Конструирование среды накопления для наработки бактериальной массы Ornithobacterium rhinotracheale

Из плотных питательных сред активный рост предоставлял кровяной агар, содержащий 5-10% дефибринированной овечьей крови, его основу могут составлять Blood agar base (bioMerieux, Франция), Purple Broth base (Difco, USA), Tryptose Blood agar base (Difco, USA). Инкубировали на агаре в чашках Петри при 37 0С в течение 48-72 часов. Слабый рост либо его отсутствие возникает при 24 0С.

Так же микроорганизмы растут на триптозо-соевом агаре фирм: (bio Merieux, Франция), Tryptose agar base (Difco, USA), на PPLO агаре (Difco, USA).

Рисунок 1 - Рост референс-штамма Ornithobacterium rhinotracheale К 282 на бульоне Хоттингера (слева – контроль)

Из жидких питательных сред оптимум роста предоставляют бульон Хоттингера (рисунок 1), сердечно-мозговой экстракт и пептонная вода различных фирм производителей.

В наших экспериментах по определению оптимальной среды культивирования установлено, что бактерии вида Ornithobacterium rhinotracheale не растут на агаре Мак Конки, Дригальского, Эндо, Симмонса.

Подсчет колониеобразующих единиц питательных средах необходим для дальнейшей работы по решению задачи наработки бактериальной массы. В качестве рабочего материала использовали 48часовую культуру, культивированную на бульоне Хоттингера.

После титрования производили посев по 1 мл из каждой пробирки на 10 % кровяной агар и PPLO агар по 3 чашки на каждое разведение. Инкубировали 48 часов при 37 0С. Получили следующие данные, представленные в таблице 1.

исследуемого микроорганизма на разных

В результате полученных данных проводим расчет:

• А)    КОЕ на 10% кровяном агаре:

(22+46+38)/3*1*10-7

М= ---------------------------- = 35,3*1*107=3,5*108 КОЕ/мл

• В)    количество КОЕ на PPLO агаре:

(21+29+24)/3*1*10-7

М=-------------------------------= 24,7*1*107=2,5*108КОЕ/мл

Таблица 1 - Показатели эффективности роста референс-штамма rnithobacterium rhinotracheale К 282 на плотной питательной среде - 10% кровяной агар, PPLO агар

10% кровяной агар		PPLO агар
разведение	Количество колоний	разведение	количество колоний
1*10-1	Сплошной рост Сплошной рост Сплошной рост	1*10-1	Сплошной рост Сплошной рост Сплошной рост
1*10-2	Сплошной рост Сплошной рост Сплошной рост	1*10-2	Сплошной рост Сплошной рост Сплошной рост
1*10-3	Сплошной рост Сплошной рост Сплошной рост	1*10-3	Сплошной рост Сплошной рост Сплошной рост
1*10-4	Сплошной рост Сплошной рост Сплошной рост	1*10-4	Сплошной рост Сплошной рост Сплошной рост
1*10-5	Обильный рост Обильный рост Обильный рост	1*10-5	Обильный рост Обильный рост Обильный рост
1*10-6	Рост Рост 123	1*10-6	Рост Рост 86
1*10-7	22 46 38	1*10-7	21 29 24
1*10-8	3 1 1	1*10-8	1 Рост отсутствует 2
1*10-9	Рост отсутствует Рост отсутствует Рост отсутствует	1*10-9	Рост отсутствует Рост отсутствует Рост отсутствует
1*10-10	Рост отсутствует Рост отсутствует Рост отсутствует	1*10-10	Рост отсутствует Рост отсутствует Рост отсутствует

Сутки

Рисунок 2 - Характеристика роста референс-штамма Ornithobacterium rhinotracheale К 33 на обогащенной питательной среде (PPLO агаре)

Таким образом, можно заключить, что показатели КОЕ на более питательном кровяном агаре более высокие, что указывает на возможность его использования для наращивания бактериальной массы в дальнейших исследованиях. Оптимальное время культивирования микроорганизма на одной из выбранных нами питательных средах -48 часов, что можно видеть на диаграмме (рисунок 2).

Предыдущие опыты демонстрируют, что наиболее интенсивный рост бактерий изучаемой культуры идёт на обогащённых средах PPLO-агаре и кровяном агаре. Данные среды для наработки бактериальной массы достаточно дороги и экономически невыгодны. Проанализировав результаты, своих экспериментов и литературные данные, пришли к выводу, что в качестве азотно-витаминной основы конструируемой среды нужно использовать дрожжевой экстракт, пептон, в качестве источника углерода – глюкозу. Было исследовано четыре образца. Опыт проводился по следующей схеме. Суспензионную бактериальную культуру Ornithobacterium rhinotracheale 1 млрд. бактериальных клеток титровали 1:10. Брали пробирку с суспензионным разведением Ornithobacterium rhinotracheale в 100 бактериальных клеток в 1 мл и производили посев на испытуемые прототипы накопительных сред. Посев производили стерильными пастеровскими пипетками трехкратно в три чашки Петри на плотной среде.

Конструирование основы для накопительной среды: №1 – дрожжевой экстракт-1,0 г; пептон 5,0г; глюкоза-2,0 г №2 – дрожжевой экстракт-2,0 г; пептон 5,0г; глюкоза-2,5 г №3 – дрожжевой экстракт-3,0 г; пептон 5,0г; глюкоза-3,0 г

№4 – дрожжевой экстракт-4,0 г; пептон 5,0г; глюкоза -3,5 г

Контроль осуществляли на МПА. Чашки Петри культивировали при 370С 48 часов. Затем производили подсчет колонеобразующих единиц (КОЕ). Результаты испытаний приведены на рисунке 3.

Из результатов испытаний следует, что образец №4 имеет лучшие показатели по КОЕ. Таким образом, питательной основой конструируемой среды будет дрожжевой экстракт, пептон и глюкоза.

Хорошей минеральной базой оптимального состава для бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale является набор солей фосфата калия двузамещенного (2,0 г) и семиводного сульфата магния (5,0 г). Соли калия, магния и фосфора стимулируют синтез микробной клетки бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale, а для образования бактериальных белков необходимы анионы, содержащие серу. Таким образом, данный набор солей целесообразно включить в накопительную среду в применяемых дозах.

Рисунок 3 - Колонеобразующие единицы референс-штамма Ornithobacterium rhinotracheale К 33 на сконструированных основах накопительных сред (№1, №2, №3 и №4)

Заключение. В результате вышеизложенных исследований сконструированная нами накопительная среда для бактерий Ornithobacterium rhinotracheale имеет следующий состав: мясопептонный агар – 1000 мл; дрожжевой экстракт - 4,0 г; пептон - 5,0 г; глюкоза - 3,5 г; К2НРО4 – 2,0 г; МgSО4 – 5,0 г. Помимо этого, при определении специфичности селективных свойств среды использовались штаммы других бактерий родов: Proteus, Citrobacter, Morganella, Klebsiella, Staphylococcus, Pseudomonas, Bacillus, Yersinia, Enterococcus, Escherichia, Bordetella, Aeromonas, Hafnia, Listeria, Staphylococcus, Providencia. Они обладали типичными для данных культур получены из музея микроорганизмов биологическими свойствами. Все НИИЦМиБ ФГБОУ ВПО «Ульяновская перечисленные штаммы микроорганизмов ГСХА им. П.А. Столыпина».

ЛИТЕРАТУРА: 1. Емцев, В.Т. Микробиология / В.Т.Емцев, Е.Н. Мишустин. – М.: Дрофа, 2005. – С. 112-114. 2. Колычев Н.М. Ветеринарная микробиология и иммунология / Н.М. Колычев, Р.Г. Госманов. – 3-е изд., перераб и доп. – М.: КолосС, 2003. – С. 98-99. 3. Курьянова Н.Х. Проблемы биологической диагностики орнитобактериоза / Н.Х. Курьянова, Н.И. Молофеева, Д.А. Васильев // Научный вестник – Димитровград, 2009 – с.170-174. 4. De Rosa M., R.Droual, R.P.Chin, H.P. Shivaprasad and R.L. Walker. Ornithobacterium rhinotracheale infection in turkey breeders// Avian Dis., 1996, 40:865-874.

КОНСТРУИРОВАНИЕ СРЕДЫ НАКОПЛЕНИЯ ДЛЯ НАРАБОТКИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ МАССЫ ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEALE

Курьянова Н.Х., Починова Т.В.

Резюме

Орнитобактериоз - бактериальное, высококонтагиозное заболевание птиц, широко распространенное в странах с промышленно развитым птицеводством. Возбудитель орнитобактериоза - Ornithobacterium rhinotracheale циркулирует не только в птицеводческих предприятиях различных стран мира, но и среди диких птиц.

Испытания в данной работе демонстрируют, что наиболее интенсивный рост бактерий изучаемой культуры идёт на обогащённых средах PPLO-агаре и кровяном агаре. По результатам опытов сконструирована оптимальная питательная среда накопления для культивирования бактерий O. Rhinotracheale.

ENVIRONMENT SAVINGS DESIGNING FOR BACTERIAL MASS ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEALE RECOVERY

Kuryanova N.H.,,Pochinova T.V.