Магнитные эффекты антибактериального действия облученного бензилпенициллина натриевой соли

го магнитного поля на простые молекулы, воду, полимеры и другие биологические системы [1-8].

Появились работы по влиянию ИМП на химические и биологические реакции, показано, что действие низкоинтенсивного лазерного излучения и переменного магнитного поля меняет антиокислительный статус крови и стимулирует поглощение кислорода эритроцитами [9]. Получены экспериментальные данные основного предсказания теории о возможности влияния слабых магнитных полей на скорость некоторых Ca2+ зависимых биохимических реакций в бесклеточных системах [10]. Изучена оценка влияния параметров ИМП на живые клетки in vitro. Установлено, что воздействие ИМП на культуру МСКч приводит к мгновенному обратимому повреждению цитоплазматических мембран клеток, как следствие, снижению жизнеспособности культуры и негативным изменениям морфологии клеток [11].

В последнее время в технике получают применение ИМП для осуществления операций штамповки, сборки, сварки [12]. В этих технологиях используются ИМП, возникающие в резуль- тате разряда батареи конденсаторов на индуктор (катушку) [13]. Вокруг витков токопровода индуктора возникает и распространяется ИМП.

Величины разрядного тока и напряжённости магнитного поля в индукторе зависят от параметров зарядной цепи, т. е. от ёмкости накопителя энергии C и индуктивности индуктора L.

В зависимости от того какой индуктор применяется (одно или многовитковый) меняется индуктивность и, следовательно, параметры ИМП. При этом меняется частота разрядного контура по закону (1).

f =               .               (1)

2 π L ₁ C ₀

Характер изменения тока в разрядной цепи при использовании одновиткового (I, τ ) и мно-говиткового индуктора (I^*, τ ^*) показан на рис. 1.

При реализации магнитно –импульсных технологий используют многократное нагруже- ние однократными импульсами синусоидальной формы с различными временными интервалами в пачке (рис. 2).

Интенсивность магнитного поля (величины

I, Н) зависит от количества энергии W, запасенной в батареи конденсаторов магнитно-им- пульсной установки (МИУ) [14], которая изменяется по закону (2)

си ²

W = ^CU

.

Цель настоящего исследования – изучение влияния ИМП высокой напряжённости на антибактериальную активность бензилпенициллина натриевой соли.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Техническая составляющая. На рис. 3 представлена схема воздействия ИМП на бензилпенициллин натриевую соль, размещённую в стандартном флаконе.

При этом использовалась магнитно - импульсная установка МИУ-15 [14], параметры которой приведены в табл. 1.

Для оценки влияния частотной характеристики «f» на биологическую активность бензилпенициллина натриевой соли использовались два типа индукторов «на обжим»: одно и много-витковый (10 витков), чертеж и внешний вид последнего показан на рис.4.

Разрядный ток фиксировался с помощью пояса Роговского, а напряжённость магнитного поля с помощью датчика Холла. Примеры полученных осциллограмм приведены на рис. 5.

Собранный экспериментальный стенд, включающий все составляющие магнитно-импульсного воздействия на бензилпенициллин натриевую соль, показан на рис. 6.

Биологическая составляющая. В экспериментах брали бензилпенициллин натриевую соль в порошкообразном (1 г) и растворённом в

(I*, t * )

б)

Рис. 1. Осциллограммы разрядного тока при использовании: (а) – одновиткового индуктора, (б) – многовиткового индуктора

Рис. 2. Многократное нагружение

Рис. 3. Схема воздействия ИМП на бензилпенициллин натриевую соль

стерильной воде виде при концентрации 0,05 г/ мл. После облучения порошкообразный бензилпенициллин доводили до концентрации 0,01 г/ мл, а растворенный до 0,005 г/мл. Воздействие пенициллина осуществляли на клетки E. coli. Посев бактериальной культуры кишечной палочки осуществлялся на МПА (мясопептонный агар). Escherichia coli M 17 - штамм кишечной палочки получен из медицинского сертифицированного препарата «Колибактерин», предназначенного для лечения желудочно-кишечных расстройств у людей. Инокуляты E. coli готовились внесением 1 г сухой культуры в 10 мл среды, состав которой был следующим: пептон – 5 г/л ; глюкоза – 10 г/л ; NaCl – 4,68 г/л ; KCl – 1,48 г/л; NH₄Cl – 1,08

a)

б)

Рис. 4 (а) – чертеж;

• (б) – внешний вид многовиткового индуктора

Таблица 1. Параметры МИУ-15

Запасаемая энергия, W, кДж	Напряжение разряда, U, kV	Собственная частота разрядного тока, f, кГц	С о, Мкф	L 0 , мкГн
18	1…20	55	100	0,09

a)

Рис. 5. Осциллограммы импульсного магнитного поля:

(а) – осциллограмма разрядного тока при использовании одновиткового индуктора при W=1 кДж,I (ток)= 183,6 103А. (б) – осциллограмма напряженности магнитного поля при использовании одновиткового индуктора при W=1кДж, H (напряженность)= 0,1987 106 А/м.

б)

г /л; CaCl2 – 0,44 г/л; Трис – 6 г/л ; K2HPO4 – 2 г/л;

MgS04 - 5 г/л.

Для определения чувствительности данной бактерии к антибиотику использовали диски, пропитанные раствором бензилпенициллина натриевой соли. Рост бактериальной культуры происходил в термостате при 30 в течении 18 часов. Антибактериальная активность оценивалась за-

Рис. 6. Экспериментальный стенд:

(а) – Схема измерения параметров ИМП, (б) – Вид экспериментального стенда

a)

Воздействие ИМП    на порошок или раствор антибиотика.

Разведение антибиотика до нужной концентрации, растределение по поверхности чашки Петри по 0,1 мл инокулянта Escherihia coh.

Размещение дисков на    поверхности чашки и нанесение на них 10 мкл раствора антибиотика.

Размещение чашек Петри в термостат при температуре 30 °C в течение 18 часов.

Измерение зонлизиса.

Рис. 7. Процесс подготовки и проведения экспериментов мером среднего диаметра зоны лизиса в см. Диаметр зон задержки роста измеряли с точностью до 0,5 мм [15]. В случае, когда форма зон лизиса отличалась от круговой, производился расчет диаметра, как средний после замера расстояний между противоположными граничными точками фигуры в не менее чем в 10 направлениях.

Последовательность процесса подготовки и проведения экспериментов приведена на рис. 7.

Программа экспериментов включала две группы исследований:

• 1.    Исследование влияния на порошкообразный бензилпенициллин натриевую соль и его антибактериальную активность ИМП с напряжением в диапазоне U от 3 кВ до 11 кВ (табл. 2) при частоте f =40 кГц (одновитковый индуктор) и количестве импульсов n=1.

• 2.    Для водного раствора бензилпеницилли-

• Таблица 2. Параметры воздействия ИМП на порошкообразный бензилпенициллин натриевую соль

W, кДж	0,45	0,81	1,00	1,27	1,83	2,49	3,25	4,11	5,08	6,14
U, кВ	3,0	4,0	4,5	5,0	6,0	7,0	8,0	9,0	10,0	11,0
Н (одновитковый индуктор), А/м 106	0,09	0,16	0,20	0,25	0,37	0,50	0,65	0,82	1,02	1,23
/кГц	40
N	1

Таблица 3. Параметры воздействия ИМП на раствор бензилпенициллина натриевой соли с одно и многовитковым индукторами

W, кДж			1,00	3,25	5,08
U, кV			4,50	8,0	10,0
Н 1 , (одновитковый индуктор), А/м • 10 6			0,2	0,65	1,02
Н 2 , (многовитковый индуктор), А/м • 10 6			7,65	13,38	17,2
f, кГц	Индуктор	одновитковый	40	40	40
		многовитковый	10	10	10
N		одновитковый	1	1	1
		многовитковый	3	3	3

W ,кДж    I , kA   f, к Гц

3 ,25       1 60        4 0

3,25       53

Рис. 8. Примеры осциллограмм разрядного тока при различных энергиях и параметрах воздействия на бензилпенициллин натриевую соль

5,0     2 4 4,8       4 0

5,0        68         1 0

на натриевой соли исследовалось влияние ИМП при W от 1,0 до 5,08 кДж, f10 кГц и 40 кГц и n=1 и 3 импульсов (табл. 3).

Таким образом, исследовался интервал напряжённостей ИМП от 0,09 106 А/м до 1,23 106 для порошкового состояния пенициллина и от 0,2 106 А/м до 17,2 106 А/м водного раствора, при двух значениях частоты 10 и 40 кГц, количестве импульсов воздействия 1 и 3.

Значения напряженностей, приведенные в таблицах, получены после обработки соответствующих осциллограмм. На рис. 8 в качестве примера приведены токовые кривые при различных энергиях и параметрах воздействия.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Эксперименты по изучению влияния импульс- ного магнитного поля на антибактериальную активность бензилпенициллина натриевую соль.

Результаты экспериментов приведены на рисунках 9-11.

Как видно из рис. 9 на всех режимах воздействия ИМП на порошкообразный бензилпенициллин наблюдается достоверный рост диаметров зоны лизиса d на 12-24%. Однако какой- либо функциональной зависимости не наблюдается.

При воздействии ИМП на раствор бензилпенициллина натриевой соли при тех же режимах, что и на порошок, наблюдается обратная картина - уменьшение диаметров зоны лизиса на 8-11%. Таким образом, зависимость уменьшения ни от H, ни от f не от n не наблюдалась (рис. 10).

При изучении влияния времени хранения облученного порошкообразного бензилпе-

Рис. 9. Диаметры зон подавления роста E. coli при воздействии бензилпенициллина натриевой соли, порошок, которого облучали ИМП с энергиями от 0,45 до 6,14 кДж при количестве импульсов 1 с одновитковым индуктором (две серии экспериментов с разрывом между ними – 2 месяца).

Примечание: * – отличия диаметра зоны подавления роста E.coli при воздействии бензилпенициллина, облученного ИМП, от контроля в первой серии эксперимента достоверны с уровнем значимости Р<0,05; # – отличия диаметра зоны подавления роста E.coli при воздействии бензилпенициллина , облученного ИМП, от контроля во второй серии эксперимента достоверны с уровнем значимости Р<0,05.

3,5

2 v

| 3

I 2,5

контроль

3,25

508 кДж

□ 1 импульс; одновитховый индуктор

(3 3 импульса, одновитковый индуктор

• □ 1 импульс; многовитковый индуктор ИЗ импульса, многовитковый индуктор

Рис. 10. Диаметры зон подавления роста E. coli при воздействии бензилпенициллина натриевой соли, раствор которого облучали ИМП с энергиями 1 кДж, 3,25 кДж, 5,08 кДж при количестве импульсов 1 и 3 с одновитковым или многовитковым индукторами

Примечание: * – отличия диаметра зоны подавления роста E. coli при воздействии бензилпенициллина, облученного ИМП, от контроля достоверны с уровнем значимости Р <0,05

нициллина на изменение диаметров зон подавления роста E.coli было получено, что через три часа хранения средний диаметр зоны лизиса при воздействии активности пенициллина, облученного ИМП с напряжением в диапазоне от 3 до 9 кВ, был достоверно выше на 14-21%, чем диаметр зоны лизиса в контрольных чашках активности необлученного пенициллина (рис. 11). Через сутки хранения сохранение достоверного увеличения антибактериальной активности бензилпенициллина натриевой соли мы наблюдали только в случае облучения порошка антибиотика ИМП с напряжением 7 и 9 кВ.

Таким образом, при обработке ИМП порошкообразного бензилпенициллина натриевой соли наблюдается рост диаметров лизиса на 1224% и, следовательно, можно констатировать увеличение антибактериальной его активности, а при обработке на тех же режимах раствора бензилпенициллина размер диаметров уменьшается на 8-10%, что соответствует снижению антибактериальной активности. Схематично, это можно представить рис. 12 и 13.

Рис. 11. Изменения диаметров зон подавления роста E. coli относительно контроля при воздействии бензилпенициллина натриевой соли, порошок которого облучали ИМП с напряжением от 3 кВ до 9 кВ при количестве импульсов 1 с одновитковым индуктором при различном времени хранения облученного порошкообразного антибиотика

Примечание: * – отличия диаметра зоны подавления роста E. coli при воздействии бензилпенициллина, облученного ИМП, от контроля достоверны с уровнем значимости Р <0,05

Рис. 12. Воздействие ИМП на порошок бензилпенициллина натриевой соли с последующей подготовкой раствора и его взаимодействии с E. coli.

Рис. 13. Воздействие ИМП на раствор бензилпенициллина натриевой соли с последующим взаимовоздействием с E. coli.

Пенициллины относятся к обширному классу β -лактамных антибиотиков (рис.14) (пенициллины, цефалоспорины и др.), общим фрагментом в их структуре является β -лактамное кольцо, с наличием которого связана активность данных микробиологических препаратов. Пенициллины нарушают синтез пептидогликана клеточной стенки бактерий, связываясь и инактивируя специфические пенициллинсвязыва-ющие белки (транс- и карбоксипептидазы), что вызывает лизис и гибель бактериальной клетки [16]. Предполагается, что изменение конформации β -лактамных антибиотиков в условиях воздействия импульсного магнитного поля может увеличить их антибактериальную активность, так как повысится их сродство с активным центром пенициллинсвязывающих белков.

Чтобы разобраться в механизме происходящего, рассмотрим причины антибактериального действия пенициллинов на клетки бактерий.

Рис. 14. Структурная формула бензилпенициллина натриевой соли

Известно, что пенициллины вызывают гибель микроорганизмов, блокируя включения ацетил-мурамовых пептидов в строящиеся клеточные стенки бактерий, действуя на два типа ферментов - D-D-транспептидазу и D-D-карбоксипептидазу [17, 18], которые катализируют образование сши- вок. D-D-транспептидаза отщепляет концевой D-аланин от N-ацетилмурамилпентапептида (рис.15) и связывает остающийся тетрапептид с другим участком пептидогликана, D-D-карбоксипептидаза отщепляет концевой D-аланин, но не катализирует образование сшивки. По-видимому, антибактериальная активность р-лактамных антибиотиков в первую очередь связана с подавлением активности транспептидазы.

D-Аланин играет роль опознавательного сигнала для фермента. Затем происходит ацилирование транспептидазы пептидогликаном, сопровождающееся потерей одной молекулы D-аланина:

Фермент + R-D-Ala-D-Ala ^ R-D-Ala-фермент + D- Ala

После чего транспептидаза регенерируется, связывая концевой остаток D-аланина молекулы пептидогликана с цепочкой из четырех молекул глицина (соединенных с остатком лизина), второй молекулы пептидогликана [17, 19]. Пенициллин необратимо ингибирует транспептидазу, что вызывает летальный исход клеток Е. coli. Наиболее вероятный механизм воздействия пенициллина заключается в том, что он связывается с транспептидазным сайтом и ингибирует его, используя в качестве ацилирующего агента р -лактамный цикл антибиотика [17]. Сравнение молекулярных моделей пени-

/V-ацетилглюкоза-

HNCOCHj Остаток молочной кислоты

НС-СООН

/V-а цетил м ура мо вая кислота

L-аланин

D-аланин

D-аланин мезо-Диаминопиме-л и новая кислота

D-глутаминовая кислота

Рис. 15. Структура мономера пептидогликана клеточной стенки Е. coli.

циллина и D-аланил- D-аланина (рис.16) свидетельствуют о том, что пенициллин можно считать антиметаболитом этого дипептида [19].

Возможно, воздействие ИМП незначительно изменяет конформацию молекулы пенициллина в зависимости от заданных параметров магнитного поля. При некоторых конформационных положениях у молекулы пенициллина повышается сродство к активному центру транспептидазы, и антибактериальная активность увеличивается. В растворе облучению подвергаются не только молекулы пенициллина, но и молекулы воды, что вызывает усиленное воздействие на конформационное состояние пенициллина, способствующее снижению антибактериальной активности. Известно, что молекулы воды связаны сеткой водородных связей [20]. Предполагается, что магнитное поле влияет на водородные связи, вызывает переориентацию молекул воды [21], кроме того, изменяется рН в связи с формированием в воде нанопузырьковых диполей [22]. Таким образом, в результате влияния сильного ИМП могут возникать промежуточные активные частицы (радикалы). Поэтому в случае с облучением пенициллина в растворе, когда воздействие осуществлялось с более низкими энергиями, получено достоверное увеличение антибактериальной активности бензилпенициллина натриевой соли относительно контроля.

Полученные данные способствуют созданию научно-обоснованной модели поведения бензилпенициллина натриевой соли под воздействием ИМП, а проведенные эксперименты позволяют определить направления дальнейших исследований, границы параметров воздействия с целью построения научной модели поведения бензилпенициллина под воздействием ИМП, возможности практического использования результатов в медицине.

ВЫВОДЫ

В связи с проделанной работой и полученными результатами, можно сделать следующие выводы:

Показано достоверное увеличение диаметров зон подавления роста E. coli по сравнению с контролем при воздействии на порошок бензилпенициллина ИМП с напряженностями от 0,09 ^. 10⁶А/м до 1,23 ^. 10⁶ А/м при количестве импульсов 1 с одновитковым индуктором.

Получено достоверное снижение диаметров зон подавления роста E. сoli по сравнению с контролем при воздействии на раствор бензилпенициллина. ИМП с напряженностями 0,20 ^. 10⁶ А/м, 0,65 ^. 10⁶ А/м 1,02 ^. 10⁶ А/м при количестве импульсов 1 и 7,65 ^. 10⁶ А/м, 13,38 ^. 10⁶ А/м, 17,2 ^. 10⁶ А/м при количестве импульсов 3 с одно-витковым частота (f = 10кГц), многовитковым индуктором (f = 40 кГц).

Рис. 16. Сравнение молекулярной структуры пенициллина и D-аланил-D-аланина

При увеличении времени хранения облученного порошка бензилпенициллина натриевой соли до 1 суток возрастание антибактериальной активности антибиотика сохраняется только в условиях его облучения ИМП с напряжением 7 и 9 кВ при количестве импульсов 1 с одновит-ковым индуктором, при воздействии ИМП с напряжением 3 и 7 кВ диаметры зон подавления роста E.coli не отличались от контроля.

Выдвинута гипотеза повышения антибактериальной активности бензилпенициллина натриевой соли под воздействием ИМП, связанная с изменением конформации молекулы пенициллина.