L. acidophilus K 1902 - перспективный штамм для использования в биотехнологии

Автор: Тарабукина Н.П., Неустроев М.П., Маркова А.М., Скрябина М.П., Обоева Н.А., Парникова С.И.

Журнал: Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана @uchenye-zapiski-ksavm

Статья в выпуске: 4 т.260, 2024 года.

Бесплатный доступ

Для разработки пробиотических препаратов, также пищевых и кормовых добавок очень важен поиск новых штаммов - продуцентов с высокой биологической активностью и технологически полезными свойствами. Одним из источников могут быть еще сохранившиеся «дикие» закваски традиционных национальных продуктов. Впервые из якутского кумыса выделен штамм, идентифицированный как Lactobacillus acidophilus K 1902. Методом MALDI-TOF масс-спектрометрии штамм определен как L. acidophilus с высокой долей достоверности (Score 1,749), результаты идентификации подтверждены с помощью ПЦР-анализа последовательности 16SрРНК. Штамм является гомоферментативным, факультативно анаэробным. Сквашивает стерильное обезжиренное молоко при внесении 1-3 % закваски за 10-12 ч при (37±1) °С с образованием плотного сгустка приятного кисломолочного вкуса. Штамм избирательно чувствителен и одновременно устойчив к широкому ряду антибиотиков. Обладает высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным микроорганизмам. Штамм депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФБУН «МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского» Роспотребнадзора.

Еще

Кумыс якутский, lactobacillus acidophilus, идентификация, антибиотикоустойчивость, антагонизм

Короткий адрес: https://sciup.org/142243222

IDR: 142243222 | DOI: 10.31588/2413_4201_1883_4_260_253

Текст научной статьи L. acidophilus K 1902 - перспективный штамм для использования в биотехнологии

Нами впервые из «диких» заквасок якутского кумыса, выделен новый штамм Lactobacillus acidophilus K 1902.

Цель работы – дать описание нового штамма L. acidophilus , выделенного из якутского кумыса.

Материал и методы исследований. Лабораторные работы выполнены на базе лаборатории по разработке микробных препаратов Якутского научно-исследовательского института сельского хозяйства имени М.Г. Сафронова ФГБУН ФИЦ ЯНЦ СО РАН и лаборатории биологии бифидобактерий ФБУН «Московский научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Морфологические свойства нового штамма L.acidophilus К 1902 изучали при выращивании в полужидкой среде на протяжении 12 пересевов суточных культур, в диапазоне температур 37–40 °C. Культивировали на Бифидум-среде, обезжиренном молоке, на средах Блаурокка, ГМ, МРС, МРС-2, МРС-4, ЖСА. Идентификацию штамма проводили методом MALDI-TOF масс-спектрометрии на приборе Bruker Daltonik MALDI Biotyper, а также с помощью ПЦР-анализа нуклеотидных последовательностей 16SpPHK. Для амплификации гипервариабельной области 16S рРНК бактерий использовали праймеры MET-прямой FАМ– AGAGTTTGATCCTGGCTCAG, MET-обратный HEX– CCGTCAATTCCTTTRAGTTT.

Ферментативные свойства исследовали с помощью тест-систем API 50 CH и сред APICHL (bioMerieux, Франция); АНАЭРОТЕСТ – 23 (PLIVA-Lachema Diagnosticas.r.o., Чехия). Антагонистическую активность определяли методом отсроченного антагонизма, чувствительность к антибиотикам - диско - диффузионным методом, по МУ 2.3.2.2789-10 [10]. В работе использованы диски с антибиотиками производства НИИЭМ им. Пастера (Россия) и Hi Media Laboratories Pvt. (Индия). В качестве штамма -прототипа использован L. acidophilus К 3Ш24 ВКПМ В 3190. Для выбора оптимальной температуры роста, штамм культивировали в диапазоне температур от (20±1) °С до (50±1) °С. Изучение протеолитических свойств проводили на стерильном 12 % сухом обезжиренном молоке (СОМ) по ГОСТ 33629-2015. Гемолитическую активность – на 5 % кровяной среде, лецитиназную активность – на ЖСА, согласно МУ 2.3.2.2789-10 [10]. Антилизоцимную активность - по методу О.В. Бухарина [5] с применением лизоцима из яичного белка, выращивая посевы при 37±1 ºС в течение 48 ч. Скорость роста культур устанавливали через 4-8-12-16 часов на ГМ среде по ГОСТ Р 56139-2014, и при культивировании штамма на восстановленном стерильном 12 % СОМ при 37±1 °С. Число жизнеспособных бактерий выражали в КОЕ/мл исследуемого материала. Скорость накопления биомассы определяли по увеличению оптической плотности на спектрофотометре ЮНИКО 1201 («Юнико-Сис», г. Санкт-Петербург). Титруемую кислотность - в градусах Тернера (°Т) по ГОСТ Р 54669-2011, активную кислотность - по ГОСТ Р 533592009. Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью программы «Excel». Полученные данные представлены как средние значения «плюс-минус», отображающие стандартное отклонение. Для определения статистической значимости различий между активностью нового штамма и его прототипа использован t-критерий Стьюдента. Различия принимались как значимые при P<0,05.

Результат исследований.

Микробиологические исследования «диких» заквасок якутского кумыса, традиционно изготовляемых в хозяйствах Якутии начаты с 2015 года. Из микробиоты «дикой» закваски, используемой при приготовлении кумыса, выделен новый штамм лактобацилл. Изучены культурально-морфологические признаки L. аcidophilus . При микроскопировании - грамположительные, неподвижные, без спор, прямые палочки с закругленными концами, образующие цепочки из 2-4 клеток. В полужидких питательных средах штамм растет по всему объему без зоны аэробиоза, в форме единичных колоний - кометы длиной 3-6 мм. В бульонных культурах к 24 часам роста содержится 10⁸-10⁹ КОЕ/мл. При культивировании на поверхности среды МРС-4 в анаэробных условиях при 37±1 °С в течение 3-х суток образуются светлые непигментированные круглые колонии (S-формы) «сметанообразной» консистенции, диаметром до 1,5 мм с ровным краем. Оптимальная температура роста (37±1) °С, минимальная – (20±1) °С, максимальная – (50 ±1) °С. Результаты культивирования показали рост L. acidophilus К 1902 в толще полужидких и на поверхности плотных питательных сред как в атмосфере углекислого газа и азота, а также в присутствии кислорода, что позволяет отнести штамм к факультативным анаэробам (микроаэрофилам).

По результатам биохимических исследований установлено, что штамм ферментирует с образованием молочной кислоты без образования газаглюкозу, лактозу, сахарозу, маннит, мальтозу, салицин, арабинозу, целлюлозу, эскулин, сорбит, рамнозу, трегалозу, галактозу, маннозу, декстрозу, Na-цетилглюкозамин,

диксозу, фруктозу, раффинозу. Не 16SpPHK. ферментирует ксилозу, глицерин, Исследуемый штамм чувствителен мелицитозу, каталазу не образует, желатин к стрептомицину, хлорамфениколу, не разжижает. Штамм является тетрациклину, эритромицину, гомоферментативным – продуцирует ванкомицину, имипенему, линкомицину; молочную кислоту; сквашивает СОМ при промежуточно устойчив к цефалотину, внесении 1-3 % закваски за 10-12 часов пенициллину, гентамицину; устойчив к при 37±1 °С, с образованием плотного ципрофлоксацину, канамицину, сгустка приятного кисломолочного вкуса, полимиксину, налидиксовой кислоте, с содержанием живых клеток до 10⁸ КОЕ в ампициллину (Таблица 1). 1 мл. L. acidophilus K 1902 из якутского L. acidophilus K 1902 , выделенный кумыса проявляет более высокую из якутского кумыса по результатам масс- антагонистическую активность в спектрометрии определен как L. отношении тест-культур микроорганизмов, acidophilus с высокой долей достоверности вызывающих болезни желудочно- (Score 1,749). Идентификация штамма кишечного тракта, по сравнению со также подтверждена результатами ПЦР- штаммом-прототипом L. acidophilus К анализа геномной последовательности 3Ш24 (ВКПМ В 3190) (Таблица 2). Таблица 1 – Результаты оценки антибиотикочувствительности L. acidophilus, выделенного из кумыса
№	Препарат	Содержание активного вещества (мкг)	Критерии чувствительности, исследованных культур и диаметр зоны ингибирования роста (мм)
№	Препарат	Содержание активного вещества (мкг)	Устойчи вый	Промежуто чно устойчив	Чувстви телен	Штамм из кумыса	Штамм ВКПМ В 3190
1	Стрептомицин (S*)	10	≤16	17-19	≥20	24±2	18±0
2	Ампициллин (А)	10	≤8-10	11-20	≥21	0±0	26±2
3	Ципрофлоксацин (Cf)	5	≤15	16-20	≥21	8±0	0±0
4	Цефалотин (Ch)	30	≤8-10	11-20	≥21	20±2	27±2
5	Гентамицин (G)	10	≤12	13-14	≥15	14±0	15±1
6	Линкомицин (L)	15	≤8-10	11-20	≥21	25±1	27±2
7	Канамицин (K)	30	≤13	14-17	≥18	12±2	15±1
8	Хлорамфеникол (C)	30	≤8-10	11-20	≥21	36±2	20±2
9	Полимиксин-В (Pb)	300	≤8-10	11-20	≥21	0±0	0±0
10	Пенициллин-G (P*)	10	≤8-10	11-20	≥21	15±1	24±1
11	Тетрациклин (Т*)	30	≤16	17-21	≥22	36±2	20±2
12	Эритромицин (Е)	15	≤8-10	11-20	≥21	40±2	24±2
13	Налидиксовая кислота (Na)	30	≤13	14-18	≥19	10±0	0±0
14	Ванкомицин (Va*)	30	≤8-10	11-20	≥21	32±2	20±2
15	Имипенем	10	≤8-10	11-20	≥21	30±2	39±3

Таблица 2 – Изучение антагонистической активности штаммов лактобацилл

Наименование	Размер зоны задержки роста (d, мм)
Наименование	Штаммиз кумыса	Штамм ВКПМ В 3190
Sh. Flexneri 170-21	22,4±0,3*	18,5±0,5
Sh. Sonnei 5063, энтеропатогенный	28,6±0,4	20,5±0,5
E. coli ATCC 25922 (непатогенный)	29,6±0,4*	30,0±0
S. aureus ATCC 6538-P	28,0±0*	23,0±0
P. vulgaris	26,4±0,3*	24,5±0,5
P. mirabilis	24,6±0,2*	28,0±0
S. epidermidis ATCC 14990	28,2±0,2*	26,5±0,5
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027	26,1±0,1*	22,5±0,5
Candida albicans ATCC 10231	8,0±0*	10,0±0

Примечание: *P<0,05

Кроме того, скорость накопления биомассы у исследуемого штамма выше в 1,7 раз и достигала 20 OD (у штамма-прототипа составляла 12 OD), что также является хорошим показателем для пробиотических культур.

Выделенный антагонистически активный штамм L. acidophilus K 1902 -фенотипически апатогенный, также по отсутствию зон воздействия культуры на тест-средах не обладает гемолитической, протеолитической, лецитиназной, антилизоцимной активностями. Работа со штаммом не требует специальных мер предосторожности согласно СанПин 3.36886-21.

Полученные результаты показывают соответствие нового штамма L. acidophilus K 1902, выделенного из якутского кумыса видовым признакам L. acidophilus. Штамм прошел комплексный анализ с использованием микробиологических, биохимических и молекулярно-генетических методик, что соответствует современному уровню исследований бактерий рода Lactobacillus [2, 7, 11, 12, 13].

Штамм при хранении в лиофильно высушенном и замороженном виде в защитной сахароза-желатиновой среде (при температуре 4±2°C и -70°C) сохраняет жизнеспособность и активность более 3 лет (срок наблюдения).

Заключение. Таким образом, по результатам проведенных исследований штамм L. acidophilus К 1902 , выделенный из якутского кумыса депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора под регистрационным номером ГКНМ № 1276.

Выраженная антагонистическая активность штамма L. acidophilus K 1902 к патогенным, условно-патогенным микроорганизмам, также избирательная чувствительность и устойчивость штамма к антибиотикам дает широкую возможность разработки препаратов на его основе (лекарственных средств, пищевых и кормовых добавок и т.п.) и определяет его перспективность в использовании в современных биотехнологиях.

Список литературы L. acidophilus K 1902 - перспективный штамм для использования в биотехнологии

Абишева, Т. О. Биологические и лечебные свойства кумыса / Т. О. Абишева, Ж. Б. Аширова, А. А. Рамазанова // Мир современной науки. – 2015. – № 2 (30). – С. 15-20.
Анисимова, Е. А. Антибиотикорезистентность и мобильность ее генетических детерминант у штамма Lactobacillus fermentum / Е. А. Анисимова, Д. Р. Яруллина // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2020. – № 38(4). – С. 162-169.
Ахатова, И. А. Новые технологии решения в переработке кобыльего молока / И. А. Ахатова // Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья. – 2010. – № 6. – С. 18-19.
Ботина, С. Г. Реклассификация отечественных пробиотических культур бактерий рода Lactobacillus / С. Г. Ботина, К. М. Климина, Н. В. Коробан [и др.] // Генетика. – 2010. – Т. 46. – № 11. – С. 1485-1492.
Бухарин, О. В. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов / О. В. Бухарин, Б. Я. Усвяпов [и др.] // Микробиология. – 1984. – № 2. – С. 27-29.
Гладкова, Е. Е. Характеристика культур, входящих в состав кумысной закваски, молочнокислые бактерии / Е. Е. Гладкова // III Межд. науч.-практ. конф., посвященной 70-летию ГНУ ИЭВСиДВ (6-7 октября, Новосибирск). – Новосибирск. – 2010. – С. 125-132.
Джефаров, М. М. Микробиологический состав кисломолочных продуктов / М. М. Джефаров // Достижение науки и техники АПК. – 2010. – № 3. – С. 70-73.
Кароматов, И. Д. Кумыс как лечебное средство / И. Д. Кароматов, М. С. Давлатова // Биология и альтернативная медицина. – 2017. – №.1. – С. 234-241.
Ковешников, В. С. Кумыс – лечебный, диетический и питательный продукт / В. С. Ковешников, М. А. Матвиенко, А. А. Родионова // Молочная промышленность. – 2019. – № 1. – С. 61-63.
МУ 2.32.2789-10. Методические указания по санитарно- эпидемиологической безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов. – М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. – 2010. – 93 с.
Назарова, Е. Н. Кумыс и его лечебные свойства / Е. Н. Назарова, И. А. Калашников // Вестник Бурятского ГАУ сельскохозяйственной академии им. В.Р. Филиппова. – 2015. – № 1(38). – С. 46-50.
Фёдорова, Т. В. Антагонистическая активность молочнокислых бактерий Lactobacillus spp. в отношении клинических изолятов Klebsiella pneumonia / Т. В. Фёдорова, Д. В. Васина, А. В. Бегунова [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. – 2018. – № 54 (3). – С. 264-276.
Юрик, С. А. Молекулярно-генетическая идентификация лактобактерий в кисломолочных продуктах и заквасочных культурах / С. А. Юрик, В. М. Семенихин // Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья. – 2013. – № 8. – С. 39-41.
Damdinsuren L. Scientific basis of biotechnological application for Mongolian dairy production / L. Damdinsuren // International Sci. Symposium. – Normadic Cultural Tradition: Mongolian Dairy. – Ulaan Baatar. – 2003. – P. 28-36.
Navahus, J. H. The role of interaction between yeasts and lactic acid bacteria in African fermented milks: a revive / J. H. Navahus, T. H. Ganada // Int. J. Food microbiol. – 2003. – Vol. 86 (1-2). – P. 51-60.

Еще

Статья научная