Культивирование Leuconostoc mezenteroides на гидролизате биомассы кукурузы

Бактерии рода Leuconostoc – широко распространенные в природе эпифитные бактерии. Встречаются на злаковых культурах [1], фруктах и овощах [2], принимают активное участие в ферментативных процессах: квашения [3], переработки молока [4–6], вхлебопечении [7]. Бактерии Leuconostoc обладают многими характеристиками пробиотика и в будущем могут рассматриваться как потенциальный кандидат [8].

Бактерии рода Leuconostoc представляют собой гетероферментативные молочнокислые бактерии, факультативные анаэробы, проявляют мезофильные свойства, растут при 10˚С [9].

Leuconostoc обладает высокой вариабельностью в утилизации углеводов [10]. При культивировании Leuconostoc mesenteroides на среде с глюкозой в качестве основного углевода в режиме микроаэрации удельная скорость роста µ равна 0,58 ч^-1с выходом биомассы с 1 моль АТФ 16,5 г. Аналогичные показатели

получаются при культивировании на фруктозе. При культивировании на среде с сахарозой µ достигал существенно большего значения (0,98 ч-1) при практически идентичном выходе биомассы в аэрируемой среде – 16,9. Это объясняется тем, что 62% глюкозных остатков молекул сахарозы расходуется на образование декстрана в количестве 10,9 г/л.

Оптимальные физические параметры культивирования: оптимум рН для роста клеток находится в диапазоне 6,6–6,9. Максимальный выход биомассы клеток наблюдается при рН 6,7 (7,76 г./л). Максимальный выход декстрана при 5,0 (8,51 г./л) при времени ферментации 10 ч. Максимальная ферментативная активность при рН 5,5(85 Ед./л). Рост клеток примерно одинаков в диапазоне температур 20–30˚С, однако при 35˚С выход существенно выше (7,85 г./л вместо 5,7) и ферментация проходит на 4 ч раньше, чем при 20˚С (7 ч). Аналогичная закономерность наблюдаетсяи с выходом декстрана (7,94 г./л вместо 6,91 при 20˚С) и фруктозы, однако максимальная активность фермента декстрансахаразы наблюдается при 20˚С. [11].

Основным источником углерода для промышленного культивирования бактерий Leuconostoc является сахароза мелассы. Как известно, Leuconostoc mesenteroides является гетерофер-ментативными микроорганизмами и могут развиваться на различном субстрате. В литературе недостаточно сведений по культивированию этих микроорганизмов ибиосинтезу внеклеточного полисахарида на основе других источников углерода. Большой практический и научный интерес представляет биосинтез внеклеточных бактериальных полисахаридов из альтернативного сырья.Одним из таких видов сырья является растительная лигноцеллюлозная биомасса, технология переработки которой интенсивно развивается в последние годы.

Цель работы – установление закономерностей культивирования бактерий Leuconostoc mesenteroides на гидролизате лигноцеллюлозной биомассы кукурузы с получением биомассы бактерий и внеклеточного полисахарида. В соответствие с целью сформулированы |следующие задачи:

• •    Оптимизировать состав питательной среды на основе гидролизата;

• •    Исследовать режимы культивирования микроорганизмов – уровень рН, температуры

Исследуемые параметры процесса культивирования: выход биомассы бактерий, удельная скорость роста и концентрация внеклеточного полисахарида в культуральной жидкости.

Материалы и методы

Объект исследования – штамм Leuconos-toc mesenteroides В9280 из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ, г. Москва)

Культивирование Leuconostoc mesen-teroides проводили в колбах Эрленмейера объемом 100 мл. В качестве основного источника углерода использовали гидролизат лигноцеллюлозной биомассы. Культуру бактерий в объем приготовленной питательной среды вносили в асептических условиях с помощью микробиологической петли со скошенной поверхности твердой агаризованной среды.

Оптимизацию питательной среды проводили варьированием концентрацией редуцирующих веществ (РВ) гидролизата, сахарозы, белкового и небелкового азота,а также минеральных веществ относительно базового состава среды MRS, рекомендуемого ВКПМ(азот 0,3%, РВ в виде глюкозы 2% или сахарозы2%, соли натрия, калия, магния, марганца).

Исследование проводилось на следующих составах питательных сред:

Среда 1: Гидролизат с различной концентрацией РВ (0,5, 1, 2, 3, 4%)

Среда 2: Гидролизат (2%), белковый концентрат (концентрация азота в среде 0,15,0,3, 0,6%);

Среда 3: Гидролизат (2%), белковый концентрат, небелковый азот (концентрация азота в среде 0,15, 0,3, 0,6%);

Среда 4: Гидролизат (2%), источники азота (0,3%), раствор сахарозы (концентрация сахарозы в среде 0,2, 0,4, 08, 2%);

Среда 5: Гидролизат (2%), источники азота (0,3%), раствор сахарозы (0,4%), минеральные вещества в виде солей (Nа2НРО4 – 5г/л, К 2 НРО 4 – 2,0 г/л, МgSО 4 7Н 2 O – 0,1 г/л; МnSО 4 Н 2 O – 0,05 г./л).

Культивирование проводили при рН 6,5–7,0 и температуре 30˚С

Гидролизат лигноцеллюлозной биомассы кукурузы представляет собой продукт хемо-ферментативной деструкции биополимеров целлюлозы и гемицеллюлозы клеточной стенки (стебель и листья) кукурузы после предварительной водной экстракции сахарозы [13]. Концентрация РВ гидролизата составляет 3–4% и представлена преимущественно глюкозой, арабинозой и ксилозой.

В качестве белкового источника азота применяли стерильный раствор дрожжевого экстракта (ТУ 9385-007-39184474-2003) и пептона (ГОСТ 13805-76) в соотношении 1:1 с массовой долей азота не менее 1,5%. В качестве небелкового азота применяли раствор сульфата аммония

(ГОСТ 9097-82) и ацетата аммония (ГОСТ 3117-78) также в соотношении 1:1. Сахарозу (ГОСТ 583375) вводили в состав питательной среды в виде стерильного раствора с концентрацией 20%.

Оптимизацию режимов культивирования проводили регулированием уровней рН (4, 5, 6, 7, 8) и температуры (25, 30, 35˚С). Уровень рН регулировали добавлением фосфатного и ацетатного буфера с соответствующими значениями рН (4, 5, 6, 7, 8).

Процесс культивирования проводили в инкубаторе ЕS-20 в течении48 часов.

Контролируемые параметры процесса – изменение оптической плотности (ОП), РВ, концентрация полисахарида, выход бактериальной биомассы.

Прирост биомассы : измеряется турбидиметрическим методом при длине волны 650 nm, калиброванному по сухому весу клеток. Изменение 1 Ед.оптической плотности при 650 нм эквивалентно 0,4 г сухого вещества в литре [10].

рН питательной среды определяли рН-метром 150-МИ («Аналит-Нева» г. Санкт-Петербург)

Концентрация внеклеточного полисахарида : Нерастворимые полисахариды ( нп ) и бактериальную биомассу отделяли в поле центробежных сил. Для этого 5 мл культуральной жидкости обрабатывали на центрифуге в течении 10 мин при 8 тыс. оборотов/мин. К полученному осадку добавляли раствор соляной кислоты для проведения кислотного гидролиза. В гидролизате определяли содержание редуцирующих веществ ( РВнп ).

В культуральной жидкости ( кж ) после центрифугирования определяли остаточное содержание редуцирующих веществ ( РВкж ).

Растворимые полисахариды ( рп ) в культуральной жидкости после центрифугирования определяли добавлением этилового или изопропилового спирта (соотношения культуральная жидкость: спирт 1:3) с последующей декантацией после 12 часов выдержки при температуре 8˚С. В полученном осадке после соответствующего кислотного гидролиза также определяли содержание редуцирующих веществ ( РВрп ).

Кислотный гидролиз осуществляли добавлением 1 мл 2 н НСl к исследуемому образцу и выдерживанием его на кипящей водяной бане в течение30 мин в для гидролиза полисахаридов. После нейтрализации в полученном гидролизате определяли концентрацию РВ.

Концентрацию редуцирующих веществ (РВ) определяли динитросалициловым методом: к 120 мкл исследуемой пробы после центрифугирования добавляли 1200 мкл дистиллированной воды и 600 мкл динитросалицилдовой кислоты (DNSA). Пробы ставили на 10 мин в водяную баню на 100˚С затем на 5 мин в баню при 0˚С. Затем во все пробы добавляли по 6 мл дистиллированной воды и измеряли оптическую плотность при 540 нм. В качестве контроля использовали дистиллированную воду.

Параметры роста периодической культуры оценивали по удельной скорости роста и выходу биомассы согласно рекомендациям [14].

Результаты и обсуждения

Изучение процесса культивирования на гидролизате с различной концентрацией РВ (0,5, 1, 2, 3%) без внесения других компонентов ( среда 1 ) показало, что максимальный прирост биомассы наблюдается при концентрации РВ в питательной среде 0,5 и 1% (таблица 1). Однако, максимальная удельная скорость роста микроорганизмов отмечается при концентрации РВ 2%. С повышением концентрации РВ в питательной среде наблюдается снижение выхода биомассы и ассимиляции ими РВ (РВкж).

При концентрации РВ2 и 3% заметно накопление растворимых полисахаридов (РВрп).

Таким образом, оптимальная концентрация РВ гидролизата в условиях данного эксперимента составляет 0,5–2%, при этом максимальный выход биомассы от РВ отмечен при 0,5%, а максимальная скорость роста и концентрация полисахарида в культуральной жидкости, соответственно, при 2% РВ.

Добавление к гидролизату с концентрацией РВ 2% белковых источников азота (концентрация азота в среде 0,15,0,3, 0,4, 0,6%) в виде белкового концентрата ( среда 2 ) способствовало существенному приросту биомассы и повышению ассимиляции РВ (таблица 2). Максимальный выход биомассы (5,8%) происходит при наибольшей концентрации белкового азота в среде(0,6%), однако при этом высока и остаточная концентрация РВ в культуральной жидкости. Удельные скорости роста микроорганизмов близки для всех концентраций азота в среде.

Накопление внеклеточных полисахаридов смещается в сторону нерастворимой фракции (РВнп), при этом максимальное количество полисахаридов соответствует максимальному количеству азота в среде.

Замена белковых источников азота на небелковые в той же концентрации (концентрация азота в среде 0,15, 0,3, 0,4, 0,6%) (среда 3) также приводит к повышению прироста биомассы приповышении концентрации азота, однако заметно ниже в сравнении с органическими источниками среды 2 (таблица 3). При концентрации азота 0,4%, прирост биомассы и выход биомассы от РВ меньше, практически, в два раза, чем при концентрации азота 0,15%, тогда как остаточные концентрации РВ в культуральной жидкости (РВкж) довольно близки. Максимальный выход биомассы от РВ и максимальная удельная скорость роста соответствуют концентрации небелкового азота в среде 0,15%.

Как и на среде 2 накопление полисахаридов связано с биомассой, отделяемой центрифугированием (РВнп).

Добавление в питательную среду гидролизата (2% РВ) сахарозы (концентрация сахарозы 0,2, 0,4, 08, 2%) и при наличии в среде органического азота (0,3%) – среда 4 , существенно интенсифицировало процесс с образованием значительного количества бактериальной биомассы при повышенном потреблении РВ (таблица 4). Как известно, сахароза является индуктором синтеза внеклеточного полисахарида бактериями Leuconostoc . Примерно через 12 часов культивирования на поверхности культуральной жидкости формировалась устойчивая пленка, образуя к концу культивирования плотный слой с высокой адгезией к стенкам колбы.

Максимальный прирост биомассы и наибольшая удельная скорость роста наблюдаются при концентрациях сахарозы 0,2 и 2% (таблица 4). Выход биомассы при этих значениях сахарозы составляет 9,3 и 7,6% соответственно.

Данным концентрациям сахарозы (0,2 и 2%) характерно накопление как нерастворимой (РВнп), так и растворимой фракции полисахаридов (РВрп).

Добавление минеральных веществ в виде солей (Nа 2 НРО 4 -5 г./л, К 2 НРО 4 – 2,0 г/л, МgSО 4 7Н 2 O – 0,1 г/л; МnSО 4 Н 2 O – 0,05 г./л), к питательной среде, состоящей изгидролизата (2% РВ), азота (0,3%), сахарозы (0,2%), среда 5 , положительно сказываются на приросте биомассы бактерий и степени усвоенияРВ питательной среды. Наибольшему выходу биомассы (8,5%) способствовало введение в состав среды фосфата натрия, при этом минимальная остаточная концентрация РВ культуральной жидкости (РВкж ) отмечается при содержании в среде фосфата калия (таблица 5) Значения удельных скоростей роста во всех образцах близки друг к другу.

Таблица 1.

Эффективность культивирования бактерий на среде 1

Table 1

Microbial growth parameters in medium 1

РВ нач, % RSm, %	РВ кж, %, RSr, %	РВ нп, %, RSiр, %	РВ рп, %, RSsр, %	Прирост биомассы, г/л, Growth of biomass, g/l	Выход биомассы от РВ, % Yield of biomass from RSst, %	Уд. скор. роста,µ, ч-1 Sресifiс growth rates, µ,h-1
0,5	0,36 ±0,002*	0,007 ±0,001	0,065 ±0,010	0,147 ±0,012	2,9	0,038 ±0,0053
1,0	0,85 ±0,063	0,050 ±0,020	0,157 ±0,017	0,280 ±0,033	2,3	0,050 ±0,0079
2,0	1,20 ±0,159	0,096 ±0,028	0,324 ±0,042	0,376 ±0,023	1,9	0,052 ±0,0098
3,0	0,45 ±0,124	0,080 ±0,019	0,252 ±0,013	0,216 ±0,030	0,7	0,035 ±0,0124
4,0	2,15 ±0,180	0,086 ±0,040	0,120 ±0,022	0,114 ±0,016	0,3	0,016 ±0,0028

*при Р˃95

Примечание: РВ нач , % – начальная концентрация РВ в среде; РВ кж , % – концентрация РВ в культуральной жидкости после отделения биомассы; РВ кж /РВ нач , % – доля неусвоенного РВ в культуральной жидкости; РВ нп , % – концентрация РВ в нерастворимом осадке после отделения биомассы; РВ ро , % – концентрация РВ в растворимом осадке после осаждения спиртом культуральной жидкости.

Note: RSm, % – initial concentration of reducing sugars in the medium; RSr – the residual concentration of reducing sugars in the medium; RSiр, % – reducing sugars in insoluble polysaccharides; s; RSsр, % – reducing sugars in soluble polysaccharides

Таблица 2.

Эффективность культивирования бактерий на среде 2

Table 2.

Microbial growth parameters in medium 2

Концентр. азота, % Nitrogen concentration, %	РВ кж, %, RSr, %	РВ нп, %, RSiр, %	РВ рп, %, RSsр, %	Прирост биомассы, г/л, Growth of biomass, g/l	Выход биомассы отРВ, % Yield of biomass from RSst, %	Уд. скор. роста,µ, ч-1 Sресifiс growth rates, µ,h-1
0,15	0,102 ±0,005	0,257 ±0,029	0,182 ±0,010	0,816 ±0,024	4,1	0,051 ±0,021
0,3	0,207 ±0,096	0,433 ±0,193	0,157 ±0,023	0,937 ±0,035	4,7	0,053 ±0,016
0,4	0,157 ±0,039	0,498 ±0,206	0,207 ±0,033	0,905 ±0,033	4,5	0,054 ±0,024
0,6	0,282 ±0,076	0,608 ±0,196	0,257 ±0,018	1,165 ±0,161	5,8	0,057 ±0,029

Таблица 3.

Эффективность культивирования бактерий на среде 3

Table 3.

Microbial growth parameters in medium 3

Концентр. азота, % Nitrogen concentration, %	РВ кж, %, RSr, %	РВ нп, %, RSiр, %	РВ рп, %, RSsр, %	Прирост биомассы, г/л, Growth of biomass, g/l	Выход биомассы от РВ, % Yield of biomass from RSst, %	Уд.скор. роста,µ, ч-1 Sресifiс growth rates, µ,h-1
0,15	0,345 ±0,029	0,174 ±0,021	0,096 ±0,029	1,411 ±0,182	7,1	0,0840 ±0,010
0,3	0,357 ±0,109	0,214 ±0,074	0,107 ±0,013	0,973 ±0,012	4,9	0,0746 ±0,020
0,4	0,300 ±0,057	0,389 ±0,092	0,082 ±0,020	0,506 ±0,104	2,5	0,0574 ±0,013
0,6	0,408 ±0,044	0,339 ±0,024	0,145 ±0,028	0,416 ±0,074	2,1	0,0448 ±0,011

Таблица 4.

Эффективность культивирования бактерий на среде 4

Table 4.

Microbial growth parameters in medium 4

Концентр сахарозы, % sucrose concentration, %	РВ кж, %, RSr, %	РВ нп, %, RSiр, %	РВ рп, %, RSsр, %	Прирост биомассы, г/л, Growth of biomass, g/l	Выход биомассы от РВ, % Yield of biomass from RSst, %	Уд. скор. роста, µ, ч-1 Sресifiс growth rates, µ,h-1
0,2	0,207 ±0,021	0,558 ±0,021	0,182 ±0,015	1,868 ±0,011	9,3	0,070 ±0,011
0,4	0,332 ±0,018	0,383 ±0,077	0,220 ±0,035	1,461 ±0,092	7,3	0,064 ±0,013
0,8	0,52 ±0,099	0,383 ±0,051	0,282 ±0,031	1,229 ±0,013	6,1	0,060 ±0,008
2,0	0,580 ±0,050	0,433 ±0,104	0,308 ±0,033	1,522 ±0,065	7,6	0,065 ±0,018

Таблица 5.

Эффективность культивирования бактерий на среде 5

Table 5.

Microbial growth parameters in medium 5

Источник минеральных в-в Sоurсе of minerals	РВ кж, %, RSr, %	РВ нп, %, RSiр, %	РВ рп, %, RSsр, %	Прирост биомассы, г/л, Growth of biomass, g/l	Выход биомассы от РВ, % Yield of biomass from RSst, %	Уд. скор. роста, µ, ч-1 Sресifiс growth rates, µ,h-1
МnSО 4 Н 2 O	0,270 ±0,023	0,790 ±0,087	0,583 ±0,076	1,416 ±0,096	7,4	0,0517 ±0,021
МgSО 4 7Н 2 O	0,370 ±0,045	0,840 ±0,054	0,395 ±0,023	1,474 ±0,082	7,1	0,0527 ±0,015
Nа 2 НРО 4	0,250 ±0,038	0,414 ±0,030	0,157 ±0,009	1,708 ±0,089	8,5	0,0562 ±0,023
К 2 НРО 4	0,196 ±0,039	0,560 ±0,041	0,383 ±0,077	1,416 ±0,079	7,1	0,0517 ±0,013

Таблица 6.

Эффективность культивирования бактерий при различном рН

Table 6.

Microbial growth parameters at different рН

рН	РВ кж, %, RSr, %	Выход биомассы от РВ, % Yield of biomass from RSst, %	Уд. скор. роста, µ, ч-1 Sресifiс growth rates, µ,h-1
4,0	2,07 ±0,034	0,2	0,0052 ±0,0011
5,0	2,4 ±0,028	0,3	0,0077 ±0,0011
6,0	0,32 ±0,032	5,0	0,0640 ±0,0139
7,0	0,28 ±0,046	6,1	0,0671 ±0,0113
8,0	0,38 ±0,033	3,1	0,0417 ±0,0059

Таблица 7.

Эффективность культивирования бактерий при различной температуре

Table 7.

Microbial growth parameters at different temperatures

Температура, ˚С Temperature, ˚С	РВ кж, %, RSr, %	Выход биомассы от РВ, % Yield of biomass from RSst, %	Уд. скор. роста, µ Sресifiс growth rates, µ, h-1
25,0	0,284 ±0,035	4,6	0,0505 ±0,0011
30,0	0,217 ±0,039	6,8	0,0671 ±0,0136
35,0	0,163 ±0,029	5,0	0,0583 ±0,0066

Добавление минеральных веществ к питательной среде значительно увеличило накопление нерастворимых (РВнп) и растворимых (РВрп) полисахаридов. При этом, максимальное количество нерастворимой фракции – РВнп образуется на среде с добавлением магния (0,84%), тогда как растворимых полисахаридов РВрп больше всего образуется на среде с марганцом (0,583%).

Значение рН культуральной жидкости имеет определяющее значение в процессе культивирования бактерий Leuconostoc . Культивирование при различных значениях рН (4, 5, 6, 7, 8) на питательной среде из гидролизата (РВ 2%), органического азота (0,3%) и сахарозы (0,2%) показало (таблица 5), что при рН 4 и 5 значения РВ выше исходного. Вероятно, это связано с тем, что при рН 5–5,5 бактерии Leuconostoc максимально проявляют активность фермента декстрансахараза, гидролизующего сахарозу. Оптимум для развития биомассы и потребление РВ находится в диапазоне рН 6 и 7. Микроорганизмы способны также развиваться и при более высоких значениях (рН 8 и выше), однако продолжительность процесса заметно возрастает. Максимальный выход биомассы (6,1%) и наибольшая удельная скорость роста соответствуют значению