Механизмы нарушения функции эндотелия и внутренних органов на фоне экспозиции хлоридом кобальта (экспериментальное исследование)

кантом являются предприятия цветной металлургии.

Токсичность высоких концентраций кобальта обусловлена его гипоксическим действием, активацией перекисного окисления липидов (ПОЛ) и истощением антиоксидантной защиты (АОЗ) [1, 2, 7, 8]. Избыточное поступление в организм кобальта индуцирует перекисное окисление липидов и способствует формированию окислительного стресса, сопровождающегося дисфункцией эндотелия, повреждением биологических макромолекул, мембранных структур клеток и ферментов [8, 17]. Принимая на себя действие солей тяжелых цветных металлов, эндотелий становится прямой мишенью для повреждения, и эндотелиальная дисфункция играет патогенетическую роль в повреждении мембран клеток внутренних органов в условиях окислительного стресса. В механизме развития эндотелиальной дисфункции в условиях активации окислительных процессов играет роль снижение продукции оксида азота – основного вазодилатирующего фактора и его биодоступность [2, 6, 8, 14–16]. В нарушении транспорта NO в гладкомышечную клетку сосуда может быть значимо изменение метаболизма холестерина как фактора риска атерогенеза [6].

Исследованиями Peters K. et al. [16] показано, что двухвалентные ионы кобальта (Co2+) индуцируют экспрессию генов, реагирующих с гипоксией. В силу этого соединения кобальта используются даже для имитации гипоксии [11]. В свою очередь дисбаланс в оксидантно-антиоксидантной системе является существенным фактором риска развития патологии легочных структур, к примеру, бронхолегочной дисплазии [2].

Высокие дозы кобальта, попадающие в организм через дыхательные пути на вредных производствах, приводят к повышению содержания в крови холестерина, бета-липопротеидов, общих липидов и снижению лецитин-холестеринового коэффициента [17].

Вместе с тем в литературе весьма недостаточно представлены данные о влиянии окислительных процессов на метаболизм оксида азота как фактора риска развития сосудистых осложнений на фоне кобальтовой интоксикации, патогенетическим звеном которых становится нарушение функции эндотелия. В механизмах развития дисфункции эндотелия несомненную роль играет изменение метаболизма оксида азота – важного вазодилатирующего фактора. Изучение причинно-следственных связей акти- вации окислительных процессов метаболизма оксида азота при сосудистых осложнениях и разработке способов патогенетической коррекции – актуальная научная задача.

Учитывая вышеизложенное, цель исследования определяли как изучение влияния хлорида кобальта на биохимические показатели дисфункции эндотелия у крыс в эксперименте с кобальтовой интоксикацией.

Материалы и методы. Исследования проводились на 275 крысах-самцах линии «Вис-тар» одной возрастной группы (10–14 мес.), массой 175–220 г. Подопытные крысы были разбиты на 10 групп по 15–20 голов. Содержание животных и проведение экспериментов осуществляли в полном соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Минобразования СССР, 1984), а также принципами Хельсинкской декларации (2000) и международными рекомендациями (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (Совет международных научных организаций, 1985) В контрольную группу 1 входили интактные животные (n = 22), по возрасту и массе сопоставимые с основной группой, 55 голов составляли резервную группу. Кобальтовую интоксикацию у крыс опытных групп моделировали введением хлорида кобальта в дозе 6 мг/кг массы животного (исходя из DL50). Данная доза была оптимальной (подбирали по степени убывания), так как не влекла за собой гибели животного и в то же время вызывала соответствующие изменения со стороны изучаемых процессов. Развитие токсических влияний прослеживали в течение 30 дней. Во время эксперимента крысы находились на стандартном пищевом рационе и имели свободный доступ к питьевой воде, световой режим – естественный.

В эксперименте исследовались следующие показатели: интенсивность ПОЛ в мембранах эритроцитов по данным изменения концентрации малонового диальдегида (МДА) колориметрическим методом с тиобарбитуровой кислотой [1]; состояние антиокислительной системы (АОС) оценивали по активности каталазы [4] и супероксиддисмутазы (СОД) по методу аутоокисления адреналина, концентрацию церулоплазмина (ЦП) в сыворотке крови – по методу Равина [3]. О нарушении обмена холестерина судили по концентрации общего холестерина (ОХС) в сыворотке крови и его содержа- нии в липопротеидах низкой плотности (ЛНП) и липопротеидах высокой плотности (ЛВП). Концентрацию суммарных метаболитов NOХ определяли по реакции диазотирования Грисса [2].

Результаты и их обсуждение. У экспериментальных крыс на фоне длительной кобальтовой интоксикации, вызванной парентеральным введением хлорида кобальта, развиваются системные окислительные процессы. Зарегистрировано повышение концентрации МДА не только в эритроцитах, но и в гомогенатах почечной ткани: в корковом слое – на 212 %, в мозговом слое – на 92 % (при р <0,001); печеночной ткани – на 48,3 % и миокардиальной ткани – на 52,1 % (при р <0,001). Изучение корреляционных взаимосвязей между содержанием кобальта в плазме крови и активностью ПОЛ в эритроцитах выявило прямую корреляцию между этими показателями при затравке хлоридом кобальта в течение месяца. Анализ активности ферментов АОС показал достоверное ( р <0,001) снижение активности СОД в сыворотке крови и эритроцитах (на 27,7 %), повышение активности каталазы (на 64,1 %) и концентрации церулоплазмина (на 11,9 %), что следует рассматривать как возможное проявление клеточной компенсаторной реакции.

При интоксикации хлоридом кобальта у крыс на фоне активации окислительных процессов выявлено снижение концентрации суммарных метаболитов NO на 19,7 % ( р <0,001) и повышение при этом концентрации МДА – продукта ПОЛ – на 10,9 % (рис. 1). Для подтверждения роли этих химических факторов проведен корреляционный анализ, который показал наличие отрицательной сильной связи между повышением МДА в крови и снижением концентрации суммарных метаболитов NO ( r = –0,72).

В цепи механизмов, ведущих к развитию дефицита NO и дисфункции эндотелия, ключевым звеном является концентрация L-аргинина [10]. Для выяснения роли доступности субстрата L-аргинина для фермента NO-синтазы в специальной серии экспериментов вводили ежедневно в течение 4 недель крысам с кобальтовой интоксикацией L-аргинин в дозе 10 мг/кг веса тела. По окончании эксперимента определяли в сыворотке крови концентрацию оксида азота и показатели активации окислительных процессов. Полученные результаты продемонстрировали повышение концентрации NO в крови на фоне введения L-аргинина крысам с длительной интоксикацией сравнительно с данными,

1 – контроль; 2 – N+L-аргинин;

3 – Со; 4 – Со+L-аргинин

1 – контроль; 2 – N+L-NAME;

3 – Co; 4 – Co+L-NAME

б

а

Рис. 1. Изменения концентрации МДА и суммарных метаболитов NO на фоне донора NO-L-аргинина ( а ) и ингибитора eNOS – L-NAME при кобальтовой интоксикации ( б )

полученными только при кобальтовой интоксикации ( р <0,001). Введение L-аргинина крысам с длительной интоксикацией хлоридом кобальта вызвало уменьшение степени выраженности дисбаланса в системе «свободнорадикальное окисление (СРО) – АОЗ» и одновременно статистически достоверное повышение концентрации суммарных метаболитов NO в сыворотке крови. Введение же интактными затравленным крысам ингибитора еNOS–L-NAME показало, что содержание метаболитов ПОЛ возрастает, одновременно снижается концентрация суммарных метаболитов NO.

Выявленная активация СРО при введении интактным и особенно затравленным животным ингибитора еNOS – L-NAME может быть обусловлена так называемым «разобщением» ре-дуктазного и оксидазного доменов еNOS, когда фермент вместо NO продуцирует активные формы кислорода (АФК). Следовательно, в сыво- ротке крови концентрация NO может определяться содержанием субстрата синтеза L-аргинина, экспрессией эндотелиальной NO-синтазы, уровнем эндогенного ингибитора экспрессии еNOS и нарушением биодоступности NO.

Еще одним важным процессом, в определенной степени детерминирующим эффективность образования NO, является влияние окисленных ЛНП и лизофосфатидилхолина (продукта реакции, катализируемого фосфолипазой и ассоциированной с ЛНП) на транспорт L-аргинина в эндотелиальную клетку (ЭК) (рис. 2–4).

Анализ данных показал статистически достоверное повышение концентрации ОХС на 105,8 % ( р <0,001) в сыворотке крови у крыс с кобальтовой интоксикацией. Анализ распределения ХС в липопротеинах различной плотности показал снижение его уровня в ЛВП на 25,3 % и повышение в ЛНП на 186,3 %, т.е. в атерогенных ЛП-комплексах.

a                                                б

Рис. 2. Изменение концентрации общего холестерина на фоне донора NO-L-аргинина ( а ) и ингибитора eNOS – L-NAME ( б ) при кобальтовой интоксикации (N – контроль)

a                                                б

Рис. 3. Изменение концентрации липопротеидов высокой плотности на фоне донора NO-L-аргинина ( а ) и ингибитора eNOS – L-NAME ( б ) при кобальтовой интоксикации (N – контроль)

а

Рис. 4. Изменение концентрации липопротеидов низкой плотности на фоне донора NO-L-аргинина ( а ) и ингибитора eNOS – L-NAME ( б ) при кобальтовой интоксикации (N – контроль)

б

В стадии длительного воздействия хлоридом кобальта происходит гиперхолестеринемия и гипер-β-липопротеинемия, а это вследствие атерогенеза способствует повреждению эндотелия сосудов. Следует предположить, что в условиях повышенного содержания в крови реактивных форм кислорода, особенно радикала гидроксила ОН ^- - как наиболее реакционноспособного и вторичного продукта ПОЛ–МДА, происходит окислительная модификация ЛНП, включая пе-реокисление липидов и образование конъюгированных диенов, углеродная модификация (apо) β, а также энзиматическое превращение фосфолипазой фосфатидилхолина в лизофосфатидил-холин. Измененные, окисленные ЛНП (оЛНП) нарушают транспорт L-аргинина из сыворотки крови в ЭК, имеется и дефицит L-аргинина, субстрата синтеза NO, в результате снижается образование оксида азота и его биодоступность.

Исследовали показатели ПОЛ, активность мембранного фермента – Na,K-АТФ-азы, а также активность органоспецифических ферментов: АлАТ, АсАТ, ГГТП и экскреторного фермента – щелочной фосфатазы у крыс в длительной стадии кобальтовой интоксикации.

Полученные данные показали снижение активности Na,K-АТФ-азы в обоих слоях почечной ткани ( р <0,001), а также в печеночной и миокардиальной тканях. О повреждении кардиомиоцитов свидетельствует увеличение концентрации МДА в них, снижение активности Na,K-АТФ-азы, а также повышение в сыворотке крови АсАТ, являющейся наиболее органоспецифической для миокарда.

Токсические эффекты реализуются путем развития и прогрессирования эндотелиальной дисфункции и нарушением висцеральных органов: почек, печени, миокарда. Кобальтовая интоксикация вызывает, помимо функциональных изменений, нарушения морфологической структуры эндотелия сосудов и клеток внутренних органов. Полученные результаты были подтверждены гистологическими данными почечной, печеночной, миокардиальной тканей и эндотелия сосудов микроциркуляторного русла (рис. 5).

На срезах тканей внутренних органов у крыс с кобальтовой интоксикацией на фоне L-аргинина отмечались: частичная фрагментация кардиомиоцитов; умеренная паренхиматозно-белковая дистрофия и частичное исчезновение гликогена в гепатоцитах; умеренная гиалиновокапельная дистрофия канальцев и расширение мочевых пространств; умеренное утолщение сосудов микроциркуляторного русла.

На срезах тканей крыс с кобальтовой интоксикацией на фоне L-NAME (на рис. 5 фотографии справа) изменения более выражены. Отмечается: фрагментация и распад кардиомиоцитов, исчезновение поперечной исчерченности в большинстве кардиомиоцитов; расширение мочевых пространств, полнокровие клубочков, выраженная гиалиново-капельная дистрофия мочевых канальцев; выраженная паренхиматозно-белковая дистрофия печеночной ткани, умеренная жировая дистрофия (капли в виде прозрачных включений); умеренное утолщение эндотелия сосудистой стенки, неравномерность (шероховатость) сосудистой стенки.

Для коррекции выявленных нарушений, мы использовали коэнзим Q 10 и его комбинацию с L-аргинином и L-NAME. Исследование влияния коэнзима Q 10 и его комбинации с L-аргинином на состояние ПОЛ выявили существенное угнетение ПОЛ – статистически достоверное снижение концентрации МДА ( р <0,001) в крови на фоне коэнзима Q₁₀ и его комбинации с L-аргинином. В другом варианте исследований на фоне L-NAME – ингибитора фермента

а

б

в

Рис. 5. Изменения морфологической структуры тканей внутренних органов и эндотелия сосудов микроциркуляторного русла у крыс с кобальтовой интоксикацией на фоне L-аргинина (слева) и на фоне ингибитора eNOS - L-NAME (справа) (окраска - гематоксилином и эозином, ув. х 400): а – миокардиальная ткань; б – печеночная ткань; в – почечная ткань; г – эндотелий сосудов микроциркуляторного русла

г

еNOS, эндогенный антиоксидант вызвал менее значимое угнетение интенсивности ПОЛ и снижение концентрации МДА в эритроцитах. При сравнительном анализе результатов ингибирования ПОЛ наиболее эффективным является коэнзим Q10 и его комплекс с L-аргинином.

Выводы. На фоне длительной индуцированной кобальтовой интоксикации активируются окислительные процессы. Повышается концентрация МДА в эритроцитах, в печеночной и миокардиальной тканях, гомогенатах коркового и мозгового вещества почек. В антиокисли-тельной системе отмечается дисбаланс, характеризующийся снижением активности суперокси-ддисмутазы в эритроцитах и компенсаторным повышением активности каталазы и концентра- ции церулоплазмина в сыворотке крови. Активация окислительных процессов сопровождается снижением концентрации суммарных метаболитов NO вследствие дефицита субстрата синтеза L-аргинина и повышения в крови ингибитора экспрессии eNOS-АДМА, установленные исследованиями на фоне введения аналога эндогенного ингибитора L-NAME.

Отмечается снижение активности Na,K-АТФ-азы в гомогенатах почечной, печеночной и миокардиальной тканях, а также повышение активности в сыворотке крови следующих ферментов: трансаминаз – АлАт, АсАт, а также ГГТП и щелочной фосфатазы, что свидетельствует о нарушении гидрофобности цитоплазматических мембран клеток и повышении их проницаемости.