Липидная фракция из морской бурой водоросли Saccharina japonica как фармакологическое средство при гепатозах

веществ липидной природы, в частности, фосфолипиды, содержащие полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) семейства n-3 и n-6 [7]. Однако работ, посвященных изучению гепатопротектор-ной активности липидных комплексов из морских водорослей крайне мало, что обусловливает актуальность проведения исследований в плане расширения ресурсного диапазона для получения природных гепатопротекторов, содержащих фосфолипиды. Наибольший интерес в этом отношении представляют собой массовые виды морских водорослей, имеющих пищевое значение. Ранее нами было показано [5], что липидный комплекс, выделенный из экстракта Saccharina japonica ( ранее Laminaria japonica) , содержит в значительных количествах фосфолипиды, которые преимущественно составляют мембранный матрикс. Также в состав комплекса входит целый ряд липидных фракций, являющихся важнейшими предшественниками биосинтеза фосфолипидов в организме животных и человека. В связи с этим представляется интересным изучить гепатопротекторные свойства комплекса липидов, выделенных из Saccharina japonica, в условиях экспериментального токсического гепатита.

Цель работы: явилось изучение гепато-протекторных свойств липидной фракции, выделенной из водно-спиртового (70%) экстракта таллома бурой морской водоросли Saccharina japonica при интоксикации крыс четыреххлористым углеродом.

Материалы и методы исследования. Образцы водоросли Saccharina japonica собирали в период с 1 августа по 30 сентября 2014 г. в прибрежной зоне залива Петра Великого Японского моря. Собранные образцы промывали профильтрованной морской водой и затем нагревали 2 мин. в кипящей воде для инактивации ферментов и обсушивали в тени на открытом воздухе. Далее водоросли сушили в помещении в потоке воздуха до суховоздушного состояния с остаточной влажностью 10-15%. Высушенные водоросли измельчали с помощью лабораторной мельницы Pulverisette 15 (Fritsch, Germany) до размера частиц 3-5 мм. Получение экстрактов проводили методом реперколяции с 70% этиловым спиртом в течение 48 часов при периодическом перемешивании. Объем экстрагента на 100 г водоросли составлял 300 мл. Через 48 часов экстракт сливали, водоросли отжимали на сите и полученные извлечения объединяли.

Суммарную липидную фракцию из экстракта Saccharina japonica получали по методу Фолча [9]. Для этого 100 мл исходного экстракта упаривали на роторном испарителе (t<30 С) для удаления спирта и разводили дистиллированной водой до исходного объема. Полученный образец подкисляли 0,1 н HCl и экстрагировали два раза по 200 мл смесью растворителей хлороформ: метанол – 2:1 (по объему). Для разделения фаз к экстракту добавляли раствор хлористого натрия (0,73%) в количестве 20% от объема. После разделения фаз хлороформный слой, содержащий липиды, отделяли на делительной воронке и упаривали на роторном испарителе (Т<37^oC) до отсутствия запаха хлороформа. Выход липидного экстракта составил 1% от массы сухой водоросли, что согласуется с известными в литературе данными [8].

Эксперимент проводили на крысах-самцах линии Вистар массой тела 200-220 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария и на стандартном рационе питания. В качестве сравнения использовали коммерческий препарат «Эссенциа-ле®» (полиненасы-щенный фосфатидилхолин соевых бобов производства «Рон-Пуленк Рорер», Германия) [1]. Для создания острого токсического гепатита животным вводили в дорзальную шейную складку четыреххлористый углерод (ЧХУ) в дозе 2 мл/кг в 50% масляном растворе (оливковое масло) ежедневно в течение 4 дней [1]. С 5-го дня эксперимента одна группа животных получала в течение 7 дней эссенциале (в вазелиновом масле) в дозе 80 мг/кг [4], другая группа – липидный комплекс из Saccharina japonica в той же дозе (в вазелиновом масле). Животным контрольной группы вводили эквиобъемное количество вазелинового масла. В ходе исследования были выделены следующие группы животных по 10 крыс в каждой: 1я – контроль; 2-я – введение ЧХУ в течение 4 дней; 3-я – введение ЧХУ с последующей отменой (депривация) в течение 7 дней; 4-я – введение липидной фракции из сахарины в период депривации в течение 7 дней; 5-я –введение эс-сенциале в период депривации в течение 7 дней. Через сутки после последнего введения препаратов крыс выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом с соблюдением правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986). Исследование одобрено Комиссией по вопросам этики Тихоокеанского океанологического института им. В.И. Ильичева ДВО РАН.

Липиды из ткани печени экстрагировали по методу J. Folch et al. [9]. Количество общих липидов определяли весовым методом в мг на 1 г сухой ткани. Фракционное разделение фосфолипидов осуществляли методом двумерной микротонко-слойной хроматографии на силикагеле, а их количественное определение по методу V.E. Vaskovsky et al. [12]. Использовали следующие системы растворителей [11]: в первом направлении – хлороформ: метанол: аммиак (28%-ный) (65:25:5 или 65:35:5, по объему), во втором – хлороформ: ацетон: метанол: ледяная уксусная кислота: вода (30:40:10:10:5 или 50:20:10:10:5, по объему). Для обнаружения холинсодержащих фосфолипидов (фосфатидилхолин, лизофосфатадилхолин, сфингомиелин) использовали реактив Драгендорфа [14]; липиды проявлялись в виде оранжевых пятен на желтом фоне. Для обнаружения фосфолипидов, содержащих аминогруппу (фосфатидилэтанола-мин, лизофосфатидилэтаноламин, фосфатидилсе-рин), пластинки опрыскивали 5%-ным раствором нингидрина в ацетоне [11] с последующим нагреванием в течение 2-3 минут над парами воды до появления розовых пятен на белом фоне. Фосфолипиды, содержащие гидроксильную групппу (фосфатидилинозит), обнаруживали с помощью периодатного реактива Шиффа [3], пятна липидов имели розово-сиреневый цвет. Для проявления всех фосфолипидных фракций применяли молиб-датный реактив [12] и реагент на основе малахитового зеленого [13]. При этом липиды проявлялись в виде синих или зеленых пятен на белом фоне. Содержание отдельных фракций фосфолипидов выражали в процентах от их общего количества. В сыворотке крови определяли активность аланинаминотрансферазы (АлАТ; BIO-LA-TEST, Чехия), в печени – содержание малонового диальдегида (МДА) [2]. Обработку результатов проводили с использованием статистического пакета Instat 3.0 (GraphPad Software Inc. USA, 2005) с функцией проверки соответствия выборки закону нормального распределения. Для определения статистической значимости различий в зависимости от параметров распределения использовали параметрический t-критерий Стьюдента или непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение. При изучении состава липидного комплекса из экстракта Сахарины японской было выявлено, что более 60% относится к категории мембрано-активных компонентов [5]. В качестве мембраноактивной фракции принимали сумму эссенциальных фосфолипидов и нейтральных липидов. Эссенциальные фосфолипиды составляли 65% мембраноактивной фракции липидов, при этом суммарное содержание основных структурных компонентов мембран фосфати-дилхолина и фосфатидилэтаноламина, а также предшествен-ника биосинтеза фосфолипидов -фосфатидной кислоты составляло более 60%. Важным элементом этой композиции является высокое содержание (более 30%) в составе фосфолипидов ПНЖК семейства n-3 - предшественниц биологически активных эйкозаноидов [9].

Введение ЧХУ в течение 4 дней вызывало у животных типичную картину токсического гепатита с изменением биохимических показателей, характеризующих уровень свободно-ради-кальных процессов в организме и обмен липидов в печени. Отмечали достоверное увеличение в 1,4 раза (4,8±0,33 г/100 г массы против 3,43±0,21 г/100 г массы в контроле; р<0,001) удельной массы печени при одновременном снижении массы животных в опытной группе на 20% (175±3,9 г против 219±5,6 г в контроле; р<0,001). При визуальном обследовании в пече-ни отмечалась сплошная зернистость жировых включений, то есть проявлялась выраженная жировая инфильтрация, характерная при интоксикации ЧХУ. Количество общих липидов в печени превышало контрольный уровень в 3 раза, что составляло 133,18±6,54 мг/г ткани против 44,21±2,68 мг/г ткани в контроле.

Таблица 1. Содержание фракций фосфолипидов в печени крыс после поражения четыреххлористым углеродом и введении липидной фракции таллома S. japonica и эссенциале (M±m)

Примечание: различия статистически достоверны при * ¹ - р < 0,05;” ² - р<0,01; *" ³ - р<0,001. Звездочки справа -сравнение с контрольной группой, звездочки слева - сравнение с 3-й группой (депривация), цифры справа -сравнение с 4-й группой. Сокращения: ФХ - фосфатидилхолин, ЛФХ - лизофосфатидилхолин, СМ - сфингомиелин, ФЭ - фосфатидилэтаноламин, ЛФЭ - лизофосфатидилэтаноламин, ФС - фосфатидилсерин, ФИ -фосфатидилинозит, ФК - фосфатидная кислота, ДФГ - дифосфатидилглицерин

О развитии токсического гепатита в данной экспериментальной модели свидетельствует повышение активности в крови фермента маркера цитолиза АлАТ в 6 раз (236,63±29,65 Ед/л против 38,56±3,18 Ед/л в контроле; р<0,001), обусловленное выходом фермента из гепатоцитов в кровь в результате повышения проницаемости мембран. Биохимическим механизмом этого феномена является активация перекисного окисления жирных кислот мембранных фосфолипидов, что в нашем эксперименте подтверждается двукратным увеличением содержания МДА (81,6±4,2 нмоль/г 39,8±2,3 нмоль/г в контроле; р<0,001) в печени крыс. Высокая активность перекисного окисления липидов (ПОЛ) приводит к изменениям в соотношении фосфолипидных фракций гепатоцитов (табл.), что сопровождалось увеличением на 39%

(p<0,001) содержания лизофосфатидилхолина (ЛФХ), на 60% (p<0,001) лизофосфатидилэтанола-мина (ЛФЭ), на 74% (p<0,001) фосфатидной кислоты (ФК), что обусловлено активацией фосфолипаз.

Отмечали снижение содержания основных структурных комопонентов мембран - фосфати-дилхолина (ФХ) и фосфатидилэтаноламина (ФЭ) на 7-10% (р<0,001). Известно, что при активации свободнорадикальных процессов в мембранах в первую очередь подвергаются окислению полинена-сыщенные жирные кислоты фосфолипидов, что и вызывает уменьшение содержания соответствующих фракций. Накопление лизофракций фосфолипидов в мембране гепатоцитов приводит к нарушению пространственно-функционального матрикса и вызывает компенсаторный ответ в виде увеличения количества сфингомиелина, кото- рый наряду с холестерином, является ее стабилизатором. Уменьшение количества дифосфатидилг-лицерина (ДФГ) на 27% (p<0,001) - основного фосфолипида митохондрий, предполагает нарушение в системе фосфорилироания и ресинтеза АТФ. Следует отметить, что снижение содержания метаболически активных фракций фосфатидилино-зита (ФИ) на 14% (p<0,001) и фосфатидилсерина (ФС) на 21% (p<0,001), определяет угнетение активности мембраносвязанных ферментов.

Через 7 дней после отмены ЧХУ (период депривации) в печени подопытных животных (3-я группа) большинство изученных биохимических параметров не нормализовалось, что свидетельствовало о продолжающемся токсическом стрессе и недостаточности собственных защитных сил организма противостоять развитию токсической патологии. Так, масса животных в период отмены токсиканта (депривациия) изменилась незначительно по сравнению со 2-й группой (ЧХУ) (увеличение на 5%) и составила 183,79±4,60 г, тогда как относительно контроля сохранялась достоверно низкой (на 19%, р<0,001). Удельная масса печени животных снизилась на 10% (р<0,05) относительно 2-й группы (ЧХУ), что соответствовало 4,32±0,15 г/100 г массы, но в то же время, еще достоверно превышало контрольный уровень на 26% (р<0,001). В печени при вскрытии имелись зернистые включения липидов. Количество общих липидов в печени превышало контрольный уровень в 2,7 раза (р<0,001), что составляло 118,35±10,56 мг/г ткани. Достоверно высокими по сравнению с контролем сохранялась актив-ность АлАТ (на 51%, р<0,05) и уровень МДА на 58% (соответственно 58,22±2,14 Ед/л и 62,88±3,18 нмоль/г; р<0,001). В период депривации были отмечены еще большие отклонения в соотношении фосфолипидных фракций гепатоцитов. Содержание лизофракций (ЛФХ и ЛФЭ) продолжало нарастать, что указывает на дальнейшую активацию ПОЛ и фосфолипаз. Содержание основных структурных компонентов мембран (ФХ и ФЭ) имело тенденцию к дальнейшему снижению по сравнению со 2-й группой, а относительно контрольных значений было снижено на 13-17% (р<0,001). Содержание метаболический активных фракций (ФС, ФИ и ДФГ) оставалось на уровне 2-й группы, при дальнейшем увеличении содержания СМ, которое достигло 53% (р<0,001) по отношению к контролю.

Введение липидного комплекса из S. japonica и эссенциале в период отмены ЧХУ пока-зало, в общем, схожий биологический эффект, но с разной степенью выраженности. Так, в 4-й группе ( S. japonica ) масса тела крыс составляла 220±6,18 г, тогда как в 5-й группе (эссенциале) - 202±5,12 г, что на 8% (p<0,05) ниже контроль-ных величин. Удельная масса печени в 4-й группе, в среднем, была

3,38±0,09 г/100 г массы, а в 5-й группе - 2,99±0,11 г/100 г массы. Количество общих липидов в печени крыс 4-й группы относительно контроля полностью нормализовалось (45,57±2,20 мг/г ткани), тогда как в 5-й группе эта величина была на 20% (р<0,05) выше (53,19±2,51 мг/г ткани). Активность АлАТ при введении комплекса липидов из S. japonica достоверно не отличалась от контроля (41,62±2,31 Ед/л), а при введении эссенциале была выше на 25% (49,65±2,35 Ед/л; р<0,05), что свидетельствует о не полном восста-новлении структуры мембран гепатоцитов. Величина МДА в 4-й группе также восстановилась до контрольных величин (40,56±3,12 нмоль/г печени), а при введении эссенциале была на 28% (р<0,05) выше контроля (50,09±3,08 нмоль/г печени), что указывало на сохраняющийся повышенным уровень ПОЛ. При анализе фосфолипидного спектра в ткани печени животных 4-й и 5-й групп в сравнении с контрольными значениями, было отмечено, что введение комплекса липидов из S. japonica сопровождалось нормализацией исследуемых биохимических параметров. Так, до контрольных значений снизилось количество ЛФХ и ЛФЭ при одновременном увеличении содержания ФХ и ФЭ. Восстановилось соотношение метаболически активных фракций (ФК, ФИ, ФС, ДФГ) т.е. применение комплекса липидов из S. japonica в период депривации способствовало снятию токсического действия ЧХУ. При этом в группе эссенциале, несмотря на выраженную тенденцию к нормализации исследуемых биохимических показателей, были отмечены повышенные уровни ЛФХ и ЛФЭ, соответственно, на 22 и 46% (р<0,001). В то же время, содержание ФК, ФИ, ФС и ДФГ не восстановилось до уровня контроля. Это указывает на сохраняющиеся последствия токсического стресса. Таким образом, применение комплекса липидов из S. japonica показало более высокую эффективность в восстановлении функции печени. По мнению авторов, основной причиной наблюдаемых различий является то, что биологической активности полиненасыщенного фосфатидихолина из соевых бобов, входящего в состав эссенциале, противопоставлен многокомпонентный липидный комплекс из S. japonica . Его более высокая эффективность, по нашему мнению, обусловлена наличием в составе практически всех известных классов фосфолипидов морского происхождения, обладающих репаративными свойствами. При этом свободные жирные кислоты с высокой степенью ненасыщенности (семейство n-3 и n-6) участвуют в преобразовании лизофосфолипидов в основные структурные компоненты мембран и метаболически активные фракции фосфолипидов.

Выводы: на основании полученных результатов следует, что применение липидного комплекса из экстракта S. japonica при экспериментальном ЧХУ-гепатите сопровождалось выраженным гепатозащитным действием, которое проявлялось в восстановлении массы животных и весовых показателей печени, нормализации липидного обмена и снижении перекисного окисления липидов. Механизм терапевтического действия липидного комплекса из S. japonica обусловлен восстановлением фосфолипидного паттерна мембран гепатоцитов за счет обеспечения необходимого набора пластических ресурсов в виде фософлипи-дов и полиненасыщенных жирных кислот для репарации липидного бислоя плазматической мембраны, восстановления ее пространственнофункционального матрикса. По исследованным показателям липидный комплекс из S. japonica превосходит препарат «Эссенциале^®».

Работа поддержана Российским научным фондом проект № 14-50-00034.

• 5.

• 6.

• 7.

• 8.

• 9.