Культуральные свойства бифидобактерий, лактобацилл и пекарских дрожжей под влиянием УФ-облучения воды, входящей в состав питательных сред

Известно стимулирующее влияние некоторых физических факторов на биологические свойства микроорганизмов. Например, повышенное давление газовой среды способствует активации грамположительных микроорганизмов (1, 2). Имеются данные об оптимизации активности ряда микроорганизмов in vitro под влиянием радиации в низких дозах и солнечной активности (3).

Целью наших исследований была оценка интенсивности роста и развития, ферментативной активности, культуральных свойств, частоты переноса генетического материала и выживаемости различных микроорганизмов (бифидобактерии, лактобациллы и пекарские дрожжи) при культивировании на средах, приготовленных с использованием воды, обработанной ультрафиолетовыми лучами.

Методика. Объектом исследования служили коллекционные культуры микроорганизмов, используемых в хлебопечении, пивоварении и при изготовлении кисломолочных продуктов, следующих видов: Lactobacillus casei , Bifidobacterium lon-gum , Pseudomonas aeruginosa , Escherichia coli , Staphylococcus aureus , Saccharomyces cerevisiae (коллекция Института медико-биологических проблем РАН, Москва). Объем воды, необходимый для работы, обрабатывали УФ-лучами ( λ = 190-250 нм) на установке ДРТ-400 до увеличения внутренней энергии в 2 раза (определяли вискозиметром). При этом световой поток мощностью 0,4 Вт/см² моделировали с помощью дополнительного электромагнитного устройства.

На этой воде (I вариант) приготовляли следующие стандартные питательные среды: МРС, «Бактофок», LB и сусло-агар для культивирования соответственно лактобацилл, бифидобактерий, аэробных тест-культур и дрожжей; для оценки частоты переноса плазмид при конъюгации использовали мясо-пептонный бульон. Контролем служили аналогичные среды на воде, не обработанной УФ-лучами (II вариант).

Лиофилизированные культуры регидрировали и 10-кратно раститровывали в питательных средах, а затем инкубировали 48 ч при 37 оС; выживаемость оценивали по количеству выросших колоний. Для определения числа живых клеток колонии лактобацилл и бифидобактерий извлекали из толщи агара, разводили в стерильном физиологическом растворе и раститровывали в пробирках, содержащих стандартную среду для роста, после чего посевы инкубировали в термостате при 37 оС в течение 24 ч и подсчитывали число выросших клеток.

С целью выявления микробного антагонизма в питательных средах (I вариант) тест-штамм лактобацилл выращивали в течение 24 ч при 37 ^оС на поверхности питательного агара в форме макроколонии. По окончании инкубации макроколонию стерилизовали парами хлороформа и заливали полужидким агаром, содержащим культуры St. aureus (золотистый стафилококк), Ps. aeruginosa (синегнойная палочка) и E. coli ( кишечная палочка). Посевы инкубировали в течение 24 ч, а затем определяли диаметр зоны задержки роста вокруг макроколонии. Для сравнения влияния на биологические свойства тест-культур микроорганизмов других факторов помимо УФ-облучения мы обрабатывали воду в течение 14 сут направленным потоком тепловых нейтронов плотностью 0,2/см² в 1 с, что соответствовало параметрам космического излучения, испытываемого биообъектом во время орбитального полета.

При исследовании частоты переноса генетического материала в жидкой питательной среде использовали свежие агаризированные культуры двух штаммов E. сoli : J5-3 — содержит плазмиды pR1, несущие детерминанты резистентности к антибиотикам широкого спектра действия (ампициллин, карбенициллин и канамицин); С600 характеризуется чувствительностью ко всем антибиотикам, кроме налидиксовой кислоты. Эти штаммы инкубировали при температуре 37 ^оC в воде, обработанной УФ-лучами; в контроле инкубацию проводили в обычных средах при тех же условиях. Затем культуры пересевали на бульон и помещали на 24 ч в условия, соответствующие преинкубационным, после чего культуру донора смешивали с культурой реципиента в соотношении 1:1 (концентрация живых клеток 1 ⋅ 10⁹ КОЕ/мл). Анализировали конъюгационные системы донор—реципиент R-плазмид при четырех комбинациях сред: культуры выращивали в средах, приготовленных по I и II вариантам, а конъюгацию проводили в средах соответственно II и I вариантов, и наоборот.

После инкубации культуры высевали на среду, содержащую два антибактериальных агента для селекции трансконъюгантов: антибиотик, к которому устойчив штамм-донор, и налидиксовую кислоту. По окончании инкубации количество выросших на чашках колоний трансконъюгантов подсчитывали по формуле N = lg A/B, где N — частота передачи плазмид, A — число колоний трансконъюгантов (КОЕ/мл), В — число живых клеток реципиента в конъюгационной смеси (КОЕ/мл).

Ферментативную активность культур, выросших в питательных средах, содержащих воду, обработанную УФ-лучами, оценивали на основе выработки индуци-бельного ( β -лактамаза) и конститутивного (гемолизин) ферментов. Для определения активности β -лактамазы культуру штамма E. coli (продуцента β -лактамазы) выращивали в виде макроколонии на среде с ампициллином (60 мг/мл) в течение 1 сут при температуре 37 ^оС, затем осуществляли стерилизацию в парах хлороформа и на поверхность среды помещали культуру штамма E. coli, чувствительного к ампициллину. Посев инкубировали в течение 1 сут при температуре 37 ^оС. Об активности β -лактамазы судили по диаметру зоны роста чувствительного к ампициллину штамма вокруг макроколонии штамма — продуцента β -лактамазы.

Активность гемолизина анализировали после инкубации в течение 1 сут при 37 оС культуры золотистого стафилококка, обладающего гемолитическими свойствами, которую дозировано наносили на поверхность 5 % кровяного агара, приготовленного на основе воды, обработанной УФ-лучами. Контролем служил кровяной агар на обычной воде.

При исследовании культуральных свойств Sac. cerevisiae в первой серии экспериментов навеску сухих пекарских дрожжей (0,5 г) суспензировали в 10 мл физиологического раствора в течение 5-10 мин и высевали в чашки Петри на питательные среды Сабуро и сусло-агар, содержащие дистиллированную воду и воду, подвергнутую УФ-облучению. Чашки помещали в термостат и выдерживали при 29 оС в течение 2 сут. Количество клеток и спор дрожжей в суспензии подсчитывали в камере Горяева.

Во второй серии экспериментов оценивали влияние УФ-облученной воды на кинетику развития клеток дрожжей. Для этого навеску сухих пекарских дрожжей (0,2 г) суспензировали в течение 15-20 мин в 5 мл физиологического раствора, приготовленного на УФ-облученной и необлученной воде. Посев проводили на плотные и жидкие питательные среды. При этом сусло готовили либо полностью на облученной, либо на обычной воде. Исходную суспензию дрожжей в 3-кратной повторности высевали после ряда разведений на плотные среды. Чашки выдерживали в термостате при 29 оС в течение 2 сут.

В колбы с жидкими средами (25 мл) переносили по 1 мл суспензии, в которой содержалось 1-2 ⋅ 10⁷ клеток дрожжей. Эти колбы выдерживали в термостате в течение всего эксперимента при 29 ^оС. Объем каждой пробы для микроскопического анализа и посева не превышал 0,2 мл. Посев проводили на плотные среды аналогично вышеописанному. Для определения стадии роста дрожжей подсчитывали общее число клеток.

Результаты. Выживаемость лактобацилл при культивировании в 2 % среде МРС, приготовленной на воде по I и II вариантам, составляла соответственно 3 ⋅ 10¹⁰ ± 1 ⋅ 10⁸ и 5 ⋅ 10⁸ ± 1 ⋅ 10⁶ клеток, число живых клеток в колониях — соответственно 1,4 ⋅ 10¹⁰ ± 1,0 ⋅ 10⁶ и 2,0 ⋅ 10⁹ ± 3,0 ⋅ 10⁶ КОЕ (3 ⋅ 10⁹ ± 2 ⋅ 10⁵ и 6 ⋅ 10⁸ ± 1 ⋅ 10⁴ КОЕ/мл). Число колониеобразующих клеток при посеве штамма К-25 L. casei , хранившегося в лиофильном состоянии 13 лет, на среды, содержащие обработанную УФ-лучами воду, составляло 3 ⋅ 10⁹ КОЕ на одну ампулу (объем высушенного материала 3 мл); во II варианте среды роста клеток не выявлено. Подобная тенденция наблюдалась как на первые, так и в последующие сутки культивирования. Вместе с тем эти свойства не воспроизводились при последующих пассажах на обычные среды. Аналогичные данные получены по выживаемости бифидобактерий при выращивании в 2 % среде «Бактофок»: I и II варианты — соответственно 1,4 ⋅ 10⁶ ± 3,0 ⋅ 10⁴ и 2,0 ⋅ 10⁵ ± 1,0 ⋅ 10⁴ КОЕ. Антагонизм лактобацилл по отношению к стафилококкам, кишечным и синегнойным палочкам также возрастал при выращивании на средах, приготовленных на основе

облученной воды:
Вид микроорганизма	Вариант среды	Диаметр зоны задержки роста колонии, мм
Staphylococcus aureus	I	2,0±0,5
	II	0,7±0,1
Pseudomonas aeruginosa	I	1,0±0,2
	II	0,8±0,3
Escherichia coli	I	1,0±0,3
	II	0,5±0,3

Различия по активности клеток были достоверными в отношении стафилококка и кишечной палочки; в случае синегнойной палочки отмечена лишь тенденция. При длительном выдерживании культур лактобацилл на средах, содержащих облученную воду, не было обнаружено контаминации другими культурами, в то время как в контроле последняя наблюдалась уже на 4-ю нед.

Выживаемость лактобацилл при культивировании в 2 % среде МРС, содержащей воду, обработанную направленным потоком нейтронов, составляла 1 ⋅ 10¹⁰ ± 1 ⋅ 10⁶ против 1 ⋅ 10⁸ ± 1 ⋅ 10⁶ клеток на средах с дистиллированной водой. Эти данные сопоставимы с таковыми по I варианту эксперимента. Следует отметить, что окраска среды МРС изменялась от светло-коричневой до светло-зеленой как в случае 100

обработки воды УФ-лучами, так и нейтронами. Однако свойства колоний лактобацилл, выросших на этих средах, различались: число живых клеток при обработке воды нейтронами было меньше (7 ⋅ 10⁴ ± 1 ⋅ 10³), чем при УФ-облучении (6 ⋅ 10⁸ ± 1 ⋅ 10⁶).

Частота передачи генетического материала (плазмида pR1) между взрослыми клетками E. coli и целостность этого материала не зависели от условий проведения эксперимента — 10^–5 ± 10^–7. У всех выделенных клонов в опытных и контрольных сериях сохранялся полный набор фенотипических признаков, контролируемых плазмидой.

По ферментативной активности культур, выращенных на средах, приготовленных по I и II вариантам, существенной разницы не отмечено:

Фермент	Вариант среды	Радиус зоны роста колонии, мм
Гемолизин	I	8±1,3
	II	7±2,2
β-Лактамаза	I	35±3,0
	II	31±8,0

При исследовании культуральных свойств Sac. cerevisiae по I варианту выявлено большее число жизнеспособных спор дрожжей (2,5 ⋅ 10¹⁰ кл/мл), чем по II варианту (3,4 ⋅ 10⁸ кл/мл). Следовательно, вода, подвергнутая УФ-облучению, способствует выходу клеток из анабиоза.

При оценке динамики роста клеток дрожжей по всем сериям опыта прослеживались три фазы: лагфаза, фаза логарифмического роста и стационарная фаза. Лагфаза (период адаптации клеток и подготовки к почкованию) во всех вариантах начиналась через 4 ч после внесения клеток в среду. Эта фаза роста дрожжей является наиболее важной, так как отражает как первоначальное число клеток, вышедших из анабиоза, так и их функциональную активность.

В первой серии эксперимента наибольшая численность КОЕ дрожжей отмечена при выходе из анабиоза. При этом размер клеток в течение первых 2-3 ч составлял 12-14 мкм, тогда как в контроле — 6-10 мкм. Возможно, мембраны клеток способствовали усилению процесса накопления веществ, а ферментативные системы не успевали перестраиваться на синтез необходимых органелл, в результате чего клетка, вероятно, готовая к почкованию, не размножалась. Через 3-4 ч в питательной среде оставались адаптированные клетки и начиналось почкование.

Фаза логарифмического роста — это период, во время которого повышается интенсивность размножения клеток. Во всех вариантах этот период продолжался 810 ч. При использовании УФ-облученной воды как для физиологического раствора, так и для приготовления сусла, наблюдалась максимальная скорость роста клеток дрожжей.

В стационарной фазе (на 13-14-й ч) практически прекращалось образование новых клеток; при микроскопировании отмечено окончание почкования; число клеток в диплоидной стадии не превышало 2-3 %.

Численность КОЕ во всех вариантах к 14 ч эксперимента возрастала на 3-3,5 порядка, то есть количество питательных веществ в культуральных средах было приблизительно одинаковым.

Итак, использование УФ-облученной воды способствует выходу из состояния анабиоза наибольшего числа клеток дрожжей. Для снижения чувствительности клеток дрожжей к двойному действию УФ-облучения (физиологический раствор и питательная среда), которое стимулирует выход из анабиоза наибольшего числа клеток, необходимо подбирать культуральные среды, температуру, рH, режим аэрации и др. Численность КОЕ дрожжей в проведенных сериях эксперимента не зависела от содержания в составе культуральных жидкостей облученной воды, а была обусловлена только количеством питательных веществ в последних. Поэтому в хлебопечении и спиртовом производстве необходимо учитывать такие показатели дрожжей, как подъемная сила, мальтазная активность, устойчивость к повышению температуры.

Таким образом, проведенные нами исследования убедительно свидетельствуют об интенсификации деления и роста микроорганизмов, используемых в пищевой биотехнологии, под влиянием воды, обработанной ультрафиолетовыми лучами. При этом повышается вероятность «оживления» микроорганизмов из лиофилизированных коллекций (КОЕ повышается в 100 раз), срок годности которых истек, появляется возможность быстро и продуктивно включать архивированные штаммы в производственный процесс, минуя стадии многочисленных пассажей и экономя время, причем увеличение биомассы (в 10 раз) происходит быстрее, чем при использовании необлученной воды. Положительным обстоятельством является то, что у тестируемых объектов не воспроизводятся эти свойства при последующих пассажах на среды, содержащие обычную воду, то есть изменения не затрагивают генома. Показано, что в культурах, выращенных на средах, содержащих облученную воду, усиливается продукция бактериоцина, поэтому субстанция, где культивируют тестируемые объекты, является агрессивной по отношению к внешней колонизации. Отсутствие выраженности ферментативной активности микроорганизмов спорно, так как в других вариантах эксперимента возрастала активность бактериоцина, являющегося таким же экзоферментом, как гемолизин и β -лактамаза. Следует отметить стабильность питательных сред, приготовленных на основе УФ-облученной воды. Все описанные достоинства и преимущества использования УФ-облученной воды, на основе которой изготавливают культуральные среды для микроорганизмов, участвующих в технологических процессах производства различных продуктов питания, позволяют рекомендовать этот метод с целью повышения эффективности ферментативных процессов, интенсификации деления и роста клеток, а также повышения их жизнеспособности.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    I l y i n V.K., V i c t o r o v A.N., P a v l o v B.N. e.a. Cultural, biochemical, genetic and ultrastructural microbial characteristics under high pressure. Vth International Meeting on High Pressure Biology. St. Petersburg, 1997.

• 2.    I l y i n V.K., V i c t o r o v A.N., P a v l o v B.N. e.a. Some peculiarities of human microflora in argonoxygen hyperbaricgaseous media. IV^th joint meeting of Japanese and European seminars on High Pressure Bioscience and Biotechnology. University of Heidelberg, Germany, 1998.

• 3.    Ц е т л и н В.В., Б о н д а р е н к о В.А., В и к т о р о в А.Н. и др. Вариации радиационной обстановки и развития микробного сообщества на околоземной станции МИР в зависимости от солнечной активности. В кн.: Атлас временных вариаций природных, антропогенных и социальных процессов. М., 2002, 3: 556-560.

Государственный научный центр Российской Федерации Ин-     Поступила в редакцию 24

ститут медико-биологических проблем РАН,                   октября 2003 года

123007, Москва, Хорошовское шоссе, 76 а;

Общественное движение «Берегиня» , Москва;

Закрытое акционерное общество «Зерноком», Саратов

CULTURAL PROPERTIES OF BIFIDOBACTERIA, LACTOBACILLUS AND BAKERY YEAST UNDER THE INFLUENCE OF

UV-IRRADIATION OF H 2 O OF NUTRIENT MEDIA

V.K. Il’in, S.S. Esiev, L.V. Rakitskaya, D.A. Tyurina, Z.O. Solov’eva, E.A. Deshevaya

S u m m a r y

The authors determined an efficiency of usage of UV-irradiated H 2 O in cultural media for microorganisms participated in production of foodstuff. The activity of growth and development and also different properties of bifidobacteria, lactobacillus and bakery yeast were analyzed. The frequency of genetic transfer of Escherichia coli markers in liquid nutrient media was estimated. It was shown, that under the influence of UV-irradiated H 2 O the propagation of microorganisms is accelerated. The number of colony forming units of yeast do not depends on UV-irradiated H 2 O in media, but only on amount of nutrient substances. The application of UV-irradiated H 2 O recommended for production of foodstuffs in different processes which are used microorganisms and nutrient media.

Новые книги

Ф е н ч е н к о Н.Г., Х а й р у л л и н а Н.И., С и р а з е т д и н о в Ф.Х. История создания и генеалогия черно-пестрой породы крупного рогатого скота. Уфа: БНИИСХ, 2002 (2003), 333 с.

В монографии обобщены результаты многолетних исследований авторов и других отечественных селекционеров, занимающихся совершенствованием черно-пестрой породы крупного рогатого скота. Отражены история создания и регионы разведения породы, а также численность черно-пестрого скота. Описаны хозяйственно-биологические и продуктивные качества животных этой породы. Приведена оценка генеалогической структуры породы, включая характеристику линий и семейств. Уделено внимание влиянию линейной принад- лежности на генотип быков-производителей. Отмечена необходимость дальнейшего улучшения телосложения и мясных качеств животных. Рассматриваются возможности совершенствования породы как методом чистопородного разведения при использовании перспективных линий, семейств и их сочетания, так и посредством скрещиваний с представителями других пород. Особое значение отведено оценке влияния производителей импортной селекции на селекционные, технологические показатели продуктивности, продолжительность хозяйственного использования, воспроизводительные и мясные качества при снижении затрат кормов на производство продукции при выращивании животных черно-пестрой породы в различных географически отдаленных регионах.