L. acidophilus K 1902 - перспективный штамм для использования в биотехнологии

Тарабукина Н.П.; Неустроев М.П.; Маркова А.М.; Скрябина М.П.; Обоева Н.А.; Парникова С.И.; Tarabukina N.P.; Neustroev M.P.; Markova A.M.; Skryabina M.P.; Oboeva N.A.; Parnikova S.I.

doi:10.31588/2413_4201_1883_4_260_253

Научные статьи \ Математика. Естественные науки \ Биологические науки в целом \ Микробиология \ Классификация и систематика микроорганизмов

L. acidophilus K 1902 - перспективный штамм для использования в биотехнологии

Автор: Тарабукина Н.П., Неустроев М.П., Маркова А.М., Скрябина М.П., Обоева Н.А., Парникова С.И.

Журнал: Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана @uchenye-zapiski-ksavm

Статья в выпуске: 4 т.260, 2024 года.

Бесплатный доступ

Для разработки пробиотических препаратов, также пищевых и кормовых добавок очень важен поиск новых штаммов - продуцентов с высокой биологической активностью и технологически полезными свойствами. Одним из источников могут быть еще сохранившиеся «дикие» закваски традиционных национальных продуктов. Впервые из якутского кумыса выделен штамм, идентифицированный как Lactobacillus acidophilus K 1902. Методом MALDI-TOF масс-спектрометрии штамм определен как L. acidophilus с высокой долей достоверности (Score 1,749), результаты идентификации подтверждены с помощью ПЦР-анализа последовательности 16SрРНК. Штамм является гомоферментативным, факультативно анаэробным. Сквашивает стерильное обезжиренное молоко при внесении 1-3 % закваски за 10-12 ч при (37±1) °С с образованием плотного сгустка приятного кисломолочного вкуса. Штамм избирательно чувствителен и одновременно устойчив к широкому ряду антибиотиков. Обладает высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным микроорганизмам. Штамм депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФБУН «МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского» Роспотребнадзора.

Еще

Кумыс якутский, lactobacillus acidophilus, идентификация, антибиотикоустойчивость, антагонизм

Короткий адрес: https://sciup.org/142243222

IDR: 142243222 | УДК: 579.864.1 | DOI: 10.31588/2413_4201_1883_4_260_253

L.acidophilus K 1902 is a promising strain for use in biotechnology

For the development of probiotic preparations, as well as food and feed additives, the search for new strains-producers with high biological activity and technologically useful properties is very important. One of the sources may be the still preserved "wild" starters of traditional national products. A strain identified as Lactobacillus acidophilus. K 1902 was isolated from Yakut koumiss for the first time. By MALDI-TOF mass spectrometry the strain was determined as L. acidophilus with a high confidence level (Score 1.749), the results of identification were confirmed by PCR-analysis of 16SrRNA sequence. The strain is homofermentative, facultatively anaerobic. It ferments sterile skimmed milk in 10-12 h at (37 ± 1) °C, forming a thick clot with a pleasant sour milk taste. The strain is selectively sensitive and simultaneously resistant to a wide range of antibiotics. It has high antagonistic activity against pathogenic microorganisms. The strain is deposited in the State Collection of Microorganisms of Normal Microflora (SCNM) of the G.N. Gabrichevsky Research Institute of Microorganisms of the Russian Federal Consumer Rights Protection Service.

Еще

Текст научной статьи L. acidophilus K 1902 - перспективный штамм для использования в биотехнологии

Нами впервые из «диких» заквасок якутского кумыса, выделен новый штамм Lactobacillus acidophilus K 1902.

Цель работы – дать описание нового штамма L. acidophilus , выделенного из якутского кумыса.

Материал и методы исследований. Лабораторные работы выполнены на базе лаборатории по разработке микробных препаратов Якутского научно-исследовательского института сельского хозяйства имени М.Г. Сафронова ФГБУН ФИЦ ЯНЦ СО РАН и лаборатории биологии бифидобактерий ФБУН «Московский научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Морфологические свойства нового штамма L.acidophilus К 1902 изучали при выращивании в полужидкой среде на протяжении 12 пересевов суточных культур, в диапазоне температур 37–40 °C. Культивировали на Бифидум-среде, обезжиренном молоке, на средах Блаурокка, ГМ, МРС, МРС-2, МРС-4, ЖСА. Идентификацию штамма проводили методом MALDI-TOF масс-спектрометрии на приборе Bruker Daltonik MALDI Biotyper, а также с помощью ПЦР-анализа нуклеотидных последовательностей 16SpPHK. Для амплификации гипервариабельной области 16S рРНК бактерий использовали праймеры MET-прямой FАМ– AGAGTTTGATCCTGGCTCAG, MET-обратный HEX– CCGTCAATTCCTTTRAGTTT.

Ферментативные свойства исследовали с помощью тест-систем API 50 CH и сред APICHL (bioMerieux, Франция); АНАЭРОТЕСТ – 23 (PLIVA-Lachema Diagnosticas.r.o., Чехия). Антагонистическую активность определяли методом отсроченного антагонизма, чувствительность к антибиотикам - диско - диффузионным методом, по МУ 2.3.2.2789-10 [10]. В работе использованы диски с антибиотиками производства НИИЭМ им. Пастера (Россия) и Hi Media Laboratories Pvt. (Индия). В качестве штамма -прототипа использован L. acidophilus К 3Ш24 ВКПМ В 3190. Для выбора оптимальной температуры роста, штамм культивировали в диапазоне температур от (20±1) °С до (50±1) °С. Изучение протеолитических свойств проводили на стерильном 12 % сухом обезжиренном молоке (СОМ) по ГОСТ 33629-2015. Гемолитическую активность – на 5 % кровяной среде, лецитиназную активность – на ЖСА, согласно МУ 2.3.2.2789-10 [10]. Антилизоцимную активность - по методу О.В. Бухарина [5] с применением лизоцима из яичного белка, выращивая посевы при 37±1 ºС в течение 48 ч. Скорость роста культур устанавливали через 4-8-12-16 часов на ГМ среде по ГОСТ Р 56139-2014, и при культивировании штамма на восстановленном стерильном 12 % СОМ при 37±1 °С. Число жизнеспособных бактерий выражали в КОЕ/мл исследуемого материала. Скорость накопления биомассы определяли по увеличению оптической плотности на спектрофотометре ЮНИКО 1201 («Юнико-Сис», г. Санкт-Петербург). Титруемую кислотность - в градусах Тернера (°Т) по ГОСТ Р 54669-2011, активную кислотность - по ГОСТ Р 533592009. Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью программы «Excel». Полученные данные представлены как средние значения «плюс-минус», отображающие стандартное отклонение. Для определения статистической значимости различий между активностью нового штамма и его прототипа использован t-критерий Стьюдента. Различия принимались как значимые при P<0,05.

Результат исследований.

Микробиологические исследования «диких» заквасок якутского кумыса, традиционно изготовляемых в хозяйствах Якутии начаты с 2015 года. Из микробиоты «дикой» закваски, используемой при приготовлении кумыса, выделен новый штамм лактобацилл. Изучены культурально-морфологические признаки L. аcidophilus . При микроскопировании - грамположительные, неподвижные, без спор, прямые палочки с закругленными концами, образующие цепочки из 2-4 клеток. В полужидких питательных средах штамм растет по всему объему без зоны аэробиоза, в форме единичных колоний - кометы длиной 3-6 мм. В бульонных культурах к 24 часам роста содержится 10⁸-10⁹ КОЕ/мл. При культивировании на поверхности среды МРС-4 в анаэробных условиях при 37±1 °С в течение 3-х суток образуются светлые непигментированные круглые колонии (S-формы) «сметанообразной» консистенции, диаметром до 1,5 мм с ровным краем. Оптимальная температура роста (37±1) °С, минимальная – (20±1) °С, максимальная – (50 ±1) °С. Результаты культивирования показали рост L. acidophilus К 1902 в толще полужидких и на поверхности плотных питательных сред как в атмосфере углекислого газа и азота, а также в присутствии кислорода, что позволяет отнести штамм к факультативным анаэробам (микроаэрофилам).

По результатам биохимических исследований установлено, что штамм ферментирует с образованием молочной кислоты без образования газаглюкозу, лактозу, сахарозу, маннит, мальтозу, салицин, арабинозу, целлюлозу, эскулин, сорбит, рамнозу, трегалозу, галактозу, маннозу, декстрозу, Na-цетилглюкозамин,

диксозу, фруктозу, раффинозу. Не 16SpPHK. ферментирует ксилозу, глицерин, Исследуемый штамм чувствителен мелицитозу, каталазу не образует, желатин к стрептомицину, хлорамфениколу, не разжижает. Штамм является тетрациклину, эритромицину, гомоферментативным – продуцирует ванкомицину, имипенему, линкомицину; молочную кислоту; сквашивает СОМ при промежуточно устойчив к цефалотину, внесении 1-3 % закваски за 10-12 часов пенициллину, гентамицину; устойчив к при 37±1 °С, с образованием плотного ципрофлоксацину, канамицину, сгустка приятного кисломолочного вкуса, полимиксину, налидиксовой кислоте, с содержанием живых клеток до 10⁸ КОЕ в ампициллину (Таблица 1). 1 мл. L. acidophilus K 1902 из якутского L. acidophilus K 1902 , выделенный кумыса проявляет более высокую из якутского кумыса по результатам масс- антагонистическую активность в спектрометрии определен как L. отношении тест-культур микроорганизмов, acidophilus с высокой долей достоверности вызывающих болезни желудочно- (Score 1,749). Идентификация штамма кишечного тракта, по сравнению со также подтверждена результатами ПЦР- штаммом-прототипом L. acidophilus К анализа геномной последовательности 3Ш24 (ВКПМ В 3190) (Таблица 2). Таблица 1 – Результаты оценки антибиотикочувствительности L. acidophilus, выделенного из кумыса
№	Препарат	Содержание активного вещества (мкг)	Критерии чувствительности, исследованных культур и диаметр зоны ингибирования роста (мм)
№	Препарат	Содержание активного вещества (мкг)	Устойчи вый	Промежуто чно устойчив	Чувстви телен	Штамм из кумыса	Штамм ВКПМ В 3190
1	Стрептомицин (S*)	10	≤16	17-19	≥20	24±2	18±0
2	Ампициллин (А)	10	≤8-10	11-20	≥21	0±0	26±2
3	Ципрофлоксацин (Cf)	5	≤15	16-20	≥21	8±0	0±0
4	Цефалотин (Ch)	30	≤8-10	11-20	≥21	20±2	27±2
5	Гентамицин (G)	10	≤12	13-14	≥15	14±0	15±1
6	Линкомицин (L)	15	≤8-10	11-20	≥21	25±1	27±2
7	Канамицин (K)	30	≤13	14-17	≥18	12±2	15±1
8	Хлорамфеникол (C)	30	≤8-10	11-20	≥21	36±2	20±2
9	Полимиксин-В (Pb)	300	≤8-10	11-20	≥21	0±0	0±0
10	Пенициллин-G (P*)	10	≤8-10	11-20	≥21	15±1	24±1
11	Тетрациклин (Т*)	30	≤16	17-21	≥22	36±2	20±2
12	Эритромицин (Е)	15	≤8-10	11-20	≥21	40±2	24±2
13	Налидиксовая кислота (Na)	30	≤13	14-18	≥19	10±0	0±0
14	Ванкомицин (Va*)	30	≤8-10	11-20	≥21	32±2	20±2
15	Имипенем	10	≤8-10	11-20	≥21	30±2	39±3

Таблица 2 – Изучение антагонистической активности штаммов лактобацилл

Наименование	Размер зоны задержки роста (d, мм)
Наименование	Штаммиз кумыса	Штамм ВКПМ В 3190
Sh. Flexneri 170-21	22,4±0,3*	18,5±0,5
Sh. Sonnei 5063, энтеропатогенный	28,6±0,4	20,5±0,5
E. coli ATCC 25922 (непатогенный)	29,6±0,4*	30,0±0
S. aureus ATCC 6538-P	28,0±0*	23,0±0
P. vulgaris	26,4±0,3*	24,5±0,5
P. mirabilis	24,6±0,2*	28,0±0
S. epidermidis ATCC 14990	28,2±0,2*	26,5±0,5
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027	26,1±0,1*	22,5±0,5
Candida albicans ATCC 10231	8,0±0*	10,0±0

Примечание: *P<0,05

Кроме того, скорость накопления биомассы у исследуемого штамма выше в 1,7 раз и достигала 20 OD (у штамма-прототипа составляла 12 OD), что также является хорошим показателем для пробиотических культур.

Выделенный антагонистически активный штамм L. acidophilus K 1902 -фенотипически апатогенный, также по отсутствию зон воздействия культуры на тест-средах не обладает гемолитической, протеолитической, лецитиназной, антилизоцимной активностями. Работа со штаммом не требует специальных мер предосторожности согласно СанПин 3.36886-21.

Полученные результаты показывают соответствие нового штамма L. acidophilus K 1902, выделенного из якутского кумыса видовым признакам L. acidophilus. Штамм прошел комплексный анализ с использованием микробиологических, биохимических и молекулярно-генетических методик, что соответствует современному уровню исследований бактерий рода Lactobacillus [2, 7, 11, 12, 13].

Штамм при хранении в лиофильно высушенном и замороженном виде в защитной сахароза-желатиновой среде (при температуре 4±2°C и -70°C) сохраняет жизнеспособность и активность более 3 лет (срок наблюдения).

Заключение. Таким образом, по результатам проведенных исследований штамм L. acidophilus К 1902 , выделенный из якутского кумыса депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора под регистрационным номером ГКНМ № 1276.

Выраженная антагонистическая активность штамма L. acidophilus K 1902 к патогенным, условно-патогенным микроорганизмам, также избирательная чувствительность и устойчивость штамма к антибиотикам дает широкую возможность разработки препаратов на его основе (лекарственных средств, пищевых и кормовых добавок и т.п.) и определяет его перспективность в использовании в современных биотехнологиях.

Список литературы L. acidophilus K 1902 - перспективный штамм для использования в биотехнологии

Абишева, Т. О. Биологические и лечебные свойства кумыса / Т. О. Абишева, Ж. Б. Аширова, А. А. Рамазанова // Мир современной науки. – 2015. – № 2 (30). – С. 15-20.
Анисимова, Е. А. Антибиотикорезистентность и мобильность ее генетических детерминант у штамма Lactobacillus fermentum / Е. А. Анисимова, Д. Р. Яруллина // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2020. – № 38(4). – С. 162-169.
Ахатова, И. А. Новые технологии решения в переработке кобыльего молока / И. А. Ахатова // Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья. – 2010. – № 6. – С. 18-19.
Ботина, С. Г. Реклассификация отечественных пробиотических культур бактерий рода Lactobacillus / С. Г. Ботина, К. М. Климина, Н. В. Коробан [и др.] // Генетика. – 2010. – Т. 46. – № 11. – С. 1485-1492.
Бухарин, О. В. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов / О. В. Бухарин, Б. Я. Усвяпов [и др.] // Микробиология. – 1984. – № 2. – С. 27-29.
Гладкова, Е. Е. Характеристика культур, входящих в состав кумысной закваски, молочнокислые бактерии / Е. Е. Гладкова // III Межд. науч.-практ. конф., посвященной 70-летию ГНУ ИЭВСиДВ (6-7 октября, Новосибирск). – Новосибирск. – 2010. – С. 125-132.
Джефаров, М. М. Микробиологический состав кисломолочных продуктов / М. М. Джефаров // Достижение науки и техники АПК. – 2010. – № 3. – С. 70-73.
Кароматов, И. Д. Кумыс как лечебное средство / И. Д. Кароматов, М. С. Давлатова // Биология и альтернативная медицина. – 2017. – №.1. – С. 234-241.
Ковешников, В. С. Кумыс – лечебный, диетический и питательный продукт / В. С. Ковешников, М. А. Матвиенко, А. А. Родионова // Молочная промышленность. – 2019. – № 1. – С. 61-63.
МУ 2.32.2789-10. Методические указания по санитарно- эпидемиологической безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов. – М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. – 2010. – 93 с.
Назарова, Е. Н. Кумыс и его лечебные свойства / Е. Н. Назарова, И. А. Калашников // Вестник Бурятского ГАУ сельскохозяйственной академии им. В.Р. Филиппова. – 2015. – № 1(38). – С. 46-50.
Фёдорова, Т. В. Антагонистическая активность молочнокислых бактерий Lactobacillus spp. в отношении клинических изолятов Klebsiella pneumonia / Т. В. Фёдорова, Д. В. Васина, А. В. Бегунова [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. – 2018. – № 54 (3). – С. 264-276.
Юрик, С. А. Молекулярно-генетическая идентификация лактобактерий в кисломолочных продуктах и заквасочных культурах / С. А. Юрик, В. М. Семенихин // Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья. – 2013. – № 8. – С. 39-41.
Damdinsuren L. Scientific basis of biotechnological application for Mongolian dairy production / L. Damdinsuren // International Sci. Symposium. – Normadic Cultural Tradition: Mongolian Dairy. – Ulaan Baatar. – 2003. – P. 28-36.
Navahus, J. H. The role of interaction between yeasts and lactic acid bacteria in African fermented milks: a revive / J. H. Navahus, T. H. Ganada // Int. J. Food microbiol. – 2003. – Vol. 86 (1-2). – P. 51-60.

Еще