Лабораторная диагностика хронической и бессимптомной форм африканской чумы свиней

Африканская чума свиней (АЧС) — контагиозная септическая болезнь свиней, характеризующаяся лихорадкой, признаками токсикоза, геморрагическим диатезом и высокой летальностью. К АЧС восприимчивы домашние свиньи и дикие кабаны независимо от породы и возраста. Болезнь может протекать сверхостро, остро, подостро, хронически и бессимптомно. Вызывает болезнь крупный, покрытый оболочкой цитоплазматический вирус (вирус АЧС, African swine fever virus, ASFV; семейство Asfarviridae , род Asfivirus ) с двухцепочечной ДНК — единственный представитель Asfarviridae , отличительная особенность которого заключается в значительном плюралитете биологических и генетических свойств (1-3). Поскольку вакцины против АЧС не разработаны, для ликвидации и пре-459

дупреждения распространения болезни применяются тотальный убой свиней в так называемой первой угрожаемой зоне, а также жесткие карантинные мероприятия во второй угрожаемой зоне (4). Для принятия решений о ликвидации вспышек АЧС важное значение имеет лабораторная диагностика: выделение вируса и его идентификация в реакции гемадсорб-ции, выявление вирусного генома методом ПЦР, определение вирусных антигенов в прямой реакции иммунофлуоресценции или с помощью твердофазного иммуноферментного анализа, распознавание вирусоспецифических антител с использованием непрямой реакции иммунофлуоресценции, непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, в непрямой иммунопероксидазной реакции, методом иммуноблоттинга (5-8).

Есть все основания предполагать, что в результате многократного пассирования вируса АЧС в популяциях диких кабанов европейских стран в обозримом будущем могут появиться изоляты, вызывающие не острую форму болезни, как в настоящее время, а хроническую или бессимптомную. Свиньи, которые выживают после инфицирования, обычно через 710 сут после заражения вырабатывают вирусоспецифические антитела, которые сохраняются в течение длительного времени (9, 10). Следовательно, обнаружение специфических антител против вируса АЧС может быть ключевым в диагностике хронической и бессимптомной форм болезни. Именно на выявлении и последующем забое серопозитивных свиней базировалась стратегия по искоренению АЧС на Иберийском полуострове (11). Уже после ликвидации АЧС в Испании и Португалии была разработана ПЦР, которая в настоящее время нашла широкое применение в лабораторной практике (12).

В настоящей работе нами представлены результаты сравнительного лабораторного исследования органов, крови и сывороток крови животных с использованием различных методов. Оно предпринято в связи с необходимостью определить наиболее эффективные способы обнаружения носителей вируса при хронической и бессимптомной формах АЧС и обосновать тактику диагностических и мониторинговых мероприятий. Для этого в лабораторных условиях воспроизводили указанные формы болезни, предварительно подобрав соответствующие штаммы или варианты вируса АЧС.

Целью работы стала диагностика хронической и бессимптомной форм африканской чумы свиней с применением реакции гемадсорбции (РГАд), серологических тестов — реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ), твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ-ИФА) и иммуноблоттинга (ИБ), а также ПЦР.

Методика . Домашних свиней породы крупная белая (живая масса 30-50 кг) получили из сектора подготовки подопытных животных (Всероссийский НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии — ВНИИВ-ВиМ), кабан-сеголеток был приобретен в охотхозяйстве «Покровское» (Владимирская обл.). Условия кормления и содержания соответствовали нормам и требованиям, предусмотренным для животных указанных возрастных групп; забой проводили гуманным способом.

Использовали вирулентный штамм Мозамбик-78 вируса АЧС (М78, V генотип, III сероиммунотип) с активностью 6,5-7,5 lg ГАЕ50/см3, аттенуированный штамм МК-200 с активностью 7,0-7,5 lg ГАЕ50/см3 (получен в результате селекции из вирулентного штамма М-78) и аттенуированный вариант штамма Ставрополь 01/08 (II генотип, VIII сероиммуно-тип) с инфекционным титром 6,0-6,5 lg ГАЕ50/см3 (после 33-го пассажа в перевиваемой культуре клеток А4С2/9к) (13, 14). Вирусы были получены из Музея штаммов ВНИИВВиМ.

Подготовку проб сывороток и 10 % суспензий органов, постановку реакции РГАд, определение вирусоспецифических антител методом непрямого ТФ-ИФА и РНИФ проводили согласно ГОСТ 28573-90 «Свиньи. Методы лабораторной диагностики африканской чумы» и инструкций, прилагаемых к соответствующим тест-системам. Перечисленные серологические тесты и ПЦР осуществляли с применением коммерческих наборов. ИБ выполняли с использованием экспериментальных образцов тест-системы для серодиагностики африканской чумы свиней методом иммуноблоттинга, изготовленных на основе рекомбинантного белка р30 вируса АЧС (15, 16). Все тест-системы произведены во ВНИИВВиМ.

Результаты. Хроническую и бессимптомную формы АЧС воспроизводили с помощью полученных аттенуированных штамма и варианта, относящихся к различным гено- и сероиммунотипам (17, 18).

Свинье ¹ 1 внутримышечно однократно вводили аттенуированный вариант вируса АЧС Ставрополь 01/08 А₄С₂/9к в дозе 10^6,0 ГАЕ₅₀. На 5-7-е сут после инокуляции регистрировали угнетенное состояние животного и повышение температуры тела до 40,5 ° С, характерные для хронической формы инфекции. В РНИФ через 7 сут титр вирусоспецифических антител в сыворотке крови животного составлял 1:2, на 9-е сут — 1:8, на 14-е сут — 1:64 и на 21-е сут — 1:64. Методом ИБ антитела к белку р30 вируса АЧС выявляли на 7-е сут в разведении 1:4, на 9-е сут — 1:32, на 14-е сут — 1:128 и на 21-е сут — 1:1024. После убоя на 21-е сут в реакции РГАд вирус АЧС в низких титрах обнаруживался в пробах ткани селезенки и подчелюстных лимфоузлов, но не был идентифицирован в печени и легких. В ПЦР присутствие вирусной ДНК подтвердили только в пробе ткани подчелюстных лимфоузлов. Во всех исследованных органах методом ИБ антитела определялись в титрах 1:20-1:160 (табл. 1).

1. Результаты использования разных методов диагностики африканской чумы свиней при исследовании органов животных после инокуляции аттенуированными штаммами ASFV

Бессимптомную форму АЧС наблюдали у кабана-сеголетка, которому внутримышечно однократно ввели аттенуированный штамм вируса АЧС МК-200 в дозе 107,0 ГАЕ50. В РНИФ специфические антитела к вирусу АЧС выявляли на 8-е сут в разведении 1:2, на 14-е сут — 1:64 и на 24-е сут — 1:1024. Методом ИБ антитела к белку вируса АЧС р30 обнаруживали на 8-е сут в разведении 1:8, на 14-е сут — 1:512 и на 24-е сут — 1:2048. При патологоанатомическом исследовании после убоя на 25-е сут характерных для АЧС изменений у животного не наблюдали, в пробах органов в РГАд вирус АЧС не обнаружили. Вирусную ДНК в ПЦР также не выявили. Методом ИБ антитела определялись во всех протестированных образцах органов в титрах 1:40-1:320 (см. табл. 1).

При появлении в природе слабовирулентных изолятов и их распро- странении среди восприимчивого поголовья существует вероятность выживания животных при последующем заражении гомологичным вирулентным изолятом (19-21). В подобных случаях также необходимо знать возможности лабораторных методов диагностики АЧС.

В этой связи свиньям ¹ 2 и ¹ 3 внутримышечно вводили аттенуированный штамм вируса АЧС МК-200 в дозе 10^6,0 ГАЕ₅₀. В течение 16 сут после введения вируса клинических признаков болезни не регистрировали. На 17-е сут животным ввели вирулентный штамм вируса АЧС М-78 в дозе 10^3,0 ГАЕ₅₀. У свиньи ¹ 2 в период с 22-х по 24-е сут наблюдали характерные для АЧС клинические признаки: угнетенное состояние, повышение температуры тела до 41,3 ° С, отсутствие аппетита, геморрагии на ушах и брюхе. У свиньи ¹ 3 до 24-х сут клинические признаки болезни отсутствовали, поэтому на 25-е сут ее повторно заразили штаммом М-78 в дозе 10^5,0 ГАЕ₅₀. В период с 28-х по 30-е сут у нее отмечали лихорадку до 41,4 ° С, угнетенное состояние, отсутствие аппетита, геморрагии на ушах и брюхе. В период проявления клинических признаков животным ¹ 2 и ¹ 3 внутримышечно вводили по 20 см³ фосфонуксусной кислоты, чтобы гарантировать выживание. После убоя на 38-е сут отбирали пробы органов для исследования (табл. 2).

2. Результаты использования разных методов диагностики африканской чумы свиней при исследовании органов животных, последовательно инокулированных аттенуированным (МК-200) и вирулентным (М-78) штаммами ASFV

П рим еч а ни е. ASFV — African swine fever virus, ТФ-ИФА — твердофазный иммуноферментный анализ, РНИФ — реакция непрямой иммунофлуоресценции, ИБ — иммуноблоттинг; в ПЦР образец считали положительным при величине порогового цикла (Ct) менее 33, отрицательным (NEG) — при отсутствии значений Ct.

Блоттограмма титрования вирусоспецифических антител в 10 % суспензии ткани подчелюстных лимфоузлов свиньи ¹ 3, последовательно инокулированной аттенуированным (МК-200) и вирулентным (М-78) штаммами ASFV (указаны разведения пробы).

По данным ПЦР вирусный геном выявлен в исследованных органах за исключением подчелюстных лимфоузлов. В пробах всех органов детектировали вирусоспецифические антитела. Их наивысшие титры выявлены в пробах легких. По аналитической чувствительности метод ИБ превосходил РНИФ, его результаты были наглядными и легко документировались (рис.).

В специальной литературе представлены сведения об ограниченных сроках вирусо- выделения из проб крови и органов в случае инокуляции свиньям штаммов, аттенуированных в лабораторных услови- ях. Так, у животных, которым внутримышечно вводили аттенуированные штаммы вируса АЧС ФК-32/135 или Е-70МС в дозах 106,5-107,5 ГАЕ50, выявляли инфекционный вирус только в отдельных случаях на 4-7-е сут в сыворотке крови и в 10 % суспензии ткани селезенки в титрах 1,0-2,0 lg ГАЕ50/см3 (22).

Изучение распределения и накопления штамма ФК-32/135 вируса АЧС в органах и тканях свиней после инокуляции внутримышечно или аэрозольно в дозах 106,5-107,0 ГАЕ50 достоверно показало, что на 7-е сут вирус сохранялся только в легких, бронхиальном и средостенном лимфоузлах, а через 10 сут выделялся только из околоушного лимфоузла. В более отдаленные сроки из органов и тканей животных инфекционный вирус выделить не удалось (23). Исследование распределения вируса АЧС у подсвинков, внутримышечно инокулированных аттенуированным штаммом МК-200 в высокой дозе 108,50 ГАЕ50, показало, что на 7-14-е сут он обнаруживался в крови и 10 % суспензиях тканей печени, селезенки, легких, подчелюстного и бронхиального лимфатических узлов в титрах 3,04,0 lg ГАЕ50/см3. На 21-30-е сут после инокуляции вирус находили только в пробах крови, 10 % суспензии ткани печени и селезенки в титрах 1,0-1,5 lg ГАЕ50/см3 (24). Через 2 мес из проб крови животных вирус выделить не удалось (25). Все эти данные достоверно свидетельствуют, что благодаря действию механизмов защиты, индуцированных аттенуированными штаммами вируса АЧС, количество инфекционного вируса и его компонентов в органах свиней может быть значительно снижено за относительно короткий период.

Таким образом, наши исследования показали, что через 3 нед после заражения животных аттенуированными штаммом или вариантом вируса АЧС получить надежный положительный результат в РГАд (выявление инфекционного вируса) или ПЦР (обнаружение вирусной ДНК) затруднительно (возможны ложноотрицательные результаты). В этом случае достоверный диагноз обеспечивают серологические тесты, которые позволяют выявить вирусоспецифические антитела в образцах крови и органов домашних свиней и диких кабанов. Возможность обнаружения антител в тканях селезенки, легких, печени значительно облегчает мониторинг АЧС при проведении ограничительных мероприятий, особенно при исследовании диких кабанов, добытых в охотхозяйствах. При этом тест-система для серодиагностики АЧС методом ИБ обладает преимуществами — высокой аналитической чувствительностью и не нуждается в специальном приборном обеспечении. Применение серологических методов в перспективе можно расширить за счет анализа образцов слюны животных (26). На территориях, где зарегистрирована эпизоотия АЧС, вероятна одновременная циркуляция как слабовирулентных, так и вирулентных гомологичных изолятов вируса. Животные, последовательно инфицированные слабовирулентным, а затем вирулентным изолятом, могут выживать. При этом инфицированных животных удается выявить как в ПЦР, так и серологическими методами.

Итак, выполненные исследования показали, что приемы, основанные на обнаружении инфекционного вируса африканской чумы свиней (АЧС) по гемадсорбции или его генома в ПЦР в пробах крови или органов животных, неэффективны при диагностике и мониторинге хронической и бессимптомной форм АЧС. Их применение чревато ложноотрицательными результатами. Достоверные данные в таких случаях обеспечивают серологические методы. Анализ небольшого, от единиц до десятков, числа проб целесообразно проводить с использованием иммуноблоттинга.