе были минимальными (1,3 балла против 3,8 балла в контрольной группе), что свидетельствует о выраженном локальном антибактериальном эффекте. Функциональные нарушения (дисфункция оперированной конечности) в основной группе были в 1,8 раза менее выражены по сравнению с контрольной группой (1,3 балла против 2,3 балла соответственно).

Доказанный антибактериальный эффект медьсодержащих покрытий в концентрации 10⁶ микробных тел P. aeruginosa в 1 мл, отсутствие системной токсичности и стабильность покрытия в течение 28 дней наблюдения позволяют рекомендовать данный тип имплантатов для дальнейших доклинических исследований с перспективой внедрения в клиническую практику лечения гнойно-воспалительных заболеваний костей.