Маркеры аэрогенной комбинированной экспозиции металлоксидными соединениями и трансформированного протеомного профиля плазмы крови у детей

Землянова Марина Александровна – доктор медицинских наук, главный научный сотрудник, заведующий отделом биохимических и цитогенетических методов диагностики; доцент кафедры микробиологии и иммунологии (e-mail: ; тел.: 8 (342) 236-39-30; ORCID: .

Зайцева Нина Владимировна – академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель (e-mail: ; тел.: 8 (342) 237-25-34; ORCID: .

Кольдибекова Юлия Вячеславовна – кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, заведующий лабораторией метаболизма и фармакокинетики отдела биохимических и цитогенетических методов диагностики (e-mail: ; тел: 8 (342) 237-18-15; ORCID: .

Пескова Екатерина Владимировна - младший научный сотрудник лаборатории биохимической и наносенсор-ной диагностики отдела биохимических и цитогенетических методов диагностики (e-mail: ; тел: 8 (342) 237-18-15; ORCID: .

Булатова Наталья Ивановна – научный сотрудник лаборатории биохимической и наносенсорной диагностики (e-mail: ; тел: 8 (342) 236-80-18; ORCID: .

Степанков Марк Сергеевич – младший научный сотрудник лаборатории биохимической и наносенсорной диагностики (e-mail: ; тел: 8 (342) 237-18-15; ORCID: .

Высокоактуальным направлением фундаментальных и прикладных научных исследований является изучение изменений гомеостатического равновесия организма, формирующихся на самых ранних этапах их развития, в первую очередь на клеточномолекулярном уровне [1]. Применение технологии протеомного анализа позволяет расширить теоретические представления о клеточно-молекулярных механизмах развития негативных эффектов, тем самым повысить предиктивный потенциал диагностики ряда заболеваний неинфекционного генеза. Поиск информативных молекулярных маркеров является одним из приоритетных направлений фундаментальных научных исследований в Российской Федерации1. Новые знания в области модификации этиопатогенеза заболеваний, связанных с воздействием риск-индуцированных факторов, являются научной основой установления условий, причин, механизмов возникновения, предупреждения и снижения риска и вреда здоровью человека [2].

Процесс модификации механизма развития негативных эффектов может быть связан с взаимодействием химических факторов риска с генами, модулирующими экспрессию определенных белков, которые обеспечивают функциональную активность молекулярно-биологических процессов [3]. На фоне сохраняющегося модифицирующего действия химических факторов происходит молекулярноклеточная трансформация гомеостаза, обусловливающая формирование негативных эффектов, тем самым повышая риск развития заболевания2. Анализ генов, кодирующих белки, на которые оказывают влияние химические факторы, даёт представление о биологических функциях и молекулярных сетях, изменяющихся в ответ на химическое воздействие. Изучение таких генно-химических взаимодействий является мощным информационным ресурсом для получения и развития знаний об этиологии и моле- кулярных механизмах, лежащих в основе модификации процессов, ассоциированных с воздействием химических факторов риска [4, 5].

Поскольку белки играют ключевую роль в обеспечении жизнедеятельности клеток и организма в целом, качественные и количественные изменения белкового состава, регистрируемые в текущий момент исследования, могут быть потенциально информативными для самого раннего выявления негативных эффектов, обусловливающих дальнейшее формирование существенных функциональных расстройств критических органов и систем.

Таким образом, в настоящее время наиболее перспективна тематика научных исследований, касающихся поиска протеомных маркеров и их комбинаций – потенциальных молекулярных мишеней, отражающих состояние и функциональные характеристики этиопатогенетически мотивированных механизмов в ответ на воздействие химических факторов риска. Выявление при этом генно-химических взаимодействий между экспрессией белкового маркера и фактором экспозиции позволяет прогнозировать негативные исходы со стороны здоровья, что явилось основанием для определения цели настоящего исследования. Данная работа является продолжением цикла исследований, выполненных в ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», посвященных применению «омиксных технологий» для обоснования информативных молекулярно-клеточных маркеров негативных эффектов [6, 7].

Цель исследования – выявление у детей прогностически значимых маркеров трансформированного профиля плазмы крови, доказанно связанных с аэрогенной комбинированной экспозицией металлоксидных соединений (на примере оксидов меди и никеля).

Материалы и методы. Выявление и обоснование молекулярных белковых маркеров, изменение которых ассоциировано с аэрогенной экспозицией оксидов меди и никеля, выполнено с применением предложенного инновационно-методического подхода, включающего следующие этапы:

– подтверждение факта аэрогенной экспозиции на основе определения параметров показателей в системе «концентрация вещества в атмосферном воздухе – концентрация вещества в биосреде»;

– сравнительный анализ статистически различающихся по интенсивности белковых пятен на основе протеомного профилирования плазмы крови и идентификации выделенных белков;

– выявление белков и пептидов, тождественных в результате экспериментальных и натурных исследований при комбинированном воздействии химических веществ;

– количественная оценка параметров причинно-следственных связей между тождественными белками и пептидами и концентрацией химических веществ в биосреде;

– прогнозирование негативных эффектов на основе построения и анализа биоинформационной молекулярной матрицы тождественных белков с выявлением их функций, биологических процессов и экспрессии в тканях.

Реализация предложенного алгоритма выполнена на примере сопоставления измененных белков и пептидов, полученных в протеомном профиле плазмы крови детей, подверженных реальной аэрогенной комбинированной экспозицией оксидами никеля и меди, и мелких грызунов (биологическая модель) при экспериментальной комбинированной и изолированной экспозиции, эквивалентной реальному уровню изучаемых веществ.

Экспериментальные исследования проведены на самках крыс линии Wistar. Особи в количестве 24 были разделены на четыре группы по шесть крыс в каждой: опытная группа № 1 – животные, подверженные изолированному действию стандартного образца никеля в дозе 0,38 мг/кг; опытная группа № 2 – животные, подверженные изолированному действию меди в дозе 1,23 мг/кг; опытная группа № 3 – животные, подверженные комбинированному действию смеси никеля и меди в дозах, указанных выше; группа контроля № 4 – контрольные живот- ные, содержавшиеся в аналогичных условиях, но не подверженные воздействию изучаемых химических веществ. Дозы химических веществ, вводимые экспериментальным животным, эквивалентны установленной реальной аэрогенной экспозиции при хроническом воздействии с учетом массы тела животных и видовых особенностей. Отбор крови у крыс осуществляли через 24 ч после воздействия из подъязычной вены в объеме 3 см3.

Экспериментальные исследования выполнены с соблюдением требований Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных или иных научных целях (ETS № 123)3, и комитета по этике ФБУН «ФНЦ медикопрофилактических технологий управления рисками здоровью населения».

Протеомное профилирование плазмы крови выполнено 45 детям в возрасте 4–7 лет, в том числе 25 подвергающихся длительной аэрогенной комбинированной экспозиции оксидами никеля (на уровне 0,0034 мг/(кг ⋅ день)) и меди (на уровне 0,0016 мг/ (кг ⋅ день)) – группа наблюдения, и не подвергающихся воздействию изучаемых химических веществ – группа сравнения (20 человек). Критерием формирования выборок детей группы наблюдения является повышенное ( ≥ 1,2 Rfl ) содержание меди и никеля в крови, детей группы сравнения - содержание изучаемых химических веществ соответствует минимальным или референтным значениям в крови (никель Rfl = 0,01 мг/дм³, медь Rfl = 0,9 мг/дм³)⁴.

Обследование детей проведено в соответствии с этическими принципами Хельсинкской декларации (64th WMA General Assembly, 20135) при обязательном наличии добровольно информированного согласия законного представителя и соблюдении требований комитета по этике ФБУН «ФНЦ медикопрофилактических технологий управления рисками здоровью населения» (протокол № 1 от 04.02.2021).

Анализ крови на содержание меди и никеля выполнен в соответствии с МУК 4.1.3230-146 на масс-спектрометре Agilent 7500cx (Agilent Technologies, США).

Исследование протеомного профиля плазмы крови включал отбор образцов, двумерный электрофорез в полиакриламидном геле7, анализ двумерной электрофореграммы, выделение значимых белковых пятен по их интенсивности, масс-спектрометрический анализ на хроматографе UltiMate 3000 (Германия) и тандемном масс-спектрометре ABSciex 4000 QTRAP с источником ионизации Nanospray 3 (Канада). Идентификацию белков проводили по базе данных UniProt8 с выборкой по таксону Homo Sapience и Rattus norvegicus. Определение гена, кодирующего идентифицированный белок, выполнено с помощью базы данных HUGO Gene Nomenclature Committee database (HGNC)9 и The Rat Genome Database (RGD)10. Описание биологических функций белков выполнено с помощью ресурса The Gene Ontology11, сбор информации о филогенетике и функциональной геномике – PhyloGenes12, получение данные об экспрессии белков в тканях организма – Tissue expression database13 и The Human Protein Atlas14. Информацию и анализ о возможных этиопатогенетических механизмах развития прогнозируемых негативных эффектов, ассоциированных с воздействием химических факторов, осуществляли на исследовательских платформах Comparative Toxicogeno-mics15 и DisGeNET16.

Оценку полученных значений показателей у экспонированных детей выполняли относительно неэкспонированных; у экспериментальных животных опытных групп - относительно показателей в группе контроля. Описательная статистика количественных переменных представлена в виде среднего значения ( M ), ошибки среднего ( m ). Статистическую значимость различий переменных между группами определяли по критерию Манна – Уитни ( U ≤ U кр ) при заданном уровне значимости p ≤ 0,05. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета программ Statistica 10.

Обоснование молекулярных маркеров негативных эффектов выполнено на основании полученных моделей зависимостей «химические вещества в крови – статистически значимая интенсивность белкового пятна», описываемых уравнением множественной линейной регрессии по формуле:

• У, = b Oj+^L b ij x i ,

где y j – зависимая переменная (показатель интенсивности j -го белкового пятна, int);

x i – независимая переменная, i -й влияющий фактор (концентрация вещества в крови, мг/дм³);

b₀ j , b_i j – коэффициенты модели.

Достоверность и адекватность моделей оценивали с помощью дисперсионного анализа с использованием F -критерия Фишера, коэффициента детерминации ( R² ), t -критерия Стьюдента при статистической значимости p ≤ 0,05.

Результаты и их обсуждение. Сравнительный анализ содержания меди и никеля в крови экспериментальных животных позволил установить достоверные статистические различия концентраций изучаемых веществ. При изолированной экспозиции никелем его концентрация в крови составила 0,014 ± 0,002 мг/дм³, при комбинированной смесью веществ – 0,008 ± 0,001 мг/дм³, что выше в 2,9 и в 1,7 раза соответственно относительно контрольных значений ( р = 0,001–0,012). Уровень меди в крови при изолированной экспозиции составил 2,323 ± 0,060 мг/дм³, при комбинированном смесью веществ – 2,006 ± 0,047 мг/дм³, что превысило в 1,5 и в 1,3 раза соответственно содержание вещества в контрольной группе ( р = 0,0001–0,002). Содержание меди и никеля в крови при изолированной экспозиции соответственно в 1,2 и в 1,8 раза выше, чем при комбинированной ( р = 0,002–0,022).

Реальная аэрогенная комбинированная экспозиция одновременно оксидами меди и никеля обусловливает в крови экспонированных детей повышенные в 1,2–2,4 раза концентрации изучаемых веществ относительно неэкспонированных ( р = 0,032–0,033) и повышенные в 1,2–1,3 раза уровни относительно референтных значений. На основании установленной и параметризированной связи концентрации меди и никеля в крови с концентрацией данных металлов в атмосферном воздухе (медь a 0 = 0,515, a ₁ = 752,32; никель a ₀ = 0,005, a ₁ = 145,36, р = 0,05) медь и никель в крови обоснованы в качестве маркеров аэрогенной экспозиции.

Сравнительная оценка результатов денситометрии протеомного профиля плазмы крови крыс с изолированным воздействием меди и никеля позволила выявить восемь белков, аналогичных белкам, выделенным при комбинированном воздействии смеси указанных веществ (табл.1).

Таблица 1

Статистически значимые белки, доказано связанные с факторами экспериментальной комбинированной экспозиции

№ п/п	Статистически значимые белки			Достоверность модели зависимости «вещество – интенсивность значимого белкового пятна при комбинированном воздействии» ( р ≤ 0,05)
	Изолированная экспозиция		Комбинированная экспозиция
	медь	никель	медь + никель
1	Компонент белка теломеразы 1	-	Компонент белка теломеразы 1	0,002
2	Цитоскелетный кератин II типа 75	-	Цитоскелетный кератин II типа 75	0,0001
3	Пероксисомальная , 2 , 4-диеноил-КоА-редуктаза	-	Пероксисомальная , 2 , 4-диеноил-КоА-редуктаза	0,002
4	Адвиллин	-	Адвиллин	0,019
5	Цитозольная альдегиддегидрогеназа 1	-	Цитозольная альдегиддегидрогеназа 1	0,008
6	-	Фактор удлинения 1-γ	Фактор удлинения 1-γ	0,001
7	-	Белок-носитель стирола 2	Белок-носитель стирола 2	0,002
8	-	Миозин-6	Миозин-6	0,002
9	-	Кальций-связываю-щий белок 7	Кальций-связывающий белок 7	0,002
10	-	Белок переноса везикул SEC22В	Белок переноса везикул SEC22В	0,001
Статистически значимые белки, выявленные одновременно в эксперименте при изолированной и комбинированной экспозиции
11	Гемоглобин субъединица β-2			0,001
12	Гликогенсинтаза, мышечная			0,001
13	CAP - GLY домен содержащий линкерный белок 4			0,002
14	Белок переноса везикул SEC22A			0,001
15	Белок SDA1 гомолог			0,003
16	Активатор транскрипции BRG1			0,001
17	Каппа-цепь C области Ig, аллель			0,001
18	APOBEC1 комплементарный фактор			0,006

На основе денситометрического исследования и сопоставления белков в протеомном профиле плазмы крови экспонированных и неэкспонированных детей идентифицировано 20 достоверно различающихся пятен по их интенсивности и доказано связанных с повышенным содержанием меди и никеля в крови (табл. 2).

Сравнительный биоинформационный анализ филогенетики выявленных белков и кодирующих их экспрессию генов при экспериментальной и реальной комбинированной экспозиции позволил установить один тождественный белок - фактор комплементации APOBEC1 и ортологичный кодирующий его ген у человека - A1CF. Спектр пептида тождественного белка представлен на рисунке.

APOBEC1 комплементарный фактор представляет собой существенный компонент ферментного комплекса, редактирующего мРНК аполипопротеина В (ApoB), необходимого для сборки липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) из липидов. У грызунов (Rattus norvegicus) комплементарный фактор APOBEC1 широко распространен в тканях печени [8], почек [9], кишечника [10], щитовидной железы и нервной системы [11]. У человека данный фактор экспрессируется исключительно в эпителиальных клетках желудочно-кишечного тракта, в тонком кишечнике [12, 13]. Результаты ряда экспериментальных исследований показали, что сверхэкспрессия APOBEC-1 в печени эффективно снижает уровни ApoB, регулируя метаболизм холестерина [14]. Низкая экспрессия гена A1CF у человека является одной из причин, по которой высокое потребление жиров является потенциально опасным для здоровья. В процессе всасывания экзогенных липидов уровень ApoB увеличивается, вызывая повышенный синтез липопротеина низкой плотности [15], что может привести к атеросклеротическим изменениям сосудов [14, 16].

Выявлена и оценена многофакторная зависимость ( R² = 0,19; b 0 = 3581,2; b 1 = -384,5; b 2 = -11137,7; р = 0,017) снижения интенсивности белка APOBEC-1 комплементарного фактора в плазме крови при повышенном содержании одновременно никеля и меди в крови, являющихся маркерами экспозиции. Полученная зависимость согласуется с результатами научных исследований по генно-химическим взаимодействиям данного белка и изучаемых химических веществ. Показано, что экспозиция меди и никеля

Таблица 2

Параметры многофакторной модели зависимости изменения интенсивности белкового пятна в плазме крови от содержания одновременно никеля и меди в крови обследованных детей

№ п/п	Наименование белка в пятне	Направление изменения интенсивности белкового пятна	Параметры модели «маркер экспозиции (никель и меди в крови) – протеомный маркер (интенсивность белкового пятна)»				Достоверность различий ( р ≤ 0,05)
			b 0	медь ( b 1 )	никель ( b 2)	коэффициент детерминации ( R 2)
1	Обменник натрий/водорода 2	Снижение	5291,9	-1458	-54723	0,24	0,013
2	Протеин 33, содержащий спиральную катушку	Снижение	5245,2	-1202,9	-63777,4	0,21	0,025
3	Миотубулярин	Снижение	1803	-1065,8	-39425,8	0,23	0,016
4	Фактор коагуляции V	Снижение	439,2	-270,6	-7449,8	0,19	0,032
5	Орнитин декарбоксилазный антизим 2	Снижение	1112,9	-616,7	-28418,7	0,25	0,011
6	RING пальцевый протеин неопрятный гомолог	Снижение	2656,4	-821,9	-39891,8	0,19	0,031
7	Витронектин	Снижение	3092,7	-1860,8	-40674,4	0,16	0,059
8	Центросомный белок 290 кДа	Снижение	2242,6	-830,3	-49443,7	0,30	0,003
9	Цинковый белковый протеин 221	Снижение	2989,8	-1496,5	-49250,8	0,24	0,013
10	Аполипопротеин A-I	Снижение	936,8	-660,6	1007,4	0,19	0,032
11	ADAM-подобный, decysin 1	Снижение	3739,1	-1020,1	-62371,9	0,25	0,010
12	Ядерный белок MDM1	Повышение	1596,3	935,8	38990	0,17	0,048
13	Фактор комплементации APOBEC1	Снижение	3581,2	-384,5	-11137,7	0,13	0,017
14	DNAJ гомолог подсемейства C участник 3	Повышение	2231,2	1747,2	63004,9	0,24	0,013
15	WD повторный белок 64	Повышение	1014,9	768,6	44043,7	0,22	0,019
16	Зависимая от напряжения субъединица кальциевых каналов L-типа бета-4	Снижение	1391,3	-861,5	-22471,4	0,25	0,010
17	Богатые лейцином повторы и домены, подобные иммуноглобулинам, белок 3	Снижение	2531,7	-1032,3	-40311,9	0,19	0,033
18	Протеин-глутамин-гамма-глутамилтрансфераза E	Повышение	394,6	-35,5	32116,8	0,19	0,032
19	Пироглутамилпептидаза 1-подобный белок	Повышение	1657,4	666,3	39792,4	0,17	0,048
20	Тяжелая цепь клатрина 2	Снижение	2605,8	-1031,1	-95362,5	0,36	0,001

Рис. Спектр пептида SGPGLSGTQK (Комплементарный фактор APOBEC-1) (база данных SwissProt) плазмы крови ребенка приводит к снижению экспрессии гена A1CF. Это свидетельствует об их модифицирующем влиянии на молекулярные функции и биологические процессы данного белка [17]. Результаты экспериментальных исследований показали, что экспозиция никелем обусловливает повышение уровней триглицеридов и ЛПНП в сыворотке крови, что может негативно сказаться на обмене липидов в целом [18]. Аэрогенная экспозиция меди может привести к увеличению выработки активных форм кислорода и окислительному стрессу. Следствием чего является окислительная модификация ЛПНП, индуцирующая локальный иммунный ответ в стенке кровеносного сосуда с дальнейшим развитием атеросклеротических изменений – одного из факторов риска возникновения сердечно-сосудистых заболеваний [19–21].

Выводы. В результате выполненных исследований установлено, что длительная аэрогенная комбинированная экспозиция одновременно оксидами меди и никеля обусловливает в крови экспонированных детей повышенные (относительно показателей у неэкспонированных и референтных уровней) в 1,2–2,4 раза концентрации никеля и меди, обоснованные в качестве маркеров экспозиции. Результаты натурных исследований верифицированы повышенным в 1,7–2,9 раза содержанием аналогичных веществ в крови (относительно контроля) при экспериментальном моделировании эквивалентной комбинированной экспозиции на биологической модели (мелкие грызуны). Обоснован протеомный маркер APOBEC1 комплементарный фактор (ген А1CF), тождественный при экспериментальной и натурной экспозиции, доказанно связанный с маркерами экспозиции (одновременно с содержанием никеля и меди в крови). Снижение экспрессии данного белка в условиях сохраняющейся аэрогенной экспозиции оксидами никеля и меди позволяет прогнозировать развитие негативного эффекта в виде модификации липопротеинов низкой плотности с дальнейшей индукцией атеросклеротических изменений сосудов, что является одним из факторов риска сердечнососудистых заболеваний.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.