Магнитные наночастицы Cu/Fe с противоопухолевой активностью

В настоящее время усилия ученых направлены на поиск новых эффективных препаратов для борьбы с онкологическими заболеваниями. В области биомедицины проявляется все большее внимание к наночастицам с магнитными свойствами как к перспективным агентам для целевой доставки лекарственных препаратов [1], подавления роста опухолевых клеток [2], магнитной сепарации [3], в качестве контрастных веществ для магнитно-резонансной томографии [4]. Наночастицы металлов могут стать лекарственными средствами для борьбы с опухолевыми клетками благодаря своим уникальным свойствам, связанным с высокой активностью и большой площадью доступной поверхности. Наиболее исследованы в этом отношении наночастицы золота и серебра, противоопухолевое действие которых подтверждено и детально описано в обзоре [5]. Однако цитотоксичность наночастиц Ag [6, 7] и Au [8] значительно ограничивает их применение в комплексной терапии рака, основной целью которой является подавление раковых клеток с минимальным повреждением нормальных тканей. В связи с этим разработка наночастиц для борьбы с опухолевыми клетками, способных быть доставленными в нужную точку действия, безусловно, является актуальной. Применение биметаллических наночастиц, содержащих два металла, с разделенными компонентами на уровне одной частицы со структурой «ядро – оболочка» (рис. 1а) или «янус» – наночастицы (рис. 1б), позволяет совмещать противоопухолевые свойства одного металла с магнитными свойствами другого.

О применении в биомедицинских целях биметаллических наночастиц сообщается в большом количестве современных публикаций, причем

Рис. 1. Изображение наночастиц со структурой: а) «ядро – оболочка», б) «янус» – наночастицы противоопухолевая активность наночастиц сильно зависела от топологического распределения элементов по частице [9]. Биогенные наночастицы «ядро-оболочка» Ag/Pd, полученные методом «зеленого синтеза» [10], значительно ингибировали рост раковых клеток MCF 7 и HEPG2 по сравнению с нормальными клетками. Химическим синтезом были получены наночастицы Au/Fe, на которые адсорбировали препарат доксорубицин, он, в свою очередь, связывался с оболочкой из золота и постепенно десорбировался [11]. Наночастицы из ядра из Ag, покрытые оболочкой из полимеров (поливинилового спирта, полиэтиленгликоля, поливи-нилпирролидона), проявляли противоопухолевую активность по отношению к клеткам рака молочной железы (MCF-7) [12]. Авторы [13] предложили применение наночастиц Ag–TiO2 со структурой ядро-оболочка в качестве новых высокоэффективных противоопухолевых препаратов.

В данной статье мы сообщаем о получении магнитных биметаллических наночастиц Cu/Fe с разделенными фазами методом электрического взрыва проводника. Противоопухолевая активность наночастиц меди уже была подтверждена [14], например, по отношению к следующим клеточным линиям: MDA-MB-231 [15], HeLa [16], transplanted sarcoma и Pliss’s lymphosarcoma [17]. Установлено

[18], что наночастицы меди имели избирательную токсичность только для раковых клеток, оставляя нормальные клетки почти незатронутыми.

Цель исследования – изучить противоопухолевую активность частиц Cu/Fe, полученных электрическим взрывам проводников, по отношению к клеткам линий Neuro 2a и J 774, что показывает возможность будущего использования таких наночастиц в качестве современных противоопухолевых препаратов.

Материал и методы

Наночастицы Cu/Fe получали методом совместного электрического взрыва железной и медной проволок в атмосфере аргона [19]. Содержание металлов в проволочках составляло не менее 98,0–99,0 % масс., диаметр каждой проволочки 0,2 мм. Перед использованием проволочки очищали органическим растворителем для удаления загрязнений с поверхности и предварительно скручивали между собой. Электрический взрыв проволочек производили на установке УДП-2М по методике, схема которой представлена на рис. 2.

Сначала проволоки из меди и железа предварительно скручивали между собой (рис. 2) и помещали в электровзрывную установку. На две проволоки подавали импульс тока высокой плотности (~107 A/см2), получаемый при разряде батареи конденсаторов заданной емкости. При прохождении импульса тока через проволоки происходило взрывное диспергирование металла и быстрое расширение продуктов взрыва - аэрозоля из паров металлов - в окружающий газ (аргон). При этом продукты взрыва охлаждались и образовывались наночастицы Cu/Fe. Поскольку непосредственно после синтеза нанопорошки пирофорны, перед использованием их пассивировали методом медленного напуска воздуха. Поэтому поверхность частиц покрыта тонкой оксидной пленкой.

Морфологию и размер наночастиц и их агломератов определяли методом просвечивающей электронной микроскопии (электронный микроскоп JEOL 2000FX, Япония). Для определения среднего размера наночастиц по данным электронной микроскопии строились гистограммы распределения частиц по размерам. Полученные гистограммы аппроксимировали нормально-логарифмическим законом. Для построения каждой гистограммы измеряли размеры не менее 3000 частиц. Фазовый состав наночастиц определяли с помощью рентгенографического метода на дифрактометре Дрон-7 (CoKα-излучение в режиме сканирования в интервале углов 20 от ~45 до 95°, с шагом 0,02°). Идентификацию фаз проводили с помощью программного комплекса PDF-2 Release 2014 database. Удельную поверхность образцов определяли на приборе Сорбтометр М (Sorbtometer M, Katakon, Russia) по низкотемпературной адсорбции азота и рассчитывали 5-точечным методом БЭТ. Для исследования кинетики растворения нанопорошка Fe/Cu в буфере Дульбекко (рН=7,1) в него помещали нанопорошок и через определенные промежутки времени отбирали пробы объемом 0,1 мл и измеряли концентрацию железа и меди методом инверсионной вольтамперометрии (CTA, Россия).

Цитотоксическое действие наночастиц определяли при помощи MTT-теста на культурах базальных клеток нейробластомы мыши Neuro 2a и гистиоцитарной саркомы мыши J 774 (культуры предоставлены Государственным научным центром вирусологии и биотехнологии VECTOR, Россия). Конечная концентрация клеток составила 1×104 клеток/100 мкл в лунке 96-луночного микропланшета. Клетки Neuro 2a (J 774) выращивали в виде монослоя в среде MEM (DMEM) с добавлением 10 % FCS, 2mML-глутамина и 1 % пенициллин/стрептомицина. Культивирование клеток проводили при температуре 37 ± 1ºС и 5 % CO2 в течение 24 ч. После инкубирования питательную среду удаляли и два раза промывали клетки раствором фосфатного буфера Дульбекко (DPBS). Для определения цитотоксичности использова- ли суспензии наноструктур в клеточной среде в концентрациях: 0,1 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,01 мг/мл и 0,001 мг/мл. Клетки с наночастицами инкубировали при температуре 37 ± 1ºС и 5 % CO2 в течение 24 ч. Для проведения MTT-теста питательную среду удаляли и два раза промывали клетки раствором DPBS. Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл питательной среды и по 10 мкл раствора MTT (3-4,5-диметилтиазол-2,5 дифенил тетразилия бромида). Инкубирование с раствором MTT проводили в течение 2 ч при температуре 37 ± 1ºС и 5 % CO2. По окончании инкубирования питательную среду осторожно удаляли и добавляли в каждую лунку по 100 мкл диметилсульфоксида для растворения кристаллов формазана. Через 15 мин определяли оптическую плотность на микроплан-шетном спектрофотометре Tecan Infinite M1000 PRO (Tecan, Groding, Автрия) при длине волны 570 нм. Далее вычисляли процент живых клеток (CL) по формуле

CL= (As–Am)/(Ac–Am)×100 %, где As – оптическая плотность исследуемого образца, Ac – оптическая плотность контрольного образца, Am – оптическая плотность среды.

Контрольной группой служили клетки без добавления наночастиц и отдельно с наночастицами Fe и Cu, также полученными электрическим взрывом одиночных проволок в атмосфере аргона. Для статистической обработки данных использовались параметрические методы с уровнем достоверности p≤0,05.

Результаты и обсуждение

При совместном электрическом взрыве железной и медной проволок в атмосфере аргона образовывались сферические частицы, среднечисленный размер которых составляет 63 нм (рис. 3). Частицы содержали 46 % масс. железа и 54 % масс. меди.

Сферическая форма частиц обусловлена механизмом их формирования. Наночастицы сферической формы всегда формируются из жидкой фазы

[20]. На ТЕМ-изображениях наночастиц видно, что наночастицы имеют приблизительно одинаковую форму и размер. При детальном исследовании частиц методом элементного анализа EDAX-TEM видно (рис. 4), что медь и железо неравномерно распределены по частице.

В данном случае формируется два вида наночастиц: «янус» – наночастицы, где медь и железо разделены между собой (рис. 4а); частицы со структурой ядро – оболочка, где ядро обогащено

Рис. 4. Распределение элементов по частице Cu/Fe железом, а оболочка – медью (рис. 4б). На диф-рактограмме образца (рис. 5) основные рефлексы соответствуют фазам металлического Fe и Cu. На дифрактограмме можно отметить небольшое плечо при 48° и небольшой пик при 46°, что говорит о присутствии оксида меди (I) и наличии оксидной пленки, которая покрывает поверхность частиц при хранении. Частицы окисляются на воздухе с образованием достаточно толстой оксидной пленки, защищающей поверхность наночастиц от дальнейшего окисления.

Удельная поверхность нанопорошка составляет Sуд(Cu/Fe)=7,8 м2/г и является характерной для металлических нанопорошков. Синтезированные наночастицы обладают достаточно широким распределением по размерам, поэтому далеко не все способны проникать внутрь клеток [21]. Несмотря на это, наночастицы Cu/Fe проявили дозозависимую токсичность по отношению к исследуемым линиям клеток. MTT-тест продемонстрировал выраженный цитотоксический эффект наночастиц по отношению к исследуемым клеточным линиям. Гистограммы, наглядно демонстрирующие величину токсического действия наночастиц Cu/Fe в концентрации 0,1 мг/мл, представлены на рис. 6.

Например, для клеток J 774 количество живых структур составило при воздействии наночастиц Cu/Fe 23,4 %, Cu – 58,6 % и Fe – 69,4 %. Причем биметаллические наночастицы Cu/Fe были наиболее токсичными из всех трех видов наночастиц. Такое повышение цитотоксического воздействия

Рис. 5. Дифрактограмма нанопорошка Cu/Fe

можно объяснить синергетическим эффектом меди и железа, содержащимися в наночастицах Cu/Fe на уровне одной частицы. Железо с медью образуют гальваническую пару. В результате эффективной контактной электрохимической коррозии образуются ионы Fe3+ и Cu2+, которые способны проникать внутрь клетки и оказывать цитотоксическое воздействие. Это подтверждается данными исследования концентрации ионов меди и железа при выдерживании образцов нанопорошков в DPBS. В течение 24 ч экспозиции нанопорошков в DPBS концентрация Fe3+ увеличивалась до 10,0 мкг/мл, ионов Cu2+ – до 4,4 мкг/мл. Изменения концентрации ионов при выдерживании в DPBS монометаллических порошков Cu или Fe составили: Cu2+ – 0,01 мкг/мл (нанопорошок Cu), Fe3+ – 0,03 мкг/мл (нанопорошок Fe). Ранее [22] сообщалось, что ионы Cu2+ способны изменять метаболизм раковых клеток, а также индуцировать их апоптоз.