Машинная перфузия печени с умеренным макростеатозом: эффективность HOPE с контролируемым согреванием

Трансплантация печени остаётся единственным радикальным методом лечения терминальных заболеваний печени и представляет одно из наиболее значимых достижений современной медицины. Однако острый дефицит донорских органов представляет серьёзную проблему, с которой сталкиваются трансплантационные центры по всему миру. Согласно данным международных регистров, на один доступный донорский орган приходится в среднем 3–4 реципиента, находящихся в листе ожидания, при этом ежегодная смертность пациентов в листе ожидания составляет 15–20%. Эта критическая диспропорция между потребностью в донорских органах и их доступностью приводит к тому, что значительная часть пациентов умирает, не дождавшись трансплантации, что заставляет трансплантационные центры пересматривать традиционные критерии приемлемости донорских органов.

В последние два десятилетия всё большее внимание уделяется использованию печеней с расширенными критериями донора, среди которых особое место занимают органы с макростеатозом. Печёночный стеатоз представляет собой патологическое накопление триглицеридов в гепатоцитах, что приводит к нарушению нормальной архитектуры печёночной дольки и функции органа. Эпидемиологические данные свидетельствуют о том, что распространённость стеатоза среди потенциальных доноров органов неуклонно возрастает параллельно с ростом ожирения и метаболического синдрома в популяции. Умеренный макростеатоз, определяемый как поражение 30–50% гепатоцитов крупнокапельными жировыми включениями, встречается у 20–30% потенциальных доноров, что представляет значительный резерв для расширения донорского пула.

Однако использование стеатозных печеней сопряжено с существенными клиническими рисками.

Печени с макростеатозом характеризуются значительно повышенной чувствительностью к ишеми-чески-реперфузионному повреждению по сравнению с нормальными органами. Механизмы этой повышенной уязвимости многофакторны и включают нарушение микроциркуляции из-за сдавления синусоидов увеличенными гепатоцитами, митохондриальную дисфункцию, повышенную восприимчивость к окислительному стрессу и нарушения энергетического метаболизма. Клинические последствия этих патофизиологических изменений проявляются в виде увеличения частоты первичной дисфункции трансплантата до 40–50%, ишемических холангиопатий до 30–35%, а также повышения риска ранней потери трансплантата. Эти осложнения не только ухудшают краткосрочные и долгосрочные результаты трансплантации, но и существенно увеличивают экономические затраты системы здравоохранения.

Традиционная консервация печени в холодном консервирующем растворе при температуре 4 °C, хотя и остаётся стандартом для большинства трансплантационных центров, демонстрирует ограниченную эффективность для стеатозных органов. Статические методы консервации не обеспечивают достаточной защиты от метаболических нарушений, характерных для печеней с накопленными липидами. Это послужило стимулом для развития альтернативных методов консервации, среди которых особое место занимает машинная перфузия печени.

Машинная перфузия печени представляет технологию динамической консервации, при которой донорский орган подключается к специализированной перфузионной системе, обеспечивающей постоянную циркуляцию оксигенированного перфузионного раствора через сосудистое русло печени. Эта технология позволяет поддерживать минимальный метаболизм органа, обеспечивать доставку кислорода и питательных веществ, а также удалять токсические метаболиты, накапливающиеся в процессе ишемии. Среди различных протоколов машинной перфузии наибольшее клиническое признание получила гипотермическая оксигенированная перфузия (HOPE), при которой орган перфузируется оксигенированным раствором при температуре 8–12 °C.

Результаты крупных клинических исследований последних лет убедительно продемонстрировали преимущества HOPE для печеней с расширенными критериями донора. Landmark исследование Dutkowski и соавт., включившее 221 печень, показало снижение частоты ишемических холангиопа-тий с 30% в контрольной группе до 6% в группе HOPE. Аналогичные результаты были получены в исследованиях van Rijn и соавт. и Patrono и соавт., которые подтвердили эффективность HOPE в снижении осложнений и улучшении функции трансплантата. Однако важно отметить, что большинство этих исследований были сфокусированы преимущественно на печенях пожилых доноров или органах с длительной холодовой ишемией, тогда как специфические протоколы для стеатозных печеней остаются недостаточно изученными.

Концепция контролируемого согревания во время перфузии основана на патофизиологической гипотезе о том, что постепенное повышение температуры в заключительной фазе консервации может активировать восстановительные клеточные процессы, подготавливая орган к последующей нормотермической реперфузии in vivo. Теоретическое обоснование этого подхода включает несколько ключевых аспектов. Во-первых, градуальная активация ферментных систем позволяет избежать резких метаболических сдвигов, характерных для традиционной реперфузии, когда температура органа повышается от 4 °C до 37 °C в течение нескольких минут. Во-вторых, умеренное повышение температуры может стимулировать антиоксидантные системы клетки, включая глутатионпероксидазу, каталазу и супероксиддисмутазу, повышая её устойчивость к последующему окислительному стрессу. В-третьих, активация митохондриального метаболизма во время согревания может способствовать восстановлению энергетических запасов клетки и улучшению функции дыхательной цепи.

Для стеатозных печеней контролируемое согревание может иметь дополнительные специфические преимущества, связанные с активацией липидного метаболизма. Известно, что при гипотермии β -окисление жирных кислот практически полностью подавляется из-за температурной инактивации ключевых ферментов этого метаболического пути. Это может приводить к дальнейшему накоплению липидов в гепатоцитах и усугублению метаболической дисфункции. Постепенное согревание теоретически должно способствовать восстановлению β -окисления жирных кислот, обеспечивая утилизацию избыточных липидов и генерацию дополнительной энергии в виде АТФ, что может быть критически важно для выживаемости стеатозных гепатоцитов в условиях ишемии-реперфузии.

Молекулярные механизмы, лежащие в основе повышенной уязвимости стеатозных печеней к ишемически-реперфузионному повреждению, в последние годы стали предметом интенсивных исследований. Особое внимание привлекает ферроптоз – недавно открытый тип регулируемой клеточной гибели, характеризующийся железо-зависимой липидной пероксидацией. Печени с макростеатозом содержат повышенные количества полиненасы-щенных жирных кислот, которые служат субстратом для липидной пероксидации, что делает их особенно восприимчивыми к ферроптозу. Кроме того, митохондриальная дисфункция, характерная для стеа-тозных печеней, может способствовать активации других путей программированной клеточной гибели, включая апоптоз и некроптоз.

Несмотря на теоретическую привлекательность и предварительные положительные результаты, систематических исследований эффективности HOPE с контролируемым согреванием специально для печеней с макростеатозом до настоящего времени не проводилось. Большинство существующих исследований машинной перфузии либо исключали стеа-тозные печени из анализа, либо включали их в небольших количествах без отдельного анализа результатов. Это создаёт существенный пробел в наших знаниях об оптимальных методах консервации для этой важной категории донорских органов.

Настоящее исследование представляет первую систематическую оценку эффективности гипотермической оксигенированной перфузии с контролируемым согреванием специально для печеней с умеренным макростеатозом. Комплексный подход, включающий анализ биохимических маркеров клеточного повреждения на молекулярном уровне, гистологические исследования и всестороннюю оценку клинических исходов, должен предоставить научно обоснованную информацию об эффективности данной технологии и ее потенциальной роли в расширении пула донорских органов.

Цель исследования

Целью настоящего исследования является оценка эффективности машинной перфузии в режиме гипотермической оксигенированной перфузии (HOPE) с контролируемым кислородным согреванием в снижении ишемически-реперфузионного повреждения донорской печени человека с умеренным макростеатозом путём комплексного анализа механизмов регулируемой клеточной гибели.

Задачи исследования

• 1.    Разработать и оптимизировать протокол машинной перфузии донорской печени с макростеатозом 30–50% в режиме гипотермической оксигенированной перфузии (HOPE) с контролируемым кислородным согреванием, включая валидацию экспериментальной модели ишемически-реперфузионного повреждения, определение оптимальных параметров температурного режима (градиент повышения температуры от 10 °C до 20 °C), скорости портального и артериального потока, парциального давления кислорода (60–80 кПа),

• 2.    Провести комплексный анализ механизмов регулируемой клеточной гибели при ишемически-реперфузионном повреждении печени с умеренным стеатозом, включающий оценку маркеров окислительного стресса (продукты липидной пероксидации – MDA; состояние системы глутатиона – GSH/GSSG), апоптоза (активность каспаз-3, -7, -8, -9; высвобождение цитохрома с; морфологические признаки апоптоза) на различных этапах экспериментального протокола.

• 3.    Исследовать функциональное состояние митохондрий и параметры окислительного стресса в ткани печени с макростеатозом при различных режимах перфузии, включая оценку продукции АТФ, активности антиоксидантных ферментов (SOD, каталаза), общей антиоксидантной емкости, продукции активных форм кислорода.

• 4.    Оценить влияние различных режимов машинной перфузии на воспалительный ответ путём определения провоспалительных цитокинов (IL-1 β , IL-6, TNF- α ) в перфузате и ткани печени, а также провести сравнительный анализ эффективности стандартного холодового хранения, HOPE и HOPE с контролируемым согреванием в минимизации ишемически-реперфузионного повреждения и определить корреляцию между биохимическими маркерами повреждения и посттрансплантационными результатами.

длительности перфузии и состава перфузионного раствора с использованием модифицированной системы аферетика.

Материалы и методы

Исследование проводилось на базе центра трансплантации печени НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского с использованием донорских печеней человека (n=24), предназначенных для трансплантации. Часть лабораторных исследований выполнена на мощностях Медицинского университета «Реавиз». В исследование включались органы от доноров в возрасте 18–65 лет, у которых при экстренном гистологическом исследовании биоптата, взятого непосредственно после изъятия органа, выявлялся макростеатоз степени 30–50%. Экстренное гистологическое исследование проводилось на замороженных срезах с окраской Oil Red O, с количественной оценкой процента гепатоцитов, содержащих крупнокапельные жировые включения. Все процедуры выполнялись в соответствии с этическими принципами Хельсинкской декларации после получения одобрения локального этического комитета и информированного согласия реципиентов. Для стандартизации условий ишемического прекондиционирования всем донорам выполнялся маневр Прингла (пережатие пече- ночно-двенадцатиперстной связки) длительностью 10 минут с последующей 10-минутной реперфузией непосредственно перед началом холодовой перфузии и изъятием органа. Данная процедура проводилась в рамках стандартного протокола кондиционирования органов и позволяла активировать эндогенные защитные механизмы против последующего ишемически-реперфузионного повреждения. Экспериментальный протокол включал следующие этапы: после ишемического прекондиционирования, стандартной процедуры изъятия и консервации раствором HTK органы транспортировались в операционную в условиях холодовой ишемии при 4 °C. По прибытии, после взятия биоптата для экстренной гистологии и подтверждения степени стеатоза 30–50%, проводился дополнительный забор ткани печени для определения исходного уровня исследуемых параметров. Далее органы рандомизировались в три группы: контрольная группа подвергалась стандартному холодовому хранению с последующей трансплантацией (n=8), группа HOPE получала гипотермическую оксигенированную перфузию при 10 °C перед трансплантацией (n=8), и группа HOPE с контролируемым согреванием, где температура постепенно повышалась от 10 °C до 20 °C в течение последнего часа перфузии перед трансплантацией (n=8). Машинная перфузия осуществлялась с использованием модифицированной системы аферетика, адаптированной для перфузии печени. Перфузионный раствор на основе Belzer MPS был обогащён кислородом до достижения парциального давления 60–80 кПа. Параметры перфузии включали: портальный поток 0,25–0,35 мл/мин/г ткани печени, артериальное давление 18–25 мм рт. ст., общая длительность перфузии составляла 4 часа. В группе с контролируемым согреванием температура повышалась со скоростью 0,17 °C/мин в течение последнего часа. Во время перфузии проводился непрерывный мониторинг pH, лактата, глюкозы в перфузате, а также сопротивления сосудистого русла. Забор образцов ткани печени проводился в следующие временные точки: T0 – исходный уровень после изъятия и подтверждения степени стеатоза, T1 – после периода холодовой ишемии перед началом перфузии или продолжением хранения, T2 – через 2 часа перфузии (для перфузионных групп), T3 – по окончании 4-часовой перфузии непосредственно перед трансплантацией. Дополнительные биоптаты забирались интраоперационно через 2 часа после реперфузии (T4) с согласия реципиента. Биоптаты немедленно замораживались в жидком азоте для последующего биохимического анализа или фиксировались в 10% нейтральном формалине для гистологического ис- следования. После завершения экспериментального протокола все органы были успешно трансплантированы реципиентам согласно листу ожидания. Послеоперационное наблюдение включало стандартный мониторинг функции трансплантата с оценкой уровня трансаминаз, билирубина, МНО, а также допплерографический контроль кровотока. Оценка окислительного стресса включала определение уровня малонового диальдегида спектрофотометрическим методом с тиобарбитуровой кислотой, определение соотношения восстановленного и окисленного глутатиона флуориметрическим методом. Для оценки апоптоза активность каспаз-3, -7, -8 и -9 измерялась флуориметрически с использованием специфических субстратов. Высвобождение цитохрома с из митохондрий оценивалось в цитозольной фракции после дифференциального центрифугирования. Морфологические признаки апоптоза оценивались при световой микроскопии с подсчетом клеток с признаками кариопикноза и цитоплазматической вакуолизации. Функция митохондрий оценивалась на свежевыделенных митохондриях, полученных методом дифференциального центрифугирования. Продукция АТФ определялась люминесцентным методом. Дыхательная функция митохондрий оценивалась спектрофотометрически по потреблению кислорода с субстратами комплексов I и IV дыхательной цепи. Окислительный стресс характеризовался измерением активности супероксиддисмутазы методом ингибирования автоокисления адреналина, каталазы – по скорости разложения перекиси водорода, общей антиоксидантной ёмкости – методом FRAP. Продукция активных форм кислорода оценивалась флуориметрическим методом с использованием дихлорфлуоресцеина. Воспалительный ответ оценивался путём определения концентрации IL-1β, IL-6 и TNF-α в перфузате и гомогенатах ткани методом ELISA. Статистический анализ проводился с использованием программной среды R версии 4.3.0. Нормальность распределения проверялась тестом Шапиро – Уилка. Для сравнения трёх групп использовался однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOVA) с последующим post-hoc анализом Тьюки для множественных сравнений при нормальном распределении данных, или тест Краскела – Уоллиса с последующим тестом Данна при отклонении от нормального распределения. Динамика изменений во времени анализировалась с помощью линейных смешанных моделей с учётом повторных измерений. Корреляционный анализ между степенью стеатоза и маркерами клеточного повреждения проводился с использованием коэффициента корреляции Пирсона или Спирмена в зависимости от характера распределения.

Для оценки влияния перфузионной стратегии на посттрансплантационные результаты использовалась регрессионная модель пропорциональных рисков Кокса. Множественная коррекция проводилась методом Бенджамини – Хохберга для контроля ложноположительных результатов. Различия считались статистически значимыми при скорректированном p<0,05. Все данные представлены как среднее±стандартная ошибка среднего или медиана с интерквартильным размахом в зависимости от характера распределения.

Результаты

Характеристики доноров и исходные параметры

В исследование были включены 24 донорские печени от доноров в возрасте от 28 до 63 лет (средний возраст 51,4±7,8 года). Демографические и клинические характеристики доноров представлены в таблице 1. Группы не различались по возрасту, полу, ИМТ, причине смерти мозга и времени поддержания на ИВЛ (все p>0,05). Степень макростеатоза, определённая при экстренном гистологическом исследовании, составила в среднем 37,8±5,2% и была сопоставима между группами: контроль – 38,2±4,9%, HOPE – 36,8±5,1%, HOPE+W – 38,4±5,8% (p=0,742, ANOVA).

Время холодовой ишемии от момента изъятия до начала перфузии или трансплантации составило 6,2±1,0 часа и не различалось между группами (p=0,892). Все органы соответствовали критериям Eurotransplant для печеней с расширенными критериями донора. Важно отметить, что исходные биохимические показатели доноров на момент забора органов также были сопоставимы: АЛТ 42±12 vs 39±14 vs 41±11 Ед/л, АСТ 56±18 vs 52±16 vs 58±19 Ед/л, общий билирубин 18±6 vs 16±5 vs 17±7 мкмоль/л (все p>0,05).

Параметры перфузии и гемодинамика

Во время проведения машинной перфузии все заданные параметры поддерживались в целевых диапазонах. Портальный поток составил 0,29±0,03 мл/мин/г в группе HOPE и 0,31±0,04 мл/мин/г в группе HOPE+W (p=0,234). Артериальное давление поддерживалось на уровне 21,4±2,1 мм рт. ст. в обеих перфузионных группах. Парциальное давление кислорода в перфузате стабильно находилось в диапазоне 72±8 кПа.

Особый интерес представляла динамика сосудистого сопротивления во время перфузии. В группе HOPE сопротивление портального русла снижалось с 0,42±0,08 до 0,36±0,06 мм рт.ст./(мл/мин) к концу перфузии (p=0,018). В группе HOPE+W наблюдалось более выраженное снижение: с 0,41±0,07 до 0,28±0,05 мм рт.ст./(мл/мин) (p=0,003), что указы- вает на лучшую микроциркуляцию при контролируемом согревании.

Биохимические показатели перфузата также демонстрировали различия между группами. К концу перфузии уровень лактата в группе HOPE составил 2,8±0,4 ммоль/л, тогда как в группе HOPE+W – 1,9±0,3 ммоль/л (p=0,012), что свидетельствует о лучшем метаболическом состоянии органа при согревании.

Маркеры окислительного стресса

Анализ маркеров окислительного стресса выявил выраженные различия между исследуемыми группами на всех этапах эксперимента. Результаты представлены в таблице 2.

Содержание малонового диальдегида (MDA), основного продукта липидной пероксидации, прогрессивно увеличивалось во всех группах от исходного уровня к моменту реперфузии. Однако темпы этого увеличения существенно различались. В контрольной группе отмечен трехкратный рост MDA к концу эксперимента (с 1,8±0,2 до 5,9±0,8 нмоль/мг белка, p<0,001). В группе HOPE увеличение было менее выраженным (до 4,1±0,5 нмоль/мг, p=0,023 vs контроль). Наиболее благоприятная динамика наблюдалась в группе HOPE+W, где уровень MDA к моменту T4 составил лишь 2,8±0,4 нмоль/мг белка (p<0,001 vs контроль, p=0,008 vs HOPE).

Таблица 1. Характеристики доноров и органов Table 1. Characteristics of donors and organs

Параметр	Контроль (n=8)	HOPE (n=8)	HOPE+W (n=8)	p-value
Возраст, лет	52,1±8,2	50,3±7,6	51,8±8,1	0,823
Пол (М/Ж)	5/3	4/4	5/3	0,889
ИМТ, кг/м²	28,4±3,1	27,9±2,8	28,7±3,3	0,734
Стеатоз, %	38,2±4,9	36,8±5,1	38,4±5,8	0,742
Время ХИ, ч	6,3±1,2	6,1±0,9	6,2±1,1	0,892
Время ИВЛ, сут.	3,8±1,4	4,1±1,6	3,6±1,2	0,678

Примечание: ХИ – холодовая ишемия; ИВЛ – искусственная вентиляция лёгких.

Таблица 2. Маркеры окислительного стресса в различные временные точки

Table 2. Oxidative stress markers at different time points

Параметр	Группа	T0 (исходно)	T1 (после ХИ)	T3 (конец перфузии)	T4 (2 ч реперфузии)
MDA, нмоль/мг	Контроль	1,8±0,2	3,2±0,4	4,8±0,6 ᵃ	5,9±0,8 ᵃ
	HOPE	1,7±0,2	3,1±0,3	3,2±0,4 ᵇ	4,1±0,5 ᵇ
	HOPE+W	1,8±0,2	3,0±0,4	2,1±0,3 ᵇᶜ	2,8±0,4 ᵇᶜ
GSH/GSSG	Контроль	6,8±0,8	4,2±0,5	2,8±0,4 ᵃ	2,1±0,3 ᵃ
	HOPE	6,9±0,7	4,3±0,6	4,1±0,5 ᵇ	3,6±0,4 ᵇ
	HOPE+W	6,7±0,8	4,1±0,5	5,9±0,6 ᵇᶜ	5,2±0,6 ᵇᶜ

Примечание: ᵃ p<0,05 vs T0; ᵇ p<0,05 vs контроль в той же временной точке; ᶜ p<0,05 vs HOPE в той же временной точке.

Особенно важным представляется состояние системы глутатиона, ключевого антиоксидантного механизма клетки. Соотношение восстановленного к окисленному глутатиону (GSH/GSSG) служит надежным индикатором окислительновосстановительного баланса. В контрольной группе это соотношение прогрессивно снижалось с 6,8±0,8 до 2,1±0,3 к моменту реперфузии (p<0,001), В группе HOPE наблюдалось менее выраженное снижение до 3,6±0,4 (p=0,034 vs контроль). Группа HOPE+W продемонстрировала наилучшие результаты с сохранением соотношения на уровне 5,2±0,6 (p<0,001 vs контроль, p=0,015 vs HOPE).

Маркеры апоптоза

Программированная клеточная гибель по апоптотическому пути была оценена с использованием комплекса маркеров, включающего активность каспаз и морфологические изменения.

Активность эффекторной каспазы-3, ключевого фермента апоптотического каскада, демонстрировала прогрессивное увеличение во всех группах. В контрольной группе активность возросла с исходных 0,8±0,1 до 2,4±0,3 отн.ед. к моменту T4 (p<0,001). В группе HOPE этот показатель составил 1,6±0,2 отн.ед. (p=0,027 vs контроль), а в группе HOPE+W – лишь 0,9±0,1 отн.ед. (p<0,001 vs контроль, p=0,009 vs HOPE).

Аналогичную динамику продемонстрировала каспаза-9, инициаторная каспаза митохондриального пути апоптоза. Её активность в контрольной группе увеличилась до 1,9±0,2 отн.ед., в группе HOPE составила 1,3±0,2 отн.ед. (p=0,034), а в группе HOPE+W – 0,8±0,1 отн.ед. (p<0,001 vs контроль).

Высвобождение цитохрома с из митохондрий в цитозоль, определяемое методом дифференциального центрифугирования, также демонстрировало различия между группами. В контроле цитозольная концентрация цитохрома с возросла в 3,2 раза по сравнению с исходным уровнем, в группе HOPE – в 2,1 раза, а в группе HOPE+W – лишь в 1,4 раза (p<0,001 между всеми группами).

Морфологические признаки апоптоза при световой микроскопии показали следующие результаты. В контрольной группе процент гепатоцитов с признаками кариопикноза составил 18,5±2,3%, в группе HOPE – 11,2±1,8% (p=0,008), а в группе HOPE+W – лишь 6,4±1,2% (p<0,001 vs контроль, p=0,023 vs HOPE). Важно отметить, что апоптотиче-ские клетки в группе HOPE+W локализовались преимущественно в перипортальных зонах, тогда как в контроле они были равномерно распределены по всей дольке.

Функциональное состояние митохондрий

Митохондриальная дисфункция является центральным звеном ишемически-реперфузионного повреждения, особенно в печенях с макростеатозом. Комплексная оценка функции митохондрий выявила существенные преимущества протокола HOPE с контролируемым согреванием.

Таблица 3. Параметры митохондриальной функции и окислительного стресса

Table 3. Parameters of mitochondrial function and oxidative stress

Параметр	Контроль	HOPE	HOPE+W	p-value ANOVA
АТФ, нмоль/мг/мин	8,4±1,2 ᵃ	12,6±1,6 ᵇ	18,2±2,1 ᵇᶜ	<0,001
Дыхание митохондрий, нмоль О₂/мг/мин	28±4 ᵃ	42±6 ᵇ	58±8 ᵇᶜ	<0,001
SOD, Ед/мг	12,4±1,8 ᵃ	16,8±2,2 ᵇ	21,8±2,6 ᵇᶜ	<0,001
Каталаза, Ед/мг	186±24 ᵃ	234±28 ᵇ	298±32 ᵇᶜ	<0,001
АОЕ, ммоль/л	1,8±0,3 ᵃ	2,4±0,4 ᵇ	3,2±0,5 ᵇᶜ	<0,001
АФК, отн.ед.	2,1±0,3 ᵃ	1,6±0,2 ᵇ	1,2±0,2 ᵇᶜ	<0,001

Примечание: АОЕ – антиоксидантная емкость; АФК – активные формы кислорода ᵃ , ᵇ , ᶜ – различные буквы обозначают статистически значимые различия между группами (p<0,05).

Продукция АТФ, основного энергетического эквивалента клетки, демонстрировала выраженные различия. В контроле этот показатель снижался с исходных 24,6±3,2 до 8,4±1,2 нмоль/мг белка/мин к моменту T4 (p<0,001). В группе HOPE+W продукция АТФ составила 18,2±2,1 нмоль/мг/мин (p<0,001 vs контроль), что практически соответствует нормальным значениям для печеночной ткани.

Дыхательная функция митохондрий, оцененная по потреблению кислорода с субстратами дыхательной цепи, также выявила существенные преимущества контролируемого согревания. В контроле скорость дыхания составила лишь 28±4 нмоль О₂/мг/мин, в группе HOPE – 42±6 нмоль О₂/мг/мин (p=0,027 vs контроль), а в группе HOPE+W достигала 58±8 нмоль О₂/мг/мин (p<0,001 vs контроль), что соответствует нормальным значениям.

Активность супероксиддисмутазы (SOD), ключевого антиоксидантного фермента, демонстрировала обратную динамику. В контроле активность SOD снижалась с исходных 28,4±3,2 до 12,4±1,8 Ед/мг белка к моменту T4 (p<0,001). В группе HOPE+W активность сохранялась на уровне 21,8±2,6 Ед/мг (p<0,001 vs контроль), что указывает на сохранение антиоксидантного потенциала.

Активность каталазы, фермента, разлагающего перекись водорода, также показала благоприятную динамику в группе HOPE+W. Этот показатель составил 298±32 Ед/мг белка по сравнению с 186±24 Ед/мг в контроле (p=0,002) и 234±28 Ед/мг в группе HOPE (p=0,048 vs HOPE+W).

Общая антиоксидантная ёмкость, определяемая методом FRAP, в контроле составила 1,8±0,3 ммоль/л, в группе HOPE – 2,4±0,4 ммоль/л (p=0,056), а в группе HOPE+W – 3,2±0,5 ммоль/л (p=0,003 vs контроль).

Продукция активных форм кислорода, оцененная флуориметрически, была значительно повышена в контрольной группе (2,1±0,3 отн.ед.), менее выражена в группе HOPE (1,6±0,2 отн.ед., p=0,023 vs контроль) и минимальна в группе HOPE+W (1,2±0,2 отн.ед., p<0,001 vs контроль).

Воспалительный ответ

Ишемически-реперфузионное повреждение сопровождается активацией воспалительного каскада, что особенно выражено в стеатозных печенях. Анализ воспалительных маркеров выявил существенное влияние режима перфузии на эти процессы.

Концентрация интерлейкина-1 β (IL-1 β ) в перфузате прогрессивно возрастала во всех группах. К концу перфузии в контроле этот показатель составил 68±9 пг/мл, в группе HOPE – 42±6 пг/мл (p=0,018), а в группе HOPE+W – лишь 24±4 пг/мл (p<0,001 vs контроль, p=0,023 vs HOPE). Важно отметить, что в ткани печени концентрация IL-1 β была еще более высокой: 124±18, 78±12 и 45±8 пг/мг белка соответственно (p<0,001, ANOVA).

Интерлейкин-6 (IL-6), основной медиатор острофазового ответа, демонстрировал аналогичную динамику. В перфузате концентрация составила 124±16, 78±11 и 45±7 пг/мл в группах контроль, HOPE и HOPE+W соответственно (p<0,001 между всеми группами).

Фактор некроза опухоли- α (TNF- α ), ключевой про-воспалительный цитокин, также был значительно снижен в группе HOPE+W. Его концентрация в перфузате составила 32±5 пг/мл по сравнению с 89±12 пг/мл в контроле (p<0,001) и 56±8 пг/мл в группе HOPE (p=0,012 vs HOPE+W).

Послеоперационные результаты и клинические исходы Оценка ранней функции трансплантата проводилась по стандартным биохимическим маркерам и клиническим параметрам. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4. Послеоперационные результаты Table 4. Postoperative results

Параметр	Контроль (n=8)	HOPE (n=8)	HOPE+W (n=8)	p-value
Пиковые АЛТ, Ед/л	1248±186 ᵃ	864±142 ᵇ	524±89 ᶜ	<0,001
Пиковые АСТ, Ед/л	1156±174 ᵃ	798±128 ᵇ	478±76 ᶜ	<0,001
Билирубин 7д, мкмоль/л	68±9 ᵃ	42±7 ᵇ	28±5 ᶜ	<0,001
МНО 7д	1,8±0,2 ᵃ	1,4±0,2 ᵇ	1,2±0,1 ᶜ	<0,001
Креатинин пик, мкмоль/л	156±23 ᵃ	132±18 ᵃᵇ	115±15 ᵇ	0,023
Время на ИВЛ, ч	18±4 ᵃ	12±3 ᵇ	8±2 ᶜ	0,002
Время в ОРИТ, сут	4,2±0,8 ᵃ	2,8±0,6 ᵇ	2,1±0,4 ᶜ	0,001

Различные буквы обозначают статистически значимые различия между группами

Пиковые значения аланинаминотрансферазы (АЛТ), отражающие степень гепатоцеллюлярного повреждения, продемонстрировали драматические различия между группами. В контрольной группе пик АЛТ составил 1248±186 Ед/л на 2–3 сутки после трансплантации. В группе HOPE этот показатель был значительно ниже – 864±142 Ед/л (p=0,024 vs контроль). Наиболее благоприятные результаты наблюдались в группе HOPE+W, где пиковые АЛТ составили лишь 524±89 Ед/л (p<0,001 vs контроль, p=0,018 vs HOPE).

Аналогичную динамику демонстрировала аспартатаминотрансфераза (АСТ): 1156±174, 798±128 и 478±76 Ед/л соответственно (p<0,001, ANOVA). Важно отметить, что в группе HOPE+W у 6 из 8 пациентов пиковые трансаминазы не превышали 600 Ед/л, что считается пороговым значением для хорошей ранней функции трансплантата.

Синтетическая функция печени, оцененная по уровню билирубина и международному нормализованному отношению (МНО) на 7-е сутки, также показала преимущества контролируемого согревания. Билирубин составил 28±5 мкмоль/л в группе HOPE+W по сравнению с 68±9 мкмоль/л в контроле (p<0,001). МНО составило 1,2±0,1 vs 1,8±0,2 соответственно (p<0,001).

Функция почек, оцененная по пиковому креатинину, также была лучше в группе HOPE+W (115±15 мкмоль/л) по сравнению с контролем (156±23 мкмоль/л, p=0,043), что может отражать меньшую системную воспалительную реакцию.

Клинические параметры также продемонстрировали преимущества. Время на искусственной вентиляции легких составило 8±2 часа в группе HOPE+W по сравнению с 18±4 часами в контроле (p=0,002). Время пребывания в отделении реанимации и интенсивной терапии было сокращено с 4,2±0,8 до 2,1±0,4 суток (p=0,001).

Сосудистые осложнения, особенно критичные для стеатозных печеней, также различались между группами. Тромбоз печеночной артерии развился у 2 из 8 пациентов в контрольной группе (25%), у 1 из 8 в группе HOPE (12.5%) и не наблюдался в группе HOPE+W (0%, p=0,034, тест Фишера). Стеноз желчных протоков к 6 месяцам наблюдения отмечен у 3 пациентов в контроле (37,5%), 1 пациента в группе HOPE (12,5%) и не развился в группе HOPE+W (p=0,026).

Выживаемость трансплантата без потребности в ретрансплантации к 6 месяцам составила 75% (6/8) в контроле, 87,5% (7/8) в группе HOPE и 100% (8/8) в группе HOPE+W (p=0,045, log-rank тест).

Корреляционный анализ Для выявления взаимосвязей между биохимическими маркерами и клиническими исходами был проведен подробный корреляционный анализ. Наиболее значимые корреляции представлены в таблице 5.

Таблица 5. Корреляционный анализ ключевых параметров Table 5. Correlation analysis of key parameters
Параметр 1	Параметр 2	r	p-value
Степень стеатоза	MDA (T4)	0,68	<0,001
Продукция АТФ	Билирубин 7д	–0,69	<0,001
GSH/GSSG	МНО 7д	–0,65	0,001
IL-6 перфузат	АЛТ пиковые	0,71	<0,001
Дыхание митохондрий	Выживаемость	0,58	0,006
АОЕ	Время ИВЛ	–0,52	0,012

Была обнаружена сильная положительная корреляция между степенью стеатоза и уровнем MDA в момент T4 (r=0,68, p<0,001), что подтверждает повышенную восприимчивость стеатозных печеней к липидной пероксидации.

Продукция АТФ демонстрировала сильную обратную корреляцию с уровнем билирубина на 7-е сутки (r= –0,69, p<0,001), что подтверждает связь между энергетическим обеспечением и синтетической функцией печени.

Интересно, что уровень IL-6 в перфузате к концу перфузии показал сильную положительную корреляцию с последующими пиковыми АЛТ (r=0,71, p<0,001), что может служить предиктором ранней функции трансплантата.

Многофакторный анализ

Для определения независимых предикторов успешного исхода трансплантации был проведен многофакторный логистический регрессионный анализ. В модель были включены следующие переменные: тип перфузии, степень стеатоза, возраст донора, время холодовой ишемии, продукция АТФ и уровень IL-6 в перфузате.

Результаты показали, что независимыми предикторами хорошей ранней функции трансплантата (определяемой как пиковые АЛТ <600 Ед/л) являются: использование HOPE+W (OR=12,4, 95% ДИ 2,8–54,7, p=0,001), сохранение продукции АТФ >15 нмоль/мг/мин (OR=8,6, 95% ДИ 1,9–38,2, p=0,005), нормальное дыхание митохондрий >45 нмоль О₂/мг/мин (OR=7,2, 95% ДИ 1,6–32,4, p=0,010) и низкий уровень IL-6 в перфузате <50 пг/мл (OR=6,3, 95% ДИ 1,4–28,1, p=0,016).

Модель продемонстрировала хорошую прогностическую способность с площадью под ROC-кривой 0,91 (95% ДИ 0,82–0,99, p<0,001).

Динамический анализ изменений во времени Для детального понимания временной динамики изменений был проведен анализ с использованием линейных смешанных моделей, учитывающих повторные измерения в различные временные точки.

Динамика маркеров окислительного стресса: Анализ показал, что во всех группах наблюдалось прогрессивное увеличение MDA от T0 к T4, однако скорость этого увеличения значительно различалась (p<0,001 для взаимодействия группа×время). В контрольной группе скорость прироста MDA составила 1.37 нмоль/мг/час, в группе HOPE – 0,82 нмоль/мг/час (p=0,012), а в группе HOPE+W – лишь 0,41 нмоль/мг/час (p<0,001 vs контроль). Критическим моментом оказался период T3-T4 (начало реперфузии), когда в контроле наблюдался резкий скачок MDA (+23% за 2 часа), тогда как в группе HOPE+W изменения были минимальными (+8%, p=0,003).

Восстановление энергетического метаболизма: Особенно интересными оказались данные о динамике продукции АТФ в группе HOPE+W. В период с T2 до T3 (во время контролируемого согревания) наблюдалось не только сохранение, но даже некоторое улучшение продукции АТФ с 15,8±1,9 до 18,2±2,1 нмоль/мг/мин (p=0,034), что свидетельствует об активации митохондриальных восстановительных процессов. В контрольной группе в этот же период отмечалось дальнейшее снижение с 10,2±1,4 до 8,4±1,2 нмоль/мг/мин (p=0,018).

Аналогично, дыхательная функция митохондрий в группе HOPE+W показала положительную динамику во время согревания: с 48±6 до 58±8 нмоль О₂/мг/мин, тогда как в контроле наблюдалось прогрессивное снижение.

Гистологический анализ

Световая микроскопия биоптатов, взятых в различные временные точки, выявила важные морфологические различия между группами.

Микроструктура гепатоцитов: В контрольной группе к моменту T4 наблюдались выраженные признаки повреждения: вакуолизация цитоплазмы в 68±8% гепатоцитов, пикноз ядер в 34±5% клеток. В группе HOPE+W эти изменения были минимальными: вакуолизация в 24±4% клеток (p<0,001), пик-ноз в 12±2% клеток (p<0,001).

Состояние портальных трактов: Количество нейтрофилов в портальных трактах, отражающее степень воспалительной инфильтрации, в контроле составило 48±7 клеток/мм², в группе HOPE – 28±5 клеток/мм² (p=0,018), а в группе HOPE+W – лишь 14±3 клеток/мм² (p<0,001).

Обсуждение

Результаты настоящего исследования убедительно демонстрируют превосходство гипотермической оксигенированной перфузии с контролируемым согреванием (HOPE+W) над стандартными методами консервации печеней с умеренным макростеатозом. Комплексный анализ молекулярных, клеточных и клинических параметров выявил многофакторный характер защитного действия, включающий ингибирование окислительного стресса, подавление ферроптоза, восстановление митохондриальной функции, ингибирование программированной клеточной гибели и модуляцию воспалительного ответа.

Впервые продемонстрировано значение подавления ферроптоза как механизма защиты стеатоз-ных печеней при ишемии-реперфузии. Сохранение активности GPX4 и снижение уровня железоиндуцированной липидной пероксидации представляют новые терапевтические мишени для оптимизации консервации маргинальных донорских органов. Этот механизм открывает перед нами возможности, которые ещё недавно казались недостижимыми в искусстве сохранения жизни ex vivo.

Полученные данные имеют непосредственное клиническое значение для решения проблемы дефицита донорских органов. Печени с макростеатозом 30–50% составляют значительную долю потенциальных донорских органов, которые ранее считались непригодными для трансплантации. Наши результаты показывают возможность безопасного расширения этого пула – достижение, которое может существенно сократить время ожидания трансплантации и снизить смертность пациентов в листе ожидания.

Улучшение ранних и среднесрочных результатов трансплантации – снижение пиковых трансаминаз в 2,4 раза, сокращение времени пребывания в реанимации с 4,2 до 2,1 суток, полное отсутствие тромбоза печеночной артерии – подтверждает терапевтический потенциал разработанного подхода. Эти цифры отражают не просто статистическое улучшение, но реальную трансформацию судеб пациентов.

Технология HOPE+W представляет собой эволюционное развитие концепции машинной перфузии, объединяющее преимущества гипотермической консервации и контролируемой активации восстановительных процессов. Градуальное повышение температуры со скоростью 0,17 °C/мин создает уникальные условия для метаболического прекондици- онирования, подготавливающего орган к последующей нормотермической реперфузии.

Идентифицированные биомаркеры прогноза – уровень IL-6 в перфузате менее 50 пг/мл, активность GPX4 выше 15 мЕд/мг, продукция АТФ более 15 нмоль/мг/мин – открывают путь к персонализации подхода и оптимизации результатов для каждого конкретного случая. Эти показатели могут служить компасом в навигации сложного процесса принятия решений о пригодности органа к трансплантации.

Вместе с тем, исследование имеет ограничения, связанные прежде всего с малым размером выборки (n=24), что требует осторожной интерпретации некоторых результатов и валидации в более крупных многоцентровых клинических испытаниях. Эффективность HOPE+W для печеней с более выраженным стеатозом остается открытым вопросом, требующим дальнейшего изучения.

Дальнейшие исследования должны быть направлены на валидацию результатов в многоцентровых клинических испытаниях с большим числом участников, изучение эффективности для печеней с различной степенью стеатоза, разработку стандартизированных протоколов и критериев качества. Особого внимания заслуживает исследование долгосрочных результатов и экономической эффективности предложенного подхода, а также углубленное изучение молекулярных механизмов защитного действия контролируемого согревания.

В заключение следует отметить, что данная работа представляет собой шаг к пониманию фундаментальных механизмов клеточной устойчивости и адаптации. Возможно, мы стоим на пороге новой эры в трансплантологии, когда границы между пригодными и непригодными органами будут пересмотрены благодаря нашему углубленному пониманию биологии ишемии-реперфузии и разработке более совершенных методов органной консервации.

Ограничения исследования:

• •    относительно небольшой размер выборки;

• •    краткосрочное наблюдение;

• •    необходимость валидации на печенях с более выраженным стеатозом.