Культивирование Leuconostoc mesenteroides на мелассе с целью получения декстрана

В настоящее время в связи с высокой токсичностью и стоимостью основных клеевых компонентов, используемых для склеивания различных изделий, разрабатываются адгезивные материалы на основе экологически безопасных биокомпонентов, содержащие такие биополимеры, как полисахариды и белковые соединения.

Одним из таких компонентов может выступать полисахарид — декстран, обладающий выраженными адгезивными свойствами. Биосинтез декстрана и его свойства зависят от ряда физико-химических факторов, состава среды и штамма-продуцента. Условия синтеза декстрана отработаны в основном в производстве плазмозаменителей. Получение технического декстрана с использованием пищевого сырья в качестве питательной среды как адгезивного материала в настоящее время изучено мало.

Ценный побочный продукт сахарной промышленности — меласса — имеет богатый качественный и количественный состав. Большое содержание сахарозы, позволяет использовать ее для культивирования продуцента декстрана Leuconostoc mesenteroides. Поэтому целью работы являлось получение адгезивных материалов из отходов свеклосахарной промышленности путем микробиологического синтеза.

В работе использовали штамм Leuconostoc mesenteroides ВКМ 271 З-Д. Субстратом для глубинного культивирования служила меласса, разведенная водой. Оптическую плотность исследуемых образцов определяли на спектрофотометре СФ-46 «Ломо» (Россия).

Для выращивания и поддержания культуры L. mesenteroides использовали сахарозосодержащую среду, описанную в регламенте производства полиглюкина на основе декстрана [7]. В качестве инокулята использовали суспензию суточной биомассы бактерии, выращенной на среде Долса [10]. Мелассу разводили водой до необходимой концентрации сахарозы (pH 6,75).

Культивирование L. mesenteroides в экспериментах по оптимизации условий культивирования проводили в мелассной среде, варьируя содержание сахарозы, исходный pH культивирования, содержание MgSO₄, скорости перемешивания. Культивирование проводили как в статических условиях, так и при перемешивании в течение 2—5 сут в зависимости от скорости образования декстрана. Количество биомассы определяли весовым методом. Содержание декстрана определяли весовым методом после двойного осаждения 96 % этанолом [2]. Содержание белка в культуральной жидкости определяли по методу Бредфорд, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин [9].

Оптимизация условий синтеза декстрана микроорганизмом L. mesente-roides

в средах на основе мелассы. В промышленности L. mesenteroides культивируют для получения клинических декстранов на минеральной среде с содержанием сахарозы 10— 30 %. При использовании декстранов для технических целей, например в качестве биоадгезива, целесообразнее для синтеза декстрана использовать вторичное сырье, такое как меласса. Были проведены исследования по оптимизации условий синтеза декстрана в средах, содержащих мелассу, в качестве единственного компонента питательной среды. Для этого изучали влияние концентрации сахарозы мелассы, витаминов и ионов магния, pH среды и скорости перемешивания.

Влияние концентрации мелассы на образование декстрана микроорганизмом L. mesenteroides. При культивировании микроорганизмов на регламентированной среде с сахарозой максимальное количество декстрана (49 г / л) было получено на 4-е сутки роста (рис. 1). В экспериментах с использованием среды Долса декстран образовывался уже на 2-е сутки роста, и его выход был на 17 % выше по сравнению с регламентированной средой, составил 68,7 г / л. Выращивание L mesenteroides показало, что концентрация сахарозы мелассы в питательных средах 5,0—17,5 % приводит к увеличению образования декстрана до 56,8 г / л.

Однако более высокая концентрация мелассы — 20—22,5 % начинала подавлять биосинтез декстрана. Уменьшение выхода декстрана на средах с высокой концентраци ей мелассы, возможно, связано с наличием в составе мелассы веществ, ингибирующих ферменты, участвующих в образовании полисахарида, или с ингибированием синтеза конечным продуктом — декстраном.

Влияние pH среды на основе мелассы на образование декстрана. В ряде работ было выяснено, что оптимальное значение pH для развития L. mesenteroides возможно в достаточно широких пределах от 5 до 8, однако ферментативная реакция протекает при pH 5,2—5,6 [5]. Поэтому представляет интерес выявить оптимальный pH среды на основе мелассы. Исходное значение pH питательных сред, используемых для изучения продуцента декстрана и особенностей его образования, составляет 6,8—6,9. Полученные результаты представлены на рис. 2. Оптимальной величиной pH для синтеза декстрана культурой L. mesenteroides, так же как и в случае с контрольным вариантом, является pH 6,75. При этом выход декстрана на данной среде на 15 % выше, чем в контрольной.

Дальнейшее увеличение pH до 7—8 приводит к резкому снижению синтеза декстрана. Таким образом, pH 6,75 является оптимальным и может быть рекомендован для культивирования L. mesenteroides на среде с мелассой в качестве единственного источника питания.

Влияние режима перемешивания на образование декстрана. L. mesenteroides, являясь аэротолерантным, обладает способностью образовывать декстран как в перемеши-

Сахароза,%

■ Реглам ентированная среда tSl Среда Долса Омелассная

Рисунок 1

Влияние концентрации сахарозы мелассы на образование декстрана

pH

• ■    сахароза □ меласса

Рисунок 2

Влияние pH на образование технического декстрана в средах на основе мелассы

• ■    Регламентированная среда

• □    Среда Долса

• □    мепассная

Рисунок 3

Влияние скорости перемешивания на образование декстрана L. mesenteroides ваемых, так и в стационарных условиях. Однако имеются отдельные сведения о том, что в условиях аэрации ускоряется процесс ферментации.

Учитывая эти данные мы проводили культивирование на круговой качалке при 50, 100, 150, 200 и 250 об / мин в течение 4 сут. Использование в регламентированной среде в качестве источника азота хлорида аммония и низких концентраций пептона (0,02—0,03 %) приводило к тому, что максимум накопления декстрана наблюдался позже и по количественным значениям был меньше, чем при применении среды с дрожжевым экстрактом. Анализируя данные рис. 3, можно отметить, что изменение состава среды приводит также к изменению характера зависимости выхода декстрана от режима перемешивания.

При использовании среды с дрожжевым экстрактом разница в накоплении декстрана при статических условиях и при 200 об / мин не превышала 15 %, Выход декстрана при культивировании на среде с мелассой в статических условиях составил 11,3 г / л. При переходе к динамическим условиям происходит увеличение образования декстрана в опытной и в регламентированной средах.

В целом зависимость количества синтезированного декстрана L. mesenteroides от числа оборотов качалки на обеих средах имела сходный характер: при увеличении скорости перемешивания на 50 об / мин выход декстрана увеличивался в среднем на 10 г / л. При 200 об / мин количество декстрана достигло максимума (52,31 г / л на мелассной среде). Дальнейшее увеличение скорости пе ремешивания до 250 об / мин приводит к подавлению синтеза декстрана.

По литературным данным, витамины: тиамин, никотиновая кислота и пантотенат кальция — являются необходимыми факторами роста для лейконостока [1; 4; 8; 11). Однако для мелассной среды влияние витаминов на выход декстрана неизвестно. Поэтому было изучено влияние вышеуказанных витаминов на биосинтез декстрана бактерией L mesenteroid.es.

При внесении витаминов в количестве 0,5 мг / л декстран начинал образовываться во всех средах на 2-е сутки, но в отличие от контроля, наблюдался более продолжительный процесс ферментации. Максимальный выход декстрана в контрольной среде составил 62,8 г / л на 4-е сутки, в то время как на среде с пантотенатом кальция он достиг 69,5 г / л на 5-е сутки, а на среде с никотиновой кислотой — 66,7 г / л на 6-е сутки. Тиамин также способствовал продлению процесса синтеза декстрана — выход продукта в этом случае составил 64,1 г / л на 5-е сутки (рис. 5).

Повышение концентрации витаминов до 1 мг / л привело к увеличению синтеза декстрана, особенно на среде с пантотенатом кальция, в этом случае наблюдался максимальный выход, который составил 74,3 г / л на 5-е сутки.

Меньшее количество декстрана образовывалось в присутствии никотиновой кислоты — 71,5 г / л на 6-е сутки т, е. снова наблюдается более продолжительный процесс ферментации.

Исходя из наших данных, можно заключить, что витамины увеличивают выход декстрана, и наибольшее его количество наблюдается в средах, содержащих 1 мг / л пантотената кальция и никотиновой кислоты.

Совместное влияние ионов Mg²* и pH на выход декстрана. С учеётом важного влияния ионов магния на структуру декстрана [6; 12] и, соответственно, на его свойства было изучено влияние ионов Mg²* на синтез декстрана и определение оптимальной концентрации MgSO₄ при варьировании исходного значения pH для максимального синтеза технического декстрана культурой Leuconostoc.

В варианте с pH 6,5 выход декстрана на контрольной среде был на 18,5 % меньше, чем в опытных. При сравнении количества декст рана, полученного на питательных средах с различными концентрациями MgSOr можно сказать, что с увеличением количества MgSO4 в питательной среде от 0,01 до 0,06 % выход технического декстрана остается на одинаковом уровне.

Увеличение pH до 6,75 позволило повысить выход экзополисахарида, однако в этом случае с ростом концентрации соли MgSO₄ с 0,01 до 0,06 % происходило снижение количества декстрана. Максимальное декстранооб-разование наблюдалось при росте L. mesenteroid.es в питательной среде с содержанием сульфата магния 0,02 %. В этом случае количество синтезированного декстрана было на 20,5 % выше, чем при использовании MgSO₄ в концентрации 0,06 %.

При увеличении pH среды до 7,0 оптимальная концентрация MgSO4 соответствует 0,04 %: выход декстрана в этом варианте на 23 % больше, чем на среде с 0,01 % содержанием MgSO4, и на 35 % больше, чем в контрольной среде без добавления соли (рис. 4).

Дальнейшее увеличение количества MgSO4 до 0,06 % (59,52 г/л) приводит к снижению декстранообразования. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что с увеличением значения pH среды культивирования возрастает оптимальная концентрация MgSO4, необходимая для максимального выхода декстрана.

Влияние ионов Mg²* на фракционный состав декстрана. Известно, что декстраны, образуемые разными видами микробов и даже разными расами (штаммами) одного вида, не идентичны по своему строению [5].

Экзополисахарид, продуцируемый L. mesenteroides штаммом СФ-4 и служащий для приготовления полиглюкина, имеет 93—94 % связей Ь — 1,6 и почти не разветвленную молекулу [3] Известно также, что на структуру и выход технического декстрана сильное влияние оказывают ионы магния (6; 12; 13].

Представляло интерес изучить фракционный состав технического декстрана, синтезированного в средах, содержащих мелассу и MgSO4. Методом переосаждения были получены три фракции: высокомолекулярная (ВМФ), среднемолекулярная (СМФ) и низкомолекулярная (НМФ).

При фракционировании декстрана, выделенного с мелассной среды, произошли потери

Контроль

Тиамин (0,5 мг/ л)

Никотиновая кислота (0,5 мг/л)

Пантотенат кальция (0,5 мг/л)

Тиамин (1 мг/л)

Никотиновая кислота(1 мг/л)

Пантотенат кальция (1 мг/л)

Рисунок 4

Динамика образования декстрана в средах с добавлением витаминов

• ■    контроль меласса □ 0,01 % сульфат магния 0 0,02 % сульфат магния □ 0,04 % сульфат магния В 0,06% сульфат магния

Рисунок 5. Фракционный состав технического декстрана

Рисунок 5

Фракционный состав технического декстрана

(около 19 %), тогда как в контроле общий выход фракций составил 100 %. При росте на среде с мелассой ВМФ составила 53,6 %, что в 1,5 раза меньше, чем в контроле — 78,18 %. СМФ при росте на мелассе составила 24,83 % — это в 1,3 раза больше по сравнению с контролем, НМФ в опытной пробе составила 2,5 %, как и в контроле.

Полученный в ходе работы на мелассной питательной среде с различным количеством соли MgSO^ (от 0,01 до 0,06 %) технический декстран также фракционировали (рис. 5).

В вариантах сред с концентрацией MgSO4 0,02 и 0,04 % доля ВМФ составила 57,5 % и 59,3 % соответственно. Это превышает контроль на 7—10 %.

Количество ВМФ в среде с минимальным содержанием ионов Mg2* практически не отличимо от контроля и составляет 54,2 %. На среде с максимальным содержанием Mg$O4 получили минимальное количество ВМФ — 50,5 %. Добавление MgSO4 привело к снижению СМФ по сравнению с контролем на 43,0 %. С увеличением концентрации ионов

Mg2+ количество синтезируемой СМФ не меняется.

Количество НМФ с увеличением концентрации MgSO4 в питательной среде снизилось с 7 до 4 %. Максимальное количество НМФ получили на среде с концентрацией MgSO^, равной 0,02 %, что практически в три раза превышает количество НМФ в контроле.

Таким образом, исходя из наших результатов, можно сделать вывод, что добавление соли Mg2* приводит к увеличению ВМФ и НМФ декстрана и снижает количество СМФ декстрана. Оптимальная концентрация MgSO4 — 0,02 %.