Комплексная оценка влияния питательной среды и температуры на сохранение земляники садовой in vitro

Введение. Стратегии по поддержанию генетических ресурсов растений направлены на улучшение долгосрочного сохранения, управления и восстановления разнообразия растений, растительных сообществ и связанных с ними сред обитания и экосистем как in situ , так и ex situ . Подходы ex situ включают методы хранения семян, ДНК, пыльцы, культуры тканей in vitro , полевые генные банки и ботанические сады. Сохранение растений с помощью приемов культивирования клеток, тканей и органов in vitro является наиболее безопасной альтернативой для размножения и долгосрочного поддержания большого количества культур [1–4].

В ведущих мировых генбанках в условиях in vitro сохраняются дублетные коллекции растений, которые являются резервом сохранения генофонда полевых насаждений. Основные преимущества in vitro коллекций заключаются в их компактности, возможностях оздоровления микрорастений от вирусных инфекций и фитоплазм [5–6]. Генетические ресурсы растений в ВИР сохраняются ввиде in vitro и криоколлекций. Коллекция in vitro ВИР включает более 330 образцов ягодных и плодовых культур, из них 32 образца приходится на землянику, из которых 28 сортов (23 российских и 5 зарубежных) [7]. Сохранение и использование генетических ресурсов растений, животных и микроорганизмов в Японии реализуется в проекте «Genebank» для производства продовольствия и ведения сельского хозяйства. Национальный институт агробиологических наук (NIAS) функционирует как центральный банк, в котором сохраняется около 233 000 образцов зародышевой плазмы сельскохозяйственных культур и диких сородичей; около 1 450 видов, включая 45 000 образцов клональных культур. Из них 205 000 образцов относится к базовой коллекции, а 129 000 образцов используются в исследовательских целях [8]. NPGS (National Plant Germplasm System) США включает в себя более 20 различных индивидуальных генных банков. Через информационную сеть ресурсов зародышевой плазмы (GRIN) генные банки NPGS управляют информацией, связанной с сохранением более 539 000 образцов зародышевой плазмы расте- ний [9]. Бразилия является одной из самых био-разнообразных стран на Земле, на ее долю приходится около 10 % всех видов сосудистых растений в мире. Бразильская сельскохозяйственная исследовательская корпорация (Embrapa) является правительственным учреждением, которое с 1973 г. несет ответственность за пополнение и сохранение всех генетических ресурсов в Бразилии. Растительные генетические ресурсы Embrapa сохраняются в активных генных банках (134 AG), долгосрочных банках семян (735 видов в Colbase), а также генбанках in vitro (1 250 образцов) и ДНК (12 000 образцов) [10]. В Германии вся деятельность по долгосрочному сохранению, использованию, исследованию и развитию генетических ресурсов растений основана на Немецкой национальной программе «Генетические ресурсы сельского хозяйства и садоводства». Генетические ресурсы растений (ГРР) сохраняются в немецком «German Fruit Genebank», который насчитывает около 19 000 растений (14 000 образцов ex situ и 5 000 in situ), из которых 239 уникальных сортов Fragaria [11].

Изолированные клетки, ткани и органы культивируют на многокомпонентных питательных средах, преимущественно для земляники – Андерсона, Ли де Фоссарда, Боксю и Мурасиге-Скуга. Они могут существенно различаться по своему составу, однако в состав всех сред обязательно входят необходимые растениям макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, фитогормоны и их синтетические аналоги. Традиционно работы по совершенствованию метода клонального микроразмножения растений связаны с разработкой индивидуальных протоколов на основе оптимизации состава питательной среды и условий культивирования [12, 13]. Итальянскими учеными разработаны протоколы регенерации эксплантов земляники садовой (сортов Calypso и Sveva) и голубики (сорт Duke) на основе модификации гормонального состава питательной среды. Наилучший результат регенерации эксплантов земляники садовой сорта Calypso был получен при культивировании на среде, дополненной тидиазуроном (ТДЗ) 0,5- и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д) (0,02 мг/л); для сорта Sveva – 6-бензиладенином (BA) (3 мг/л) и индол-3-масляной кислотой (IBA) (0,2 мг/л) [14]. Изменение кинетики роста и развития микрорастений на искусственной питательной среде возможно в присутствие шестиатомных спиртов (маннит, сорбит и дульцит), обладающих осмотической активностью [15–17]. В результате проведенных исследований показано, что совместное использование оптимальных показателей температуры и состава питательной среды значительно увеличивало как период субкультивирования, так и жизнеспособность эксплантов в процессе сохранения in vitro [18, 19]. Внесение в питательную среду Мурасиге и Скуга (МС) для культивирования органических соединений (3 % сахарозы, 2 или 3 % маннита, 2 % сахарозы + 2 % маннита) способствовало сохранению микропобегов малины в жизнеспособном состоянии при температуре +4 0С на протяжении 12–15 месяцев, а единичных растений – до 21 месяца [20]. В Научно-исследовательском институте помологии и цветоводства (Польша) для хранения микропобегов земляники и малины использовали инкапсулирование в альгинат кальция при температуре +4 0С на модифицированной питательной среде МС с добавлением 10 г/л маннита [21].

Протоколы регенерации земляники доступны для различных сортов, однако существует ограниченность информации по индивидуальным сортовым и гибридным профилям в направлении среднесрочного сохранения в процессе беспересадочного культивирования in vitro . Необходимо создавать новые системы выращивания для получения оздоровленного растительного материала, а также сохранения ценных генотипов с целью дублирования образцов полевого генбанка в контролируемых условиях среды.

Цель исследования: изучение влияния питательной среды и температурного режима на сохранение земляники садовой in vitro .

Задачи исследования : подобрать оптимальные факторы культивирования в контролируемых условиях среды; оптимизировать технологию in vitro и оценить возможность ее унификации для среднесрочного сохранения ценного генотипа земляники.

Объекты и методы исследования. Исследование проведено в 2018–2019 гг. на базе ФГБНУ «Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководст-ва» (ФГБНУ ВСТИСП). Объект исследования – экспланты земляники садовой (Fragaria × × ananassa Duch.) сорта Наше Подмосковье селекции Кокинского опорного пункта (Брянская область), авторами которого являются д-р. с.-х. наук С.Д. Айтжанова и канд. с.-х. наук Н.В. Андронова, относится к перспективным сортам земляники для возделывания в Центральном регионе РФ.

В качестве минеральной основы питания использовали среду Мурасиге и Скуга (МС), дополненную 6-бензиламинопурином (БАП) (0,7 мг/л), индолил-3-масленной кислотой (ИМК) (0,1 мг/л), витаминами, мг/л: тиамином (В 1 ), пиридоксином (В 6 ), никотиновой кислотой (РР) – по 0,5 и аскорбиновой кислотой (С) – 1,0 мг/л и 8 г/л агар-агара (Panreac, Spain), pH – 5,7. В ходе исследования использовали 3 варианта питательной среды МС, различавшихся по концентрации маннита и дульцита: 1-й вариант (0,45 %), 2-й вариант (0,75 %) и 3-й вариант (1,05 %). Контроль – среда с добавлением сахарозы 3,0 %.

Культивирование осуществляли в климатической камере КС-200 (Россия) в стандартных условиях (при 22–24 оС, 16-часовом световом дне и освещенности 3000–5000 люкс); среднесрочное депонирование эксплантов – в холодильной камере Liebherr (Германия) с регулируемой температурой от +3 до 6 оС, интенсивностью освещения 70–80 мкМ м2∙с-1 и фотопериодом 8/16 ч. В качестве культуральных сосудов использовали химические пробирки 1,5 × 16 см, предварительно стерилизованные сухим жаром (150–200 °C) с 10 мл агаризованной среды. В опытах по сохранению эксплантов учитывали основные факторы, такие как температура и состав питательной среды. Объем выборки по каждому варианту концентраций сахаров и шестиатомных спиртов составлял 20 эксплантов.

Способность эксплантов к органогенезу в условиях in vitro оценивали визуально по четырехступенчатой бонитировочной шкале один раз в месяц [22].

В исследовании использовали методику работы по регенерации плодовых и ягодных растений в культуре эксплантов различного происхождения [23], по получению посадочного материала ремонтантных сортов земляники садовой и методические указания по сохранению вегетативно размножаемых культур в in vitro и криоколлекциях [24, 25].

Результаты исследования и их обсуждение. Культивирование эксплантов земляники садовой сорта Наше Подмосковье при температуре +22…24 °С на среде с добавлением маннита в концентрациях 0,75 и 1,05 % через 6 месяцев привело к полной гибели эксплантов. Оптимальной оказалась концентрация маннита 0,45 % (1-й вариант). Экспланты на среде с этой концентрацией дольше сохраняли жизнеспособность на уровне 56,5 %. Использование модифицированной питательной среды на основе шестиатомных спиртов (маннита) в сравнении с контролем (8,5 %) увеличивало долю сохранения растений на 6,6 % в течение 12 месяцев беспересадочного культивирования. Внесение в среду дульцита способствовало сохранению микропобегов в течение 9 месяцев в пределах 13–25 % в 1-м и 2-м вариантах (табл. 1). Дульцит не оказал существенного положительного влияния на сохранение микропобегов в стандартных условиях культивирования. Доля жизнеспособных эксплантов земляники находилась ниже контрольного варианта на протяжении всего периода сохранения.

Таблица 1

Влияние сахаров и шестиатомных спиртов на сохранение эксплантов земляники садовой сорта Наше Подмосковье при температуре +22^24 оС, %

Концентрация веществ, %	Продолжительность культивирования, месяцы
	3		6		9		12
	Д	М	Д	М	Д	М	Д	М
1-й вариант – 0,45	63,3	96,5	31,7	81,5	25,0	68,0	-	56,5
2-й вариант – 0,75	53,3	76,5	25,0	-	13,3	-	-	-
3-й вариант – 1,05	46,7	63,0	26,7	-	-	-	-	-
Среднее значение	54,4	78,7	27,8	27,2	12,8	22,7	-	18,8
Контроль – сахароза – 3,0	81,7	75,0	60,0	53,3	33,3	25,0	15,0	8,5

Примечание : Д – дульцит; М – маннит.

Депонирование эксплантов земляники при низких положительных температурах (+4…6 °С) на среде с добавлением маннита в разных концентрациях обеспечивало выход 10,0–30,0 % жизнеспособных растений (табл. 2). При культивировании микропобегов на среде с дульцитом отмечалась полная гибель опытных образцов в вариантах 1 и 2 к 12-му месяцу сохранения. По мере увеличения срока культивирования количество жизнеспособных эксплантов в варианте 3 постепенно уменьшалось до 40,0 %.

Таблица 2

Влияние сахаров и шестиатомных спиртов на сохранение эксплантов земляники садовой сорта Наше Подмосковье при температуре +4^6 оС, %

Концентрация веществ, %	Продолжительность культивирования, месяцы
	3		6		9		12
	Д	М	Д	М	Д	М	Д	М
1-й вариант – 0,45%	48,3	55,0	30,0	40	3,3	26,7	-	10,0
2-й вариант – 0,75%	61,7	75,0	50,0	55,0	16,7	28,3	-	18,3
3-й вариант – 1,05%	81,7	76,7	70,0	48,3	63,3	40,0	40,0	30,0
Среднее значение	63,9	68,9	50,0	47,8	36,8	31,7	13,3	19,4
Контроль – сахароза – 3,0%	88,3	90,0	81,7	83,3	78,3	76,7	70,0	73,3

Примечание : Д – дульцит, М – маннит.

На протяжении всего периода сохранения более высокий процент жизнеспособных эксплантов был отмечен на среде с сахарозой. В контрольном варианте жизнеспособность микропобегов варьировала в пределах

70,0–73,3 % (рис.). На сохранение земляники садовой сорта Наше Подмосковье существенное влияние оказали как питательная среда, так и условия культивирования.

Влияние сахарозы на сохранение эксплантов земляники садовой сорта Наше Подмосковье через 11 месяцев депонирования при температуре +4…6 ° С.

Следует отметить, что в условиях низких положительных температур в зависимости от активно действующего вещества и его концентрации наблюдали увеличение сроков сохранения эксплантов по сравнению со стандартными условиями культивирования от 3 месяцев для варианта 3 на питательной среде с дульцитом и до 6 месяцев для вариантов 2 и 3 на среде с маннитом.

Выводы. Проведенное исследование позволило установить различия в действии шестиатомных спиртов (маннита и дульцита) в зависимости от температурного фактора на жизнеспособность растений-регенерантов земляники садовой сорта Наше Подмосковье. Добавление в питательную среду осмотически активных веществ в концентрации 0,45 % способствовало сохранению жизнеспособных эксплантов земляники садовой при температуре +22…24 °С в течение 12 месяцев на среде с маннитом (56,5 %) и 9 месяцев на среде с дульцитом (25,0 %). Показано, что в условиях пониженных положительных температур наблюдалось увеличение периода беспересадочного культивирования от 3 месяцев для эксплантов на среде с дульцитом до 6 месяцев на среде с маннитом. Общая доля жизнеспособных эксплантом при температуре +4…6 °С составила 10–40 % через 12 месяцев депонирования. Оптимальным источником углеводного питания для микропобегов сорта Наше Подмосковье при температуре +22…24 °С являлся маннит в концентрации 0,45 %, при +4…6 °С – сахароза 3,0 %. На основе анализа полученных данных нами определены факторы (температура и состав питательной среды) и дана комплексная их оценка для разработки параметров среднесрочного хранения ценного генотипа земляники садовой в культуре in vitro .