Кондуктометрический метод для контроля прироста микробной биомассы пробиотических микроорганизмов

Одна из основных задач периодического культивирования – остановить развитие популяции в начале стационарной фазы роста культуры, т.е. заставить клетки находиться неограниченно долго в желаемом состоянии [4]. Количество микроорганизмов в периодической культуре нарастает и останавливается либо из-за исчерпания субстрата, либо из-за ингибирования продуктами жизнедеятельности.

В процессе роста микробной биомассы в культуральной среде происходит накопление заряженных частиц, следовательно, кондуктометрический метод можно использовать для контроля прироста микробной биомассы в технологическом процессе.

Цель работы: исследование прироста микробной биомассы лактобактерий и бифидобактерий в процессе периодического культивирования кондуктометрическим методом.

Материал и методы

Исследования проводили в отделении производства бактерийных препаратов филиала ФГУП НПО “Микроген” Минздравсоцразвития в г. Томск НПО “Вирион”.

Для определения электропроводности использовали прибор “Экспресс-анализатор метаболической активно- сти биокатализаторов” [1].

Глубинное культивирование лактобактерий и бифидобактерий осуществляли в реакторе на казеиново-дрожжевой среде при температуре (37±1) °С, при постоянном перемешивании, подаче углеводных добавок и рН-стати-ровании в интервале от 5,5 до 6,0. Посевной материал вносили в питательную среду в объеме 20%. В качестве углеводной добавки в процессе культивирования лактобактерий и бифидобактерий использовали 40%-й раствор глюкозы и глюкозо-лактозной смеси (15% лактозы и 25% глюкозы) соответственно. Прирост микробной биомассы определяли с помощью стандарта мутности 10 ед. и коэффициента светорассеяния в зависимости от культуры. Параллельно содержание общего количества клеток лактобактерий и бифидобактерий определяли оптическим методом. Концентрацию живых микробных клеток – методом десятикратных разведений с последующим посевом на среду МРС – IV и Блаурокка.

Результаты и обсуждение

Периодический процесс глубинного культивирования микроорганизмов играет важную роль в производстве пробиотических препаратов. В процессе роста микроорганизмов в жидкой питательной среде можно выделить несколько фаз, которые характеризуются определенной морфологией и физиологическим состоянием клеток [4].

На рисунках 1, 2 представлены полученные данные оптического метода и кондуктометрического, представляющие классические кривые роста Стокса с характерными фазами роста микробных клеток в процессе культивирования лактобактерий (рис. 1) и бифидобактерий (рис. 2).

Как видно из рисунка 1, первая фаза (лаг-фаза) характеризуется замедленным ростом популяции и продолжается 2 ч. Следующий период – экспоненциальная (логарифмическая) фаза (отрезок кривой от 3 до 11 ч). Эта фаза начинается после того, как клетки полностью адаптировались к заданным условиям и рост культуры не ограничивается ни недостатком питательных веществ, ни избытком продуктов обмена – скорость размножения клеток постоянна и максимальна. Процесс кислотообразо-вания замедляется к 10 ч культивирования и остается в дальнейшем неизменным. Таким образом, к концу экспоненциальной фазы (11 ч культивирования) количество клеток достигает своего максимального значения, значение мутности и рН – стабильно и не меняется на протяжении 2–3 после- дних часов культивирования.

Известно [3], что выживаемость лиофилизированных микробных клеток зависит от фазы развития культуры: наибольшей устойчивостью к лиофилизации характеризуются культуры, взятые для сушки в конце экспоненциальной, начале стационарной фаз. На полученных кривых роста (рис. 1, 2) наглядно выражены граница окончания экспоненциальной и начало стационарной фаз. Таким образом, кондуктометрический метод показал высокую чувствительность к фиксированию оконча-

Рис. 1. Изменения удельной проводимости (1) и мутности (2) микробной суспензии лактобактерий штамма L. Plantarum 8Р-А3 в процессе культивирования: ′ – реактор 1, ′′ – реактор 2

Рис. 2. Изменения удельной проводимости (1) и коэффициента светопропускания (2) микробной суспензии бифидобактерий штамма Bifidobacterium bifidum в процессе культивирования:

′ – реактор 1, ′′ – реактор 2, ′′′ – реактор 3

ния конца экспоненциальной фазы (начала стационарной фазы).

Между технологическими показателями (логарифмом мутности или коэффициента светопропускания) и удельной проводимостью наблюдается хорошая корреляционная зависимость (рис. 3, 4).

Известно, что повышение температуры увеличивает

Рис. 4. Корреляционная зависимость логарифма коэффициента светопропускания и удельной проводимости микробной суспензии бифидобактерий Bifidobacterium bifidum (r =–0,9874, p=0,00003)

Рис. 3. Корреляционная зависимость логарифма мутности и удельной проводимости микробной суспензии лактобактерий штамма L. Plantarum 8Р-А3 (r=0,9837, p=0,000002)

удельную электропроводность за счет понижения вязкости раствора, уплотнения гидротированных ионов или увеличения степени диссоциации, в случае эндотермической реакции растворения электролита [2].

Кондуктометрический метод показал чувствительность к сбоям в технологическом процессе культивирования. На рисунке 2 показано, что в первом реакторе (1 ′′′ ) на 4-м ч роста при автоматической подачи аммиака в системе произошел сбой (в термостате увеличилась температура) и началось бурное кислотообразование молочной кислоты лактобактериями.

Заключение

Таким образом, кондуктометрический метод показал чувствительность к изменениям в технологическом процессе культивирования. Обоснована целесообразность применения кондуктометрического метода для контроля стационарной фазы роста микробной биомассы пробиотических микроорганизмов (лакто- и бифидобактерий) в технологическом процессе. Предлагаемый метод позволяет более точно определить технологически важный момент перехода экспоненциональной в стационар- ную фазы кривой роста микробной суспензии.

Работа выполнена при поддержке программы проведение поисковой научно-исследовательской работы в рамках реализации ФЦП “Научные и научно-педагогические кадры инновационной России” на 2009–2013 гг. № 54П и “Научные и научно-педагогические исследования для государственных нужд” на 2009–2013 гг. № 480П.