Комплексы полистиролсульфонат-липаза из поджелудочной железы свиньи: строение и свойства

Иммобилизация ферментов на полимерные носители представляет собой одно из важнейших направлений современной прикладной биохимии и биотехнологии, направленных на улучшение свойств биологически активных веществ для их практического использования. Ферменты, иммобилизованные на полимерном носителе, обладают рядом преимуществ, что делает их более удобными для эффективного технического применения. Увеличивается стабильность фермента во времени и к различным денатурирующим агентам, возрастает термостабильность,     появляется     возможность     многократного использования фермента, а также более простого и быстрого разделения реакционной среды [1]. Среди всех методов иммобилизации можно выделить связывание фермента с полиэлектролитами как наиболее простой в техническом плане [2]. Он основан на ионном взаимодействии между белком и носителем.

Цель данной работы заключалась в получении и исследовании размеров комплексов полистиролсульфонат-липаза.

Материалы и методы. Для получения комплексов готовили растворы липазы из поджелудочной железы свиньи и полистиролсульфоната-Na (ПСС) с концентрациями 10^-5 М, затем смешивали растворы липазы и ПСС в различных соотношениях от 100:1 до 1:100. Полученный раствор пропускали через фильтр с размером пор 450 нм. Измерения проводились для трех растворов: 1 – липазы; 2- ПСС; 3 – комплекса ПСС-Липаза. Размеры частиц были измерены методом динамического светорассеяния (ДСР) на анализаторе Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Великобритания). Данный метод позволяет определить коэффициент диффузии дисперсных частиц в жидкости путем анализа характерного времени флуктуаций интенсивности рассеянного света. Далее из коэффициента диффузии рассчитывается диаметр наночастиц. Все измерения в данном исследовании осуществлялись при температуре 25^оC. Для контроля повторяемости результатов на каждом образце было выполнено 5 повторных измерений. В анализаторе Nano ZS используется гелий-неоновый (He–Ne) лазер мощностью 4 мВт, работающий при длине волны 633 нм. Измерения были проведены с углом детектирования в 173^о. Распределение по размерам в единицах интенсивности были получены из анализа корреляционных функций с использованием алгоритма Multiple Narrow Modes (Мультимодальная модель анализа) программного обеспечения анализатора.

Результаты и обсуждение. Результаты измерений представляют собой диаграмму распределения частиц по размерам, значение среднего гидродинамического радиуса (Z-Average) частиц и коэффициент полидисперсности (Pdl).

Измерение размеров частиц в растворе липазы показало наличие как отдельных молекул, так и их ассоциатов. Авторы полагают, что частицы с диаметром около 6,4 нм представляют собой отдельные клубки молекул липазы, а частицы размерами около 150,9 нм (рис. 1) – ассоциаты ряда молекул липазы.

При исследовании раствора синтетического полимера (ПСС) наблюдалось широкое распределение частиц по размерам (рис. 2). Более или менее четко можно выявить 3 пика распределения размеров частиц (по интенсивности): 1,4 нм; 15,4 нм; 126,7 нм. По-видимому, полимер не образует устойчивых мицеллярных структур, а только ряд ассоциатов.

Исследование раствора ПСС-Липаза показало наличие малых частиц комплекса размером 23,4 нм, а также крупных ассоциатов размером 182,5 нм (рис. 3).

1. График распределения размеров частиц липазы

2. График распределения размеров частиц ПСС

3. График распределения размеров частиц комплекса ПСС-Липаза.

Важно отметить увеличение ферментативной активности в комплексе ПСС-липаза на уровне 115 % от исходной активности липазы в растворе [3].

Заключение. Полученные данные свидетельствуют об образовании комплекса ПСС-Липаза. По-видимому, изменение размеров частиц происходит в следующем ряду липаза – ПСС – их комплекс: 6,4 нм – 15,4 нм – 23,4 нм, соответственно.

Работа проведена в рамках проектов НОЦ ФГОУ ВПО МГАВМиБ (гос. контракты № 02.740.11.0270 и 02.740.11.0718 Минобрнауки РФ).

ЛИТЕРАТУРА: 1. Березин, И.В. Иммобилизованные ферменты / И.В. Березин, Н.Л. Клячко, А.В. Левашов // М.: Высш. шк., 1987. - 159 с. 2. Ai, H. Biomedical Applications of Electrostatic Layer-by-Layer NanoAssembly of Polymers, Enzymes, and Nanoparticles // H. Ai, S.A. Jones, Yu.M. Lvov // Cell Biochemistry and Biophysics. – 2003. – Vol. 39. P. 23-43. 3. Соловьева, Д.О. Супрамолекулярные ферментные системы на основе липазы из поджелудочной железы свиньи. / Д.О. Соловьева, С.Ю. Зайцев, Е.В. Тульская, Ю.Г. Штырлин // Ученые записки Казанской государственной Академии Ветеринарной Медицины им И.Э. Баумана. – 2010. - том 204, С. 261-264.

КОМПЛЕКСЫ ПОЛИСТИРОЛСУЛЬФОНАТ-ЛИПАЗА ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ СВИНЬИ: СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА

Соловьева Д.О., Зайцев С.Ю, Рыжкина И.С., Муртазина Л.И.

Резюме

Впервые определаны размеры частиц липазы из поджелудочной железы свиньи, полистиролсульфоната-Na и образованного ими комплекса ПСС-Липаза. Полученные данные свидетельствуют об образовании устойчивого комплекса ПСС-Липаза со средним размером частиц 23,4 нм.

COMPLEXES POLYSTYRENESULFONATE -LIPASE FROM PORCINE PANCREAS: STRUCTURE AND PROPERTIES

Soloveva D.O., Zaitsev S.Yu., Rizhkina I.S., Murtazina L.I.