Механизм иммунобиологической толерантности во время беременности в функциональной системе "мать-плод-новорожденный"

Введение. Иммунобиологический статус новорожденных животных в большей степени зависит от материнского организма. Вместе с тем вопросы иммунологической толерантности между состоянием материнского организма и здоровьем новорожденного животного пока не нашли полного отражения в исследованиях. Почти не изучены аспекты, связанные с характером иммунного реагирования на антигены плода. Сведения о влиянии иммунологических факторов материнского организма на уровень морфофункционального развития плода и жизнеспособность новорожденного ограничены сообщениями о некоторых заболеваниях, обусловленных иммуногенетической несовместимостью. Знание закономерностей развития иммунных процессов, которые зависят от степени сходства и различия между организмом матери и плода по антигенам гистиеовместимости, может способствовать разрешению многих теоретических и практических аспектов проблемы онтогенеза.

Цель исследования: установить и оценить механизмы формирования иммунологической толерантности в системе «мать-плод-новорож-денный», ее специфические свойства под непосредственным влиянием естественных антигенных стимулов.

Задачи исследования:

• 1.    Изучить закономерности формирования иммуноопосредованных процессов функциональной системы «мать-плод-новорожденный» с ранних сроков беременности.

• 2.    Выявить критерии нарушения иммунорегуляции и иммунологической толерантности при беременности.

• 3.    Определить механизмы формирования иммунопатологии у новорожденных животных.

Объекты, материалы и методы исследования. Исследование проводили в производственных условиях свиноводческого комплекса «Штурм» Красногвардейского района Ставропольского края на свиньях крупной белой породы. Объектом исследования выступали свиноматки, выбранные путем случайной выборки в полевых условиях. Для проведения исследова- ния от 20 свиноматок первого опороса были отобраны поросята 90 голов в неонатальный период.

Свиноматок иммунизировали экстрактами сперматозоидов либо плазмой семени. Экстракты ксеногенных сперматозоидов готовили по общепринятой методике и иммунизировали ими крольчих под конъюнктиву глазного века, а полный адъювант вводили внутримышечно [2, 4, 5]. Других животных иммунизировали плазмой семени по той же схеме. Циклы иммунизации состояли из трех ежедневных инъекций по 0,3 мл для экстракта сперматозоидов и по 0,05 мл для плазмы семени (около 4 мг белка). Проводили три цикла иммунизации с интервалами 2 дня для экстрактов сперматозоидов и 3 дня для плазмы семени.

После окончания иммунизации проверяли ее эффективность методом преципитации в агаре [3, 8]. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, соединительную ткань выявляли методами Ван Гизона, Вейгерта, Маллори, согласно рекомендациям, изложенным в руководстве В.В. Семченко с соавт. (2006). Для световой микроскопии брали образцы тимуса, костного мозга (бедра), подколенных лимфоуз- лов, селезенки и печени (у крольчих) на 7–10-й день после иммунизации у небеременных и на 17-22-й день у беременных животных. Для просвечивающей и сканирующей микроскопии образцы тканей фиксировали в 3 %-м растворе глютаральдегида на фосфатном буфере при pH 7,3 с 0,1 М сахарозой в течение 2 ч, промывали фосфатным буфером и фиксировали по Ми-лонигу в течение 1 ч [6, 7]; обезвоживали в эталонах возрастающей крепости до 100°. Окрашенные и промытые в воде срезы обезвоживали в спиртах (70º, 96º), просветляли в ксилоле, а затем исследовали на предметном стекле. Все гистологические и иммуногистохимические исследования препаратов проведены с помощью светового микроскопа OLYMPUS-BX 43 (Япония) и фотоаппарата OLYMPUS С 300 (Япония).

Результаты исследования и их обсуждение. В каждом поле зрения микроскопа даже без подсчета можно отчетливо видеть разницу между иммунологической реактивностью беременных и небеременных особей, судя по числу лимфоцитов, свободных или почти свободных и с налипшими на них частицами; лимфоцитов (розетки) вдвое больше у беременных, чем у интактных особей (табл. 1).

Таблица 1

Свиноматки	S 8 О st □° i	Из них с числом эритроцитов, %
		1-я группа	2-я группа
Беременные	943	25,2±0,14*	65,4+0,15
Небеременные	233	68,1±0,30	30,7+0,22**

*р < 0,05; **p < 0,01.

Пропорция Т-лимфоцитов с различным числом налипшихна них частиц вне организма при беременности

Поведение Т-лимфоцитов по отношению к ксеногенным эритроцитам барана, использованным для данной цели, мы назвали ТЭ-реакцией (тимоцит-эритроцит).

Предположение о влиянии на ТЭ-реакцию изменения свойства Т-лимфоцитов в результате иммунных процессов в организме беременной самки было проверено сравнением реакции Т-лимфоцитов у иммунизированных беременных самок с контролями (неиммунизированные и небеременные).

Сопоставление распределения лимфоцитов по числу прилипших к ним эритроцитов в ТЭ-реакции показало сходство влияния беременности и иммунизации самок живчиками того же самца, от которого получены эмбрионы. Сходство это, во-первых, означает иммуногенность эмбрионов по отношению к материнскому организму, а во-вторых, частичное антигенное сходство отцовских гамет и эмбрионов, обнаружи-мое по их действию на активность рецепторов, распознающих Т-лимфоциты (табл. 2).

Численная характеристика способности Т-лимфоцитов агглютинировать ксеногенные эритроциты барана при беременности и иммунизации

Таблица 2

Самки	1 X CD _Q CD I о 1Cl о Ф co 5 1 s §	s 5 И £1	Из них с числом эритроцитов, %
			1-я группа	2-я группа
Иммунизированные (беременные и небеременные)	5	111	67,03±0,45	30,22±0,43
Беременные неиммунизированные	5	153	78±0,13	18,11±0,31
Неиммунизированные и небеременные	10	158	40,32±0,19*	2,0±0,36

*р < 0,05.

У всех свиноматок с установленной впоследствии беременностью число лимфоцитов с розетками достигло 70 % против 9 % у неосеме-ненных особей. Суть реакции заключается, по-видимому, в активизации большего числа рецепторов тимоцитов под влиянием беременности.

Реакция эта требует определенных условий, так как на нее действуют многие факторы. Привлекать к себе эритроциты могут только метаболически активные лимфоциты с неповрежденной структурой и при соответствующих температурных условиях. Наше мнение, что розетки могут формироваться и независимо от иммунных явлений. Иммунизация повышает число лимфоцитов в периферической крови, способных привлекать на свою поверхность ксеногенные эритроциты, а также увеличивает число бляшкообразующих клеток. Таким образом, по взаимодействию клеток крови можно судить об иммунном состоянии организма. Т-лимфоциты супоросных свиноматок по способности привлекать к себе ксеногенные эритроциты: до 30 % лимфоцитов спонтанно реагируют на эритроциты барана.

Установление высокой иммуногенности поздних бластоцист и ранних эмбрионов у свиноматок натолкнуло на поиски наличия антител к ранним эмбрионам в сыворотке крови беременных самок. Эти антитела могут не повреждать эмбрион, огражденный гематогенитальным барьером, но циркулировать в крови, хотя и в незначительном титре.

Следовательно, при соединении вне организма с частицами, нагруженными эмбриональ- ным антигеном, сыворотка беременных самок вызывает агглютинацию этих частиц.

В наших опытах исследования сывороток крови от 20 свиноматок в сроки 25–30 дней после осеменения показали, что в 98 % образцов сыворотки крови действительно беременных животных (что установлено с помощью УЗИ аппарата через 1 месяц) произошла агглютинация частиц, нагруженных эмбриональными антигенами.

В данном опыте антигеном нагружали отмытые эритроциты барана. Эта реакция предложена нами и названа ЭСЭ (эмбрион-сыворотка-эритроцит). Различие между беременными и небеременными животными в ЭСЭ-реакции хорошо визуализируется. Для реакции использовали пластмассовые пластины с луночками, что облегчало как постановку реакции при малых дозах материала, так и чтение реакции.

По результатам исследований более чем у 90 % особей результат ЭСЭ-реакции совпадает с данными УЗИ исследования. Вместе с тем по образцам, взятым на 16-й день и позднее после осеменения, процент совпадения выше. При анализе результатов иммунологического исследования по тем свиноматкам, которые оказались действительно беременными, по сравнению с животными, у которых беременность не обнаружена, выявлена разница между этими животными (табл. 3).

Несовпадение составляет 10,6 %. Это, по-видимому, связано с ранней пренатальной гибелью в промежутке между иммунологическим и ректальным исследованиями.

ЭСЭ-реакция в разное время после осеменения

Таблица 3

Животные	Сроки исследования, сутки после осеменения	Исследовано свиноматок	Из них дали реакцию положительно	Беременных свиноматок	Совпадение, %
Беременные	До 15–16 и более	80	67	62	92,3
Небеременные	–	14	0	0	100,0

Изучение основных структур лимфомиелоидной системы показало, что беременность, как и иммунизация, способствует значительному увеличению числа малых лимфоцитов в тимусе и местных лимфоузлах при статистически высоко достоверных различиях с контролями (небеременные и неиммунизированные самки). В том же направлении меняется при беременности пропорция лимфоцитов в клеточном пуле костного мозга. Следовательно, беременность направляет, как и нарочитая иммунизация, в определенные периоды лимфомиелоидную систему на увеличение в ней пропорции «распознающих» клеток иммунной системы (табл. 4).

Таблица 4

Самки-крольчихи	Костный мозг		Тимус и лимфоузлы
	Подсчитано клеток	Из них тимоцитов, %	Подсчитано клеток	Из них лимфоцитов, %
Иммунизированные беременные и небеременные	749	88 ±0,12*	1403	77±0,12*
Неиммунизированные: небеременные	740	84± 0,13	1461	77±0,13
Беременные (все)	1337	88 ±0,09**	2403	78±0,18
Небеременные (все)	402	64 + 0,24	933	57±0,16*

Изменение численности малых лимфоцитов в основных органах иммунной системы в связи с иммунизацией и беременностью

*р < 0,05; **p < 0,01.

Статистически достоверное увеличение числа лимфоцитов в клеточном пуле на третьей неделе беременности может быть объяснено снятием при этом угнетения с определенных участков генома, что активизирует определяемый им синтез энзимных и неэнзимных белков.

Установлено, что при изучении ультраструктур клеток лимфомиелоидной системы наблюдается повышение их функциональной активности при беременности и особенно в связи с иммунизацией. Наиболее характерны изменения В-лимфоцитов; у них увеличиваются и удлиняются плазматические выросты по сравнению с контролем. Поверхность Т-лимфоцитов, которая обычно бывает гладкой, также покрывается ворсинками. В цитоплазме лимфоцитов увеличивается число митохондрий, лизосом и других клеточных органелл. Изменяется также поверхность фагоцитирующих клеток по сравнению с контролем.

Для сочетания беременности и иммунизации характерно наличие в тканях лимфомиелоидной системы плазматических и бластных клеток с обилием хорошо выраженных цистерн эргасто-плазматической сети.

Увеличение поверхности Т- и В-лимфоцитов, а также макрофагов и появление удлиненных выростов их цитоплазмы способствует контактам между этими тремя типами клеток в процессе иммунного ответа путем клеточной кооперации. В процессе передачи информации от распознающей клетки (Т-лимфоцит) к макрофагу между ними формируются отчетливо видимые цитоплазматические мостики.

Выводы. Полученные данные открывают перспективы для разработки методов раннего прогнозирования толерантного состояния в пе-

риод беременности и ранний постнатальный период о новорожденных животных, это необходимое звено саморегулирования в процессе нормального эмбриогенеза. Вместе с тем противоречивое равновесие в системе «мать-плод-новорожденный» неустойчиво и может перейти в состояние иммунного конфликта.

Изучение иммунизированных беременных свиноматок показало, что в течение короткого периода преобразования бластоцист в эмбрионы в селезенке появляются спонтанные розетки, а в периферической плазме крови самки увеличивается процент Т-лимфоцитов, способных к розет-кообразованию с весенсибилизированными отмытыми эритроцитами барана либо другими органическими частицами сходного диаметра при статистически высоко достоверных различиях.

Установлено, что темпы и степень совершенствования иммунной системы во многом определяются антигенным воздействием на организм, причем большое значение имеет фактор первой встречи организма с определенными иммунозависимым стимулом.