Локализация индолсодержащих веществ в структурах костного мозга после гетеропересадки

Воробьева О.В. Локализация индолсодержащих веществ в структурах костного мозга после гетеропересадки// Морфологические ведомости.- 2017.- Том 25.- № 2.- С. 51-53. (25).02.09

Vorob’eva OV. The localization of indole-containing substances in bone marrow structures after heterografting. Morfologicheskie Vedomosti – Morphological Newsletter. 2017 Jun 30;25(2):51-53. (25).02.09

Введение. Большая распространённость, высокая смертность и постоянный рост онкозаболеваний среди населения вызывают неуклонный интерес к изучению данной проблемы. Для диагностики и лечения этой группы заболеваний разрабатываются всё более новые методы диагностики и лечения; в этом направлении развивается новая отрасль биомедицины, получившая название тераностики [1-2]. Существенное значение придается выявлению нейромедиаторов гранулярных и тучных клеток красного костного мозга, которые с помощью мембранных рецепторов вступают во взаимодействие с другими клетками организма, включая опухолевые и, соответственно, участвуют в регуляции дифференцировки и пролиферации клеток [3-7]. Однако в литературе отсутствуют сведения о локализации индолсодержащих веществ в структурах костного мозга после введения чужеродного костного мозга. В связи с этим, эти вещества нами изучены в костном мозге.

Цель исследования - установление локализации индол-содержащих веществ в костном мозге после гетеропересадки во временном аспекте.

Материалы и методы исследования. В эксперименте использовали 3 группы мышей: 1 группа - интактные мыши без какого-либо воздействия (n=15); 2 группа – контрольные мыши (n=15), которым вводили 0,85 % физиологический раствор NaCl в дозе 1 мл/кг массы. На фоне введения раствора, в течение времени до 30 минут, отмечалось изменение содержания нейроаминов в красном костном мозге. В дальнейшем эти параметры уравнивались с интактными мышами, картина препаратов была идентичной. 3 группа (n=15) - гетерогенная пересадка 1 мл костного мозга, полученного из бедренной кости морских свинок, помещённого в 3 мл 0,9% физиологического раствора и тщательно размешенного. 1 мл полученной суспензии красного костного мозга вводили в хвостовую вену мыши. Число клеток в 1 мл суспензии было равно 2,1х10 ^8. Опытные животные содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к корму. Мышей выводили из эксперимента через 40 мин, 60 мин, 4 часа, 1 сутки, 2 суток после процедуры гетеропересадки. Извлекали костный мозг и выявляли индол-содержащие вещества методом Массона-Фонтаны. Подсчет гранулярных и тучных клеток производили в 5 полях зрения микроскопа Люмам-6 (ЛОМО, Россия) при увеличении х400, диаметр зонда 0,5 мм. Использовался иммуногистохимический метод для выявления пролиферации клеток, экспрессирующих маркеры p-53. В эксперименте использовали поликлональные антитела к белку апоптоза р-53 (Santa Cruze, CША). Иммуногистохимические реакции для выявления р-53 осуществляли в соответствии со стандартными протоколами на базе патологоанатомического отделения Республиканского клинического онкологического диспансера Минздравсоцразвития Чувашской Республики. Срезы костного мозга помещали на предметные стекла, обработанные L-polysine, которые в течение суток высушивали при комнатной температуре. С использованием иммуногистохимических автоконтейнеров AUTOSTAINER-360 (THERMO, Великобритания) и Leica BOND-MAX (Германия) проводили окрашивание ручным и аппаратным способами.

Рис. 1. Микрофото. Мазок красного костного мозга. Индолсодержащие клетки: А - эозинофилы; Б -палочкоядерные нейтрофилы; В - сегментоядерные нейтрофилы; Г - эритробласт; Д - миелоцит. Окр. методом Массона-Фонтаны. Ув.: х1000, иммерсия.

Рис. 2. Микрофото. Препарат костного мозга интактных мышей. Иммуногистохимическая реакция на маркер p-53. А.-тучные клетки; Б - гранулярные клетки; В - нейтрофилы; г -эндотелий. Ув.: x100.

Рис. 3. Микрофото. Препарат костного мозга мышей после гетеропересадки. Иммуногистохимическая реакция на маркер p-53. А - тучные клетки; Б - лимфоциты. Ув.: x100.

Для визуализации продуктов иммунной реакции использовали стрептавидин-биотиновый пероксидазный метод («Dako», LSAB+Kit, HRP), в качестве красящего соединения применяли раствор диаминобензидина («Dako», Liguid DAB+), докраска ядер осуществлялась гематоксилином. Положительной экспрессией белка р53 считалось наличие специфической коричневой окраски ядер клеток. На все эксперименты было получено разрешение локальной этической комиссии университета. Все манипуляции на животных проводили согласно международным и отечественным этическим и научным стандартам планирования и выполнения исследований на животных (приказ МЗ и СР РФ от 23.08.2010 г. № 708н «Правила лабораторной практики», приложения к приказу Минздрава СССР от 12.08.1977 г. № 755 и приказу Минсельхоза РФ от 05.11.2008 г. № 490 «Об утверждении правил проведения лабораторных исследований в области ветеринарии»; Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, ЕЭС, Страсбург, 1985; требования Хельсинкской декларации и Всемирной медицинской ассоциации, 2000; рекомендации, содержащиеся в Директивах Европейского сообщества, 86/609 ЕС).

Результаты исследования и обсуждение. По данным метода Массона - Фонтаны, у экспериментальных мышей после гетеропересадки через 40 мин в костном мозге индол-содержащие вещества определяются в тучных клетках, в зернистости эозинофилов и гранулярных клетках, выявляемых при люминесцентно-гистохимических методах в виде гранулярных люминесцирующих клеток [5]. В нейтрофилах, бластных формах клеток, это вещество выявляется в хроматине. В большинстве гемопоэтических клеток, данное вещество практически не определяется, за исключением клеток эритроидного ряда, мегакариоцитов и хроматина плазмоцитов (рис. 1). Через 60 мин после гетерогенной пересадки максимальное содержание индол-содержащих веществ выявляется в единичных гранулярных клетках, с единичными разнокалиберными гранулами, а также в бластных формах. В клетках эритроидного ряда, мегакариоцитах, в зернистости и ядрах клеток эозинофильного ряда индол-содержащие вещества определяются в виде следов. Через 4 часа после гетеропересадки минимальное содержание индолсодержащих веществ выявляется во всех структурах костного мозга, за исключением лимфоцитов и мегакариоцитов, где эти вещества сохраняются на высоком уровне.

Через сутки после гетерогенной пересадки костного мозга исследуемые вещества появляются в эндотелиальных клетках сосудов, в гранулярных клетках, имеющие разного размера гранулы: от светлокоричневого до черного цвета. Число таких клеток невелико, примерно одна на 5 полей зрения. Появляется положительно импрегнированная цитоплазма жировых клеток, около которых концентрируются мелкие тучные клетки. Кроме того, индоловые вещества в небольшом содержании определяются в ядрах плазмоцитов, плазмобластов, лимфоцитах, а также в единичных гранулах тучных клеток. Через 2-е суток их содержание претерпевает изменения с прогрессивным уменьшением содержания в структурах костного мозга. Полностью перестают выявляться тучные и гранулярные клетки, индол-содержащие вещества выявляются лишь в единичных гранулах клеток. Продолжает увеличиваться число положительно импрегнированных жировых клеток. При иммуногистохимической реакции на белок p53

в костном мозге мышей его экспрессия отмечается в ядрах тучных и гранулярных клетках, однако их число невелико. Мегакариоциты имеют слабую позитивную реакцию, в препаратах определяется большое число лимфоцитов, до 17 клеток на несколько полей зрения, отсутствуют митотически делящиеся клетки, отмечается значительное снижение интенсивности окраски в остальных структурах костного мозга (рис. 2-3).

Заключение. Таким образом, по результатам данного исследования можно заключить, что через 40 мин после гетеропересадки в костном мозге индол-содержащие вещества избирательно локализуются в тучных и гранулярных клетках, клетках эритроидного ряда, мегакариоцитах, т.е. отмечается активация некоторых гемопоэтических ростков в костном мозге [8]. Через 60 мин максимальное содержание данных веществ в разных структурах костного мозга различается. Через 4 часа высокое содержание индол-содержащих веществ наблюдается в лимфоцитах и мегакариоцитах, в остальных структурах содержание минимально. Через сутки данные вещества определяются в единичных гранулярных клетках, число которых значительно снижено. К концу эксперимента тучные и гранулярные клетки перестают выявляться, однако определяется положительно импрегнированные ядра жировых клеток, около которого располагаются мелкие тучные клетки. Это указывает на нарушенную дифференцировку клеток костного мозга и замещение функционально активных клеток костного мозга на липоциты [5]. При иммуногистохимической реакции выявляется снижение процессов пролиферации с отсутствием митотически делящихся клеток. Однако определяется повышенное число лимфоцитов, возможно, мигрировавших в костный мозг из крови в ответ на антигенное воздействие [6-7]. В целом, при гетеропересадке в костном мозге на ранних сроках наблюдается увеличение содержания индол-содержащих веществ в тучных, гранулярных, клетках эритроидного ряда, мегакариоцитах. К концу эксперимента тучные и гранулярные клетки не определяются, индолсодержащие вещества выявляются в единичных гранулах, происходит также образование жировых клеток, которые этими веществами интенсивно импрегнируются.